焦艷娜 余 冰,2 李自梅 曾亭軒 陳 香 敬杰瀅 蘇澤鑫 蔡景義,2 田 剛,2*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，成都 611130；2.動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都 611130)

由于兔肉的營養(yǎng)價值高，市場需求量大，使得家兔養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，而在家兔集約化養(yǎng)殖過程中，其發(fā)病率大大增加[1]。家兔斷奶前后經(jīng)常發(fā)生腸道疾病，同時，外界各種不利因素引起的刺激也會使家兔機體處于緊張狀態(tài)，引起機體內(nèi)部代謝功能紊亂，導(dǎo)致家兔出現(xiàn)腹瀉、采食量降低、死亡率升高等癥狀，給家兔養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[2-3]。蘇氨酸(Thr)作為畜禽的第二或第三限制性氨基酸，在機體中發(fā)揮著多種生物學(xué)功能，Thr可平衡氨基酸，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率[4-5]，通過參與免疫球蛋白的合成來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[6]，進而改善動物的生產(chǎn)性能[7]。Thr還具有改善腸道形態(tài)，調(diào)節(jié)黏蛋白合成，維持腸道屏障等功能[8-9]，在預(yù)防動物腸道疾病和維護腸道健康方面有重要作用，在養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。Thr作為家兔的必需氨基酸，在家兔生長和生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。飼糧中Thr水平過高或者過低都會抑制家兔的生長[10]。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)會引起機體免疫應(yīng)激，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，破壞腸道的屏障功能，干擾營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和吸收，最終導(dǎo)致生長性能下降[11]。在多種動物的研究中表明，飼糧添加Thr可緩解應(yīng)激和攻毒對機體的影響，從而改善生長性能[6,8,12]。但Thr能否緩解LPS應(yīng)激對肉兔生長性能和血清生化指標(biāo)的影響還未見報道。因此，為了在家兔生產(chǎn)過程中更合理地應(yīng)用Thr，本試驗選用新西蘭白兔為研究對象，考察在正常飼養(yǎng)和LPS應(yīng)激條件下，飼糧添加表觀可消化蘇氨酸(AFDT)對肉兔生長性能、健康狀況、血清生化指標(biāo)和游離氨基酸含量的影響，為飼糧中添加適宜水平的Thr來緩解肉兔免疫應(yīng)激、提高生長性能和調(diào)節(jié)機體代謝提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Thr為飼料級，純度≥98.5%；LPS(大腸桿菌血清型O127∶B8)使用前用無菌生理鹽水配制成濃度為100 μg/mL的LPS稀釋液。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用2×3雙因素設(shè)計(表1)，選用35日齡斷奶的健康新西蘭白兔180只，體重為(808.11±12.17) g。按照體重相近原則，隨機分為6組，每組30個重復(fù)，每個重復(fù)1只兔。其中3個組于試驗第17和20天空腹稱重后，腹腔注射100 μg/kg LPS稀釋液(即LPS應(yīng)激處理)，其余3個組于同一時間注射等量的無菌生理鹽水(即正常飼養(yǎng))。正常飼養(yǎng)組和LPS應(yīng)激組各自飼喂AFDT水平分別為0.43%、0.54%和0.64%的飼糧。試驗期共35 d，試驗第22天進行心臟采血取樣。

表1 試驗設(shè)計Table 1 Experimental design

1.3 試驗飼糧

飼糧參照De Blas等[13]推薦的生長肉兔營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)進行配制。3組飼糧AFDT水平分別為0.43%、0.54%和0.65%，分別對應(yīng)《Nutrition of the Rabbit》(第3版)推薦量的100%、125%和150%，其AFDT的實測值分別為0.43%、0.54%和0.64%。通過調(diào)節(jié)飼糧中玉米和丙氨酸含量，達到試驗飼糧的等能等氮處理。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。飼糧中消化能及可消化氨基酸水平由消化試驗測定所得，采用酸不溶灰分作為內(nèi)源指示劑進行營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率測定[14]。

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地兔舍進行。在試驗前對兔舍和所用籠具進行徹底的沖洗和熏蒸消毒。每天09:00和18:00進行飼喂，自由采食和飲水。每天08:00稱算前1天的余料量和損料量，每天19:00飼喂后稱算給料量。每天清糞2次，保持兔舍清潔衛(wèi)生。兔舍溫度控制在(20±1) ℃，相對濕度保持在55%～60%，自然通風(fēng)和光照。

1.5 樣品的采集

試驗的第22天對試驗兔空腹稱重后，從各組中隨機選取6只接近平均體重的試驗兔，心臟采血約10 mL，注入不含抗凝劑的采血管中，室溫靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標(biāo)的測定及方法

1.6.1 生長性能的測定

試驗期間每天以重復(fù)為單位，準(zhǔn)確稱重并記錄試驗兔的給料量、余料量和損料量。在試驗的第1、17、22天和第36天進行空腹稱重，以重復(fù)為單位計算各組試驗兔不同階段的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)。參照Gidenne[15]的方法計算患病或死亡試驗兔的采食量。

ADG=(試驗兔末體重-試驗兔初體重)/試驗天數(shù)；ADFI=試驗兔總采食量/試驗天數(shù)；FCR=總采食量/(試驗兔末體重-試驗兔初體重)。

1.6.2 健康狀況的測定

每天以重復(fù)為單位，仔細觀察試驗兔的健康狀況(包括腹瀉、便秘和精神狀態(tài)等臨床癥狀)，對試驗兔的發(fā)病數(shù)量和死亡數(shù)量做記錄。參照Gidenne等[16]的方法計算發(fā)病率、死亡率和健康風(fēng)險指數(shù)(其中，同一重復(fù)試驗兔，發(fā)病次數(shù)和死亡次數(shù)只統(tǒng)計1次)。相關(guān)計算公式如下：

發(fā)病率(%)=100×試驗期發(fā)病動物數(shù)量/試驗動物總數(shù)量；死亡率(%)=100×試驗期死亡動物數(shù)量/試驗動物總數(shù)量；健康風(fēng)險指數(shù)(%)=100×(試驗期發(fā)病動物數(shù)量+試驗期死亡動物數(shù)量)/試驗動物數(shù)量。

1.6.3 血清生化指標(biāo)和游離氨基酸含量的測定

采用全自動生化分析儀3100，測定試驗兔血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量及堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性；利用氨基酸分析儀LA8080測定血清游離氨基酸含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013初步處理，使用統(tǒng)計軟件SAS 9.2對試驗第1～17天試驗兔的生長性能數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及Duncan氏法多重比較，并對其發(fā)病率、死亡率和健康風(fēng)險指數(shù)采用χ2檢驗分析。使用統(tǒng)計軟件SAS 9.2的GLM對數(shù)據(jù)(除試驗第1～17天試驗兔的生長性能和健康狀況數(shù)據(jù)外)進行雙因素方差分析。以飼糧AFDT水平和LPS應(yīng)激為主效應(yīng)，飼糧AFDT水平×LPS應(yīng)激為交互效應(yīng)。在交互效應(yīng)顯著時，用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果用平均值及均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05≤P<0.10表示有顯著趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 AFDT對LPS應(yīng)激肉兔生長性能的影響

由表3可知，添加不同水平的AFDT對試驗第1～17天肉兔的ADG和FCR無顯著影響(P>0.05)。與0.43% AFDT和0.54% AFDT組相比，0.64% AFDT組有增加試驗第1～17天肉兔ADFI的趨勢(P=0.06)。

表3 飼糧添加不同水平AFDT對肉兔試驗第1～17天生長性能的影響Table 3 Effects of different levels of dietary AFDT on growth performance of meat rabbits on days1 to 17 of test (n=60)

由表4可知，LPS應(yīng)激顯著降低了試驗第17～22天和第1～35天肉兔ADG和ADFI(P<0.05)，顯著增加試驗第17～22天和第1～35天的FCR(P<0.05)。與0.43% AFDT組相比，0.64% AFDT組試驗第17～22天、第23～35天和第1～35天肉兔的ADG以及第23～35天和第1～35天的ADFI顯著增加(P<0.05)，試驗第17～22天的FCR顯著降低(P<0.05)。飼糧AFDT水平與LPS應(yīng)激對肉兔ADG、ADFI和FCR均無顯著交互作用(P>0.05)。但無論LPS應(yīng)激與否，0.54% AFDT和0.64% AFDT組肉兔的生長性能效果均優(yōu)于0.43% AFDT組。

表4 LPS應(yīng)激和飼糧不同AFDT水平對肉兔生長性能的影響Table 4 Effects of LPS challenge and different levels of dietary AFDT on growth performance of meat rabbits

2.2 AFDT對LPS應(yīng)激肉兔健康狀況的影響

由表5可知，與0.43% AFDT和0.54% AFDT組相比，0.64% AFDT組有降低試驗第1～17天肉兔發(fā)病率(P=0.08)和健康風(fēng)險指數(shù)(P=0.08)的趨勢。

表5 飼糧添加不同水平AFDT對肉兔試驗1～17天健康狀況的影響Table 5 Effects of different levels of dietary AFDT on health status of meat rabbits on days 1 to 17 of test (n=60) %

由表6可知，LPS應(yīng)激有增加試驗第17～22天肉兔死亡率(P=0.05)和健康風(fēng)險指數(shù)(P=0.09)的趨勢；飼糧添加AFDT對肉兔的健康狀況無顯著影響(P>0.05)。飼糧AFDT水平與LPS應(yīng)激交互作用對肉兔的發(fā)病率、死亡率和健康風(fēng)險指數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

表6 LPS應(yīng)激和飼糧不同水平AFDT對肉兔健康狀況的影響Table 6 Effects of LPS challenge and different levels of dietary AFDT on health status of meat rabbits %

2.3 AFDT對LPS應(yīng)激肉兔血清生化指標(biāo)的影響

由表7可知，LPS應(yīng)激顯著降低了肉兔血清ALT和ALP活性及ALB含量(P<0.05)，顯著增加了血清TC和LDL含量(P<0.05)，有增加血清GLB(P=0.09)和GLU(P=0.09)含量的趨勢。與0.43% AFDT組和0.64% AFDT組相比，0.54% AFDT組血清HDL含量顯著降低了(P<0.05)。與0.54% AFDT組相比，0.64% AFDT組血清GLB含量顯著增加(P<0.05)，有增加血清TP(P=0.05)含量的趨勢(P=0.05)。飼糧AFDT水平與LPS應(yīng)激對肉兔的血清生化指標(biāo)無顯著交互作用(P>0.05)。

表7 LPS應(yīng)激和飼糧不同水平AFDT對肉兔血清生化指標(biāo)的影響Table 7 Effects of LPS challenge and different levels of dietary AFDT on serum biochemical indices of meat rabbits (n=4)

2.4 AFDT對LPS應(yīng)激肉兔血清游離氨基酸含量的影響

由表8和表9可知，LPS應(yīng)激可顯著增加肉兔血清中游離Thr、苯丙氨酸(Phe)和精氨酸(Arg)的含量(P<0.05)，有增加血清中游離纈氨酸(Val)(P=0.06)和半胱氨酸(Cys)(P=0.07)含量的趨勢。與0.43% AFDT組和0.64% AFDT組相比，0.54% AFDT組有增加血清游離丙氨酸(Ala)含量的趨勢(P=0.05)。與0.43% AFDT組和0.54% AFDT組相比，0.64% AFDT組有增加血清游離Cys含量的趨勢(P=0.07)。飼糧AFDT水平與LPS應(yīng)激對肉兔的血清游離氨基酸含量無顯著交互作用(P>0.05)。

表8 LPS應(yīng)激和飼糧不同水平AFDT對肉兔血清游離必需氨基酸含量的影響Table 8 Effects of LPS challenge and different levels of dietary AFDT on serum free essential amino acids contents of meat rabbits (n=4) ng/mL

表9 LPS應(yīng)激和飼糧不同水平AFDT對肉兔血清游離非必需氨基酸含量的影響Table 9 Effects of LPS challenge and different levels of dietary AFDT on serum free non-essential amino acids contents of meat rabbits (n=4) ng/mL

3 討 論

3.1 AFDT對LPS應(yīng)激肉兔生長性能和健康狀況的影響

LPS應(yīng)激模型是動物營養(yǎng)學(xué)中常見的誘導(dǎo)動物免疫應(yīng)激模型。研究表明，LPS應(yīng)激會使機體在生理和行為上出現(xiàn)典型的厭食、嗜睡、腹瀉、發(fā)熱和精神倦怠等特征，降低采食量，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，損害腸道結(jié)構(gòu)與功能，影響營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和吸收，從而導(dǎo)致動物的生長性能下降，發(fā)病率和死亡率增加[17-18]。因此，本試驗參照前人研究結(jié)果，以斷奶肉兔為研究對象，按體重腹腔注射100 μg/kg LPS建立免疫應(yīng)激模型[19]，通過觀察發(fā)現(xiàn)，注射LPS后肉兔出現(xiàn)體溫升高、嗜睡、厭食并伴有腹部震顫等癥狀；通過分析發(fā)現(xiàn)，肉兔生長性能顯著降低，死亡率和健康風(fēng)險指數(shù)較生理鹽水組均有升高的趨勢，由此可見，本試驗LPS應(yīng)激模型建立成功。前人研究結(jié)果表明，在飼糧中添加適宜水平的Thr可提高家兔的生長性能[20-22]。同時，在其他動物上的研究指出，飼糧額外添加Thr在一定程度上可促進動物機體的生長發(fā)育[23-24]。飼喂雜交兔較低水平的Thr飼糧在一定程度上增加了其死亡率[25]。這與本試驗結(jié)果相似，在試驗前期，0.64% AFDT組肉兔的ADFI增加了，有降低發(fā)病率和健康風(fēng)險指數(shù)的趨勢，在一定程度上維護了肉兔機體的健康狀況。且本試驗中0.64% AFDT組提高了LPS應(yīng)激期間、應(yīng)激后期和整個試驗周期的肉兔生長性能。Chen等[12]在基礎(chǔ)飼糧中添加0.30%的Thr可顯著緩解LPS應(yīng)激對肉雞的生長性能的影響。Bi等[26]研究表明，在免疫應(yīng)激條件下，飼糧Thr水平的變化對斷奶至21日齡北京肉鴨的生長性能無顯著的緩解作用，但飼糧Thr水平從0.49%提高到0.56%時可以提高其體增重。

Wellington等[27]在飼糧中額外添加0.13% Thr可以緩解鼠傷寒沙門氏菌對仔豬生長性能降低的影響。在本試驗中，飼糧AFDT水平對LPS應(yīng)激后肉兔的生長性能沒有顯著的改善作用，但與未LPS應(yīng)激的0.43% AFDT組相比，0.43% AFDT、0.54% AFDT和0.64% AFDT的LPS應(yīng)激組在試驗第17～22天ADG分別降低了39.62%、33.53%和23.99%，試驗第23～35天ADG分別降低了5.75%，增加了0.39%和12.02%。這表明飼糧添加AFDT對LPS應(yīng)激導(dǎo)致肉兔的生長性能下降在數(shù)值上有明顯的緩解作用，其中以0.64% AFDT組的緩解和恢復(fù)效果最佳。其可能原因是在應(yīng)激條件下，機體免疫應(yīng)答增強，體內(nèi)的氨基酸重新分配，需要攝取更多的Thr來合成免疫球蛋白，同時Thr參與腸道健康的調(diào)節(jié)，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，緩解了LPS應(yīng)激引起的肉兔生長性能下降。

3.2 AFDT對LPS應(yīng)激肉兔血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可在一定程度上反映動物機體的代謝狀況和組織器官的病理變化。TP和ALB含量越高，反映體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝越旺盛，有利于蛋白質(zhì)和氨基酸的吸收，從而提高動物的生長性能；GLB是反映機體免疫能力的重要指標(biāo)，其含量升高是機體免疫力提高的表現(xiàn)[28]。血清中的ALB、GLB、AST和ALT等是應(yīng)激的重要指標(biāo)，在應(yīng)激狀態(tài)下會導(dǎo)致其在血清中的含量或活性發(fā)生改變[3]。此外，ALP參與機體的消化過程，其血清活性的降低與腸道炎癥有關(guān)[29]。本試驗中，LPS應(yīng)激顯著降低了肉兔血清ALT、ALP活性和ALB含量，增加血清LDL和TC含量。這可能是LPS在一定程度上損害了肉兔腸道健康，影響脂質(zhì)代謝，激發(fā)了機體的免疫機能，誘導(dǎo)肉兔體內(nèi)應(yīng)激蛋白的合成[28-29]。應(yīng)激狀態(tài)下細胞膜受損，會使血清中ALT和AST的活性升高[30]。而在本試驗中，血清ALT活性降低，可能原因是由于機體的代償反應(yīng)造成。Min等[31]發(fā)現(xiàn)，42日齡肉雞血清中的TP和GLB含量隨飼糧Thr水平的增加而升高，并在Thr水平為NRC(1994)推薦量的125%時達到最高值。本試驗中，與0.54% AFDT組相比，0.64% AFDT組肉兔血清TP和GLB含量顯著增加，表明飼糧更高水平的AFDT可能有利于肉兔對蛋白質(zhì)和氨基酸代謝，在一定程度上促進抗體合成，發(fā)揮機體免疫功能。Thr參與脂質(zhì)的代謝和沉積，飼糧添加Thr對機體脂質(zhì)代謝有正向調(diào)節(jié)作用[32]。張艷蕾[20]研究表明，飼糧Thr水平變化對斷奶至2月齡肉兔血清TC、TG和LDL含量無顯著影響。崔斌[21]研究指出，飼糧Thr水平變化對生長獺兔血清TG和LDL含量無顯著影響，而高水平的Thr顯著降低了妊娠母兔的血清TG含量。本試驗中，飼糧添加AFDT并不能有效改善肉兔脂質(zhì)代謝，其可能原因是動物的種屬、所處階段以及生理狀態(tài)不同所造成。

3.3 飼糧添加AFDT對肉兔血清游離氨基酸含量的影響

血清游離氨基酸可作為評判飼糧蛋白質(zhì)和氨基酸是否平衡的重要指標(biāo)。應(yīng)激和采食行為均可使機體的蛋白質(zhì)降解，從而導(dǎo)致血清中的游離氨基酸含量增加，而體內(nèi)的蛋白質(zhì)和氨基酸代謝處于動態(tài)平衡中，最終趨向于降低血清氨基酸含量[33-34]。本試驗LPS應(yīng)激導(dǎo)致家兔血清中游離Thr、Phe和Arg含量顯著增多，Cys含量有增多的趨勢?？赡苁荓PS應(yīng)激導(dǎo)致肉兔血清中游離氨基酸含量發(fā)生改變，影響機體氨基酸代謝。Abe等[35]通過設(shè)置飼糧中蛋氨酸(Met)和Thr不同的比例飼喂荷蘭幼兔和荷蘭成年兔發(fā)現(xiàn)，其比例的變化顯著影響血漿Met和Thr含量，同時血漿中其他氨基酸含量也受到了影響。研究表明，給小鼠飼喂高劑量的Thr，血清中游離Thr含量可增高5～47倍[34]。Azzam等[4]在高溫高濕條件下，配制Thr水平分別為0.47%、0.57%、0.67%、0.77%和0.87%的5種飼糧飼喂40周齡蛋雞8周后發(fā)現(xiàn)，蛋雞血清中游離的Thr含量隨飼糧Thr水平的增加呈二次曲線變化，對血清中其他游離氨基酸的含量并沒有顯著影響。Mao等[36]研究表明，在偽狂犬攻毒條件下，仔豬血清中游離的Thr含量隨飼糧Thr水平的增加而增加，同時可緩解偽狂犬病毒刺激引起的仔豬血清Val和亮氨酸(Leu)含量的增加。本試驗中，飼糧添加AFDT對血清游離Thr含量影響不顯著，但在數(shù)值上均有明顯提高，在一定程度上表明本試驗AFDT添加成功，血清中游離的Thr含量的增加可為機體提供合成免疫球蛋白的原料，在一定程度上增加了肉兔的免疫功能。目前結(jié)果表明，飼糧添加AFDT并沒有顯著影響血清其他游離氨基酸含量，可能是肉兔體內(nèi)氨基酸利用率較高，體內(nèi)氨基酸平衡且代謝良好[37]。

4 結(jié) 論

在本試驗中，LPS應(yīng)激導(dǎo)致肉兔機體代謝紊亂，血清生化指標(biāo)和血清游離氨基酸含量發(fā)生變化，生長性能下降。飼糧AFDT水平為0.64%時可促進生長肉兔體內(nèi)氨基酸平衡、改善健康狀況、提高機體的免疫功能和生長性能。飼糧AFDT水平的增加并不能顯著緩解LPS應(yīng)激對肉兔生長性能造成的影響，但在數(shù)值上均有所改善，且以0.64% AFDT的緩解和恢復(fù)效果最佳。