安彥昊 馬 貴 孫奕爍 馬燕芬,2*

(1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，動物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特 010031)

隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖水平的不斷提高，脂肪肝和酮病等營養(yǎng)性代謝疾病在圍產(chǎn)期高產(chǎn)奶牛中多發(fā)，其中，中輕度脂肪肝的發(fā)病率高達30%～40%[1]，且呈不斷上升趨勢。脂肪肝疾病是一種典型的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)，圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝的發(fā)生導致奶牛的淘汰率高達25%[2]，不僅會對奶牛的生產(chǎn)性能和繁殖性能產(chǎn)生影響，還會降低產(chǎn)奶量，誘發(fā)其他疾病的發(fā)生，如酮病、乳房炎、皺胃變位、子宮炎[3-5]等，影響奶牛的健康狀況和生產(chǎn)壽命，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。基于此，從分子層面深入挖掘奶牛脂肪肝發(fā)病機理，尋找主要調(diào)控靶點，對預防奶牛脂肪肝發(fā)病，提高奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益和畜牧業(yè)發(fā)展極為重要。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)通過影響肝臟脂代謝、糖異生、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥[6-8]等的生物過程參與調(diào)節(jié)肝臟中脂肪沉積，而脂肪肝的發(fā)生常與這些過程的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系緊密。PPARγ共激活因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)在胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、線粒體功能障礙和脂質(zhì)代謝紊亂[9]中主要以糖異生、脂肪酸氧化、線粒體呼吸關鍵酶的形式參與，不僅可以促進線粒體生物合成、消除氧自由基、調(diào)節(jié)不同纖維類型骨骼肌相互轉(zhuǎn)化，對一些炎性因子也有一定的作用[10]。目前，PGC-1α已被公認參與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展[11]。在NAFLD的治療中，通過單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)增強PGC-1α轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控線粒體的生物合成功能和能量代謝，從而促進脂肪酸的氧化，減少肝臟脂肪沉積，達到改善NAFLD的作用[12]。因此，深入探究PGC-1α參與脂肪肝發(fā)生發(fā)展的不同生物調(diào)節(jié)過程及影響PGC-1α表達水平變化的相關因素，對了解奶牛脂肪肝的發(fā)病機制、預防和治療提供夯實的理論依據(jù)和技術支撐，對減少奶牛養(yǎng)殖業(yè)不必要的經(jīng)濟損失有重要意義。

1 脂肪肝

NAFLD被認為是一種以脂肪酸積累、氧化應激和脂毒性為特征的慢性肝病，常與炎性反應、肥胖、Ⅱ型糖尿病、脂質(zhì)代謝功能障礙、氧化應激和胰島素抵抗密切相關[13]。奶牛產(chǎn)犢后由于干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)下降，產(chǎn)奶量升高，通過飼糧攝取的養(yǎng)分不足以滿足機體能量需求，導致奶牛發(fā)生嚴重的能量負平衡(negative energy balance，NEB)。為了滿足機體能量的需求，機體動員體脂分解產(chǎn)生非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids，NEFA)，但大量的體脂動員會使血漿中NEFA濃度升高，肝臟脂質(zhì)攝入超過NEFA的氧化和分解能力時，過量的脂質(zhì)就會以甘油三酯(triacylglycerol，TG)的形式蓄積在肝臟中[14]，使肝臟的代謝功能發(fā)生障礙，從而誘發(fā)脂肪肝的發(fā)生[5,15]。肝臟中TG含量是診斷奶牛脂肪肝的黃金標準，根據(jù)肝臟中TG含量可以將脂肪肝分為重度脂肪肝(肝臟TG含量大于10%)、中度脂肪肝(肝臟TG含量為5%～10%)、輕度脂肪肝(肝臟TG含量為1%～5%)和健康肝臟(肝臟TG含量小于1%)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在分娩后的第1個月內(nèi)患有重度脂肪肝的奶牛占5%～10%，患有輕度脂肪肝和重度脂肪肝的奶牛占30%～40%[5,16]。因此，深入探究奶牛脂肪肝的發(fā)病機制及影響因素，可為預防和治療奶牛脂肪肝提供充分的技術支撐。

2 PGC-1α

核轉(zhuǎn)錄輔助激活因子PGC-1α被認為是線粒體生物功能發(fā)揮的主要調(diào)節(jié)因子[17]，在調(diào)節(jié)線粒體功能和能量穩(wěn)態(tài)方面起著關鍵作用。PGC-1α作為轉(zhuǎn)錄共激活因子過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)家族的重要成員，一般存在于肝臟、腎臟、骨骼肌、棕色脂肪組織和心肌等[18-19]線粒體豐富的組織和器官中，并與許多炎性疾病和代謝性疾病如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病和脂肪變性緊密關聯(lián)。近年來，PGC-1α的作用備受關注，PGC-1α可以在線粒體功能、氧化應激、炎癥和不同組織代謝途徑中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[20-21]。

3 PGC-1α調(diào)節(jié)脂肪肝的作用及機制

目前，PGC-1α在脂肪肝中的研究主要體現(xiàn)在人和小鼠及體外的細胞模型，在奶牛脂肪肝作用機制研究中的內(nèi)容極少。PGC-1α對脂肪肝的調(diào)節(jié)作用及機制主要體現(xiàn)在脂質(zhì)代謝、線粒體功能障礙、氧化應激、胰島素抵抗及炎癥反應等方面。

3.1 PGC-1α與脂質(zhì)代謝

脂質(zhì)積累是肝臟脂肪代謝發(fā)生紊亂的基礎，這與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展密切相關，而脂肪變性的發(fā)生發(fā)展主要是以上調(diào)生脂基因甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c信號通路或下調(diào)脂質(zhì)氧化基因沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin 1，SIRT1)/PGC-1α信號通路進一步影響脂質(zhì)代謝，最終導致脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂[22]。AMPK作為細胞能量狀態(tài)的監(jiān)測器，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[23]。AMPK可以通過增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平來增強SIRT1活性，進一步導致SIRT1下游靶標PGC-1α的脫乙?；突钚哉{(diào)節(jié)[24]。而SIRT1作為AMPK的下游分子，可以控制參與能量代謝基因的表達，增強AMPK/SIRT1的表達可以抑制乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)活性并增加脂肪分解和β-氧化[25-26]，且SIRT1可以通過PGC-1α和PPARα等多個傳感器調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。Chen等[27]首次通過體內(nèi)和體外試驗證明AMPK/SIRT1通路可以調(diào)節(jié)肝臟脂肪生成和脂肪酸氧化，并顯著改善肝臟脂肪變性，有可能成為NAFLD治療的潛在途徑。此外，在阿司匹林刺激的氧化磷酸化途徑中[28]，通過激活PPAR/AMPK/PGC-1α信號通路來提高脂質(zhì)代謝，抑制脂質(zhì)生物合成和炎癥發(fā)生，進而降低NAFLD的發(fā)病。

成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)具有與內(nèi)分泌激素相似的功能，可以降低血脂，改善肥胖相關的血脂異常[29]。體內(nèi)和體外試驗證實FGF21可以激活肝臟中AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路，增加SIRT1及其下游PGC-1α的蛋白表達，從而加強脂肪酸氧化，減少脂肪生成，發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[30]。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)作為葡萄糖攝取的主要轉(zhuǎn)運蛋白，在調(diào)節(jié)血糖中發(fā)揮重要作用[31]。PGC-1α和GLUT4是反映脂肪和肌肉組織中葡萄糖攝取和能量消耗水平的主要指標[32]，而PGC-1α作為PPAR家族重要的成員，在脂質(zhì)代謝和脂肪積累方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，通過激活AMPK/PGC-1α/GLUT4信號通路可以降低血糖和改善脂質(zhì)代謝紊亂導致的酒精性脂肪肝損傷[33]。單核細胞趨化蛋白-1誘導蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1-induced protein 1，MCPIP1)核酸內(nèi)切酶是一種重要的炎癥負調(diào)節(jié)因子[34]，可以降解炎癥相關因子[35]，MCPIP1主要是通過硫氧還蛋白相互作用蛋白(thior-edoxin-interacting protein，TXNIP)/PGC-1α激活PPARγ轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)肝細胞的脂質(zhì)代謝[36]。此外，外源性功能活性物質(zhì)如黃芩素也可通過顯著提高油酸誘導的雄性C57BL/6小鼠的HepG2細胞激活PPARγ、PGC-1α、線粒體核呼吸因子(nuclear respiratory factor，NRF)-1/2、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)的mRNA和蛋白表達水平，降低血脂水平，提高抗氧化能力，揭示黃芩素可以通過PPARγ/PGC-1α/NRF-1/2通路改善NAFLD的脂質(zhì)代謝[37]。

3.2 PGC-1α與線粒體功能障礙

線粒體作為真核細胞內(nèi)能量的生產(chǎn)者，為滿足機體能量的需求發(fā)揮著重要作用，而線粒體功能障礙則會導致高能量需求組織如大腦、心臟、肝臟和肌肉等功能發(fā)生紊亂，加劇氧化應激、炎性反應和細胞凋亡。線粒體功能障礙在脂肪肝發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其功能障礙被認為是導致脂肪肝的一個重要發(fā)病機制之一[38]。PGC-1α作為線粒體生物發(fā)生的標志和AMPK/SIRT1參與線粒體生物發(fā)生的主要靶標，其穩(wěn)定性與線粒體功能緊密相關[39-40]，PGC-1α含量的減少會使線粒體損傷，最終導致細胞調(diào)亡[41]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK/SIRT1/PGC-1α能量傳感網(wǎng)絡在線粒體生物發(fā)生中對能量代謝和線粒體穩(wěn)態(tài)有著極其關鍵的作用[42]，AMPK磷酸化后通過上調(diào)PGC-1α和SIRT1的表達[43]，調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生，維持脂肪酸氧化和細胞增殖穩(wěn)態(tài)[44]。因此，直接或間接靶向調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路可能是改善或治療奶牛脂肪肝的重要途徑。而在脂肪肝中產(chǎn)生的過量脂肪則會通過下調(diào)AMPK/SIRT1/PGC-1α途徑損傷線粒體生物活性，減少質(zhì)粒形成，導致肝細胞中脂質(zhì)積累發(fā)生脂毒性，最終引起細胞調(diào)亡[45]。如脂肪肝奶牛血液中過量的NEFA可顯著損傷線粒體功能，增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，產(chǎn)生的過量ROS則會激活c-Jun氨基末端激酶(c-jun n-terminal kinase，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)通路，誘導奶牛肝細胞胰島素抵抗；而過表達PGC-1α則可顯著降低NEFA誘導的ROS生成和炎性因子的表達，緩解NEFA對線粒體功能的抑制作用，減弱ROS/JNK/p38MAPK通路的過度激活，進而減輕NEFA誘導的奶牛肝細胞線粒體功能障礙和胰島素抵抗[46]。Yes相關蛋白(yes-associated protein，YAP)的副產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄效應因子(tafazzin，TAZ)可通過WW結(jié)構(gòu)域與PPARγ的基序間的相互作用抑制PPARγ活性[47]，過表達YAP可通過YAP/TAZ-PPARγ/PGC-1α通路緩解線粒體功能障礙，從而改善NAFLD[48]。

此外，外源性添加物質(zhì)也可通過上調(diào)PGC-1α通路緩解肝細胞線粒體功能障礙。體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素通過上調(diào)FGF21/PGC-1α通路顯著改善線粒體生物發(fā)生和功能，減少ROS過量產(chǎn)生，增加線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)，進而減輕高脂飼糧(high-fat diet，HFD)和弗氏酵母誘導的肝臟脂質(zhì)積聚、氧化應激、細胞凋亡、炎癥和纖維化，進一步說明蝦青素可以通過上調(diào)PGC-1α通路緩解肝損傷和線粒體功能障礙[49]。添加丙酸能顯著提升NEFA誘導的奶牛肝細胞線粒體功能損傷的相關調(diào)節(jié)因子PGC-1α、電壓依賴性陰離子通道蛋白1(voltage-dependent anion channel protein 1，VDAC1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，Tfam)、細胞色素c氧化酶Ⅳ(cytochrome c oxidase Ⅳ，COXⅣ)的表達，降低氧化物含量，提高抗氧化物活力，增強細胞的抗氧化能力，而高表達的PGC-1α是線粒體功能恢復的關鍵調(diào)控因子；但是在高濃度NEFA處理的奶牛肝細胞中沉默PGC-1α，經(jīng)丙酸處理后則不能提高線粒體中相關調(diào)節(jié)因子PGC-1α、VDAC1、Tfam和COXⅣ的表達量，無法改善NEFA誘發(fā)的線粒體功能損傷[50]。藍莓葉多酚(polyphenols in blueberry leaves，PBL)通過升高沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶3(silent information regulator 2 related enzyme 3，SIRT3)蛋白表達和AMPKα磷酸化而提升PGC-1α的表達量，從而激活雌激素相關受體(estrogen-related receptors，ERR)和NRF轉(zhuǎn)錄因子，進一步增強線粒體功能[42]。綜上所述，上調(diào)PGC-1α的表達量可緩解肝細胞線粒體功能障礙，進而對脂肪肝的發(fā)生起到保護性抑制作用。

3.3 PGC-1α與氧化應激

圍產(chǎn)期奶牛機體對氧的需求量顯著增加，導致大量ROS的產(chǎn)生，促使氧化物與抗氧化物之間的動態(tài)平衡失調(diào)，機體抗氧化防御能力不足以清除聚集在機體內(nèi)的ROS，導致機體發(fā)生氧化應激狀態(tài)。大量產(chǎn)生的ROS則會通過影響脂質(zhì)代謝介導肝臟脂肪沉積，最終誘發(fā)奶牛脂肪肝發(fā)生。有研究表明，激活PPARα/PGC-1α信號通路可以減少氧化應激，顯著降低ROS和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的產(chǎn)生，增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性[51]。因此，生產(chǎn)中可通過激活PPARα/PGC-1α信號通路調(diào)節(jié)線粒體功能來預防NALFD的發(fā)生。但沉默PGC-1α表達后則損害了肝細胞線粒體功能，加劇了肝臟的氧化應激和凋亡[50]，而過表達SIRT1基因則可通過上調(diào)SIRT1/固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)/PGC-1α通路的表達降低氧化應激，進而緩解肝臟脂肪的沉積[52]，進一步證明PGC-1α具有調(diào)控氧化應激緩解脂肪肝的作用。

3.4 PGC-1α與胰島素抵抗

高水平的NEFA不僅是NAFLD的病理因素，還可以損害肝細胞線粒體功能和胰島素信號傳導[53]，且線粒體功能障礙被認為是誘發(fā)胰島素抵抗的致病因素。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝奶牛線粒體功能障礙表現(xiàn)出胰島素抵抗和高濃度的NEFA，但維持線粒體功能和胰島素敏感性需要調(diào)節(jié)劑PGC-1α等的參與[54]。Li等[55]在研究脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)的抗糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗的作用中發(fā)現(xiàn)，DHEA通過激活AMPK/PGC-1α/NRF1信號通路增加HFD和棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導的大鼠BRL-3A細胞中mtDNA拷貝數(shù)、ATP水平和線粒體膜電位，抑制ROS的產(chǎn)生，從而改善線粒體功能障礙；此外，DHEA還可激活胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/GLUT2信號通路，通過增加大鼠BRL-3A細胞中磷酸化胰島素受體底物1(phosphorylated insulin receptor substrate 1，p-IRS1)(Tyr612)水平，降低p-IRS1(Ser307)水平來緩解胰島素抵抗。外源性添加物小檗堿(berberine，BBR)也可以通過上調(diào)PGC-1α表達顯著改善NEFA誘導的奶牛肝細胞線粒體呼吸鏈功能損傷和胰島素信號傳導損傷[56]，該研究思路為預防和治療奶牛輕度和中度脂肪肝提供了新的治療策略。

3.5 PGC-1α與炎癥反應

炎癥是代謝綜合征的重要組成部分，其中特異性免疫細胞和促炎因子如腫瘤壞死因子α(tumors kill factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)等會促進代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展，最終誘發(fā)炎癥反應。機體正常炎癥反應對外來物侵害的抵御和機體自身組織的修復發(fā)揮重要的作用，然而當機體發(fā)生病變或外界因素干擾時炎癥反應會進一步加劇機體的惡性循環(huán)過程。因此，炎癥反應是加速或造成圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝發(fā)生發(fā)展的重要因素。

PGC-1α除了參與脂質(zhì)代謝過程外，還可以調(diào)節(jié)炎癥反應，其活性與炎癥的發(fā)生過程密切相關。在炎癥條件下，PGC-1α表達水平下降，可以促進炎癥反應的發(fā)生[57]。環(huán)氧二十碳三烯酸激動劑(epoxyeicosatrienoic acid-agonist，EET-A)是位于PGC-1α的上游的基因，可通過增加血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)/PGC-1α線粒體信號通路改善瘦素受體缺陷小鼠的NAFLD[58]。Raffaele等[58]在小鼠體內(nèi)使用慢病毒載體遞送PGC-1α沉默載體(Ln PGC-1α sh)和EET-A來檢驗EET-A干預NAFLD進展的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EET-A通過上調(diào)PGC-1α和HO-1的表達緩解了脂肪肝綜合征，從而抑制炎癥標記物TNF-α的表達。Wang等[59]在闡明異甘草素(isoliquiritigenin，ISL)對NAFLD的作用中發(fā)現(xiàn)，ISL可顯著增加參與脂質(zhì)代謝的PPARα、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1α(carnitine palmitoyltransterase 1α，CPT1α)和乙酰輔酶A脫氫酶(acetyl coenzyme A dehydrogenase，ACADS)表達水平，并通過激活PGC-1α抑制ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，通過熒光素酶分析進一步證實miR-138-5p和miR-23a-3p可能與NAFLD中的PGC-1αmRNA結(jié)合；此外還發(fā)現(xiàn)miR-138-5p和miR-23a-3p的表達在NAFLD中增加，而在ISL處理后的肝細胞中則顯著降低，且miR-138-5p和miR-23a-3p的抑制劑還可通過激活PGC-1α促進脂質(zhì)代謝并抑制NAFLD中的炎癥反應[60]。進一步說明ISL可以通過調(diào)節(jié)miR-138-5p/PGC-1α和miR-23a-3p/PGC-1α介導的脂質(zhì)代謝和炎癥反應減輕NAFLD的發(fā)生。

4 小結(jié)與展望

圍產(chǎn)期奶牛脂質(zhì)代謝紊亂、線粒體功能障礙、胰島素抵抗和炎癥是奶牛脂肪肝發(fā)生的主要原因。而PGC家族中的PGC-1α在脂質(zhì)代謝、線粒體功能障礙、氧化應激胰島素抵抗和炎癥反應中均發(fā)揮重要的作用，PGC-1α不僅在正常的組織代謝途徑中不可或缺，并且在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的功能作用?；诖?，深層次探究PGC-1α在奶牛脂肪肝發(fā)病中的功能作用，將有助于了解奶牛脂肪肝的發(fā)病機制，有望成為奶牛脂肪肝診斷和治療的新靶點。