鄭雪玥 黃 熠 賀海橋 鄧永軍 鄧宸璽,3 溫劉發(fā)**

(1.廣州百仕肽生物科技有限公司，廣州 510405；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

在畜禽集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖過程中，環(huán)境中的許多因素，如病原微生物、飼糧中的抗?fàn)I養(yǎng)因子以及溫度和濕度等均會(huì)影響畜禽的生長發(fā)育。飼料添加劑是飼料生產(chǎn)、加工和使用過程中添加的少量物質(zhì)，能夠有效減少動(dòng)物應(yīng)激，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病能力，提高飼料利用效率[1]。因此，關(guān)于飼料添加劑的研究也越來越受到人們的廣泛關(guān)注[2-4]。抗菌肽是一類由生物體在受到生存脅迫下為反抗脅迫因子而外泌的一種小分子多肽，具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的飼料添加劑[5-6]?？咕姆N類繁多，目前在肉雞方面已經(jīng)報(bào)道的有菌絲霉素、cLF chimera和抗菌肽Api-PR19等[7]，這些不同種類的抗菌肽在提高肉雞生長性能、改善腸道損傷、維持腸道微生態(tài)平衡和降低病死率等方面具有明顯的作用效果[8-11]。中草藥添加劑是一種新興的綠色添加劑，因具有天然性、抗菌性和無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)受到越來越多的關(guān)注[11-12]。韓金恒[13]發(fā)現(xiàn)，由黃芪、白術(shù)等組成的復(fù)方中草藥添加劑可以顯著提高肉雞末重、平均日增重和成活率，降低料重比，從而改善肉雞生長性能。

在前期工作中，研究人員主要集中在抗菌肽或中草藥添加劑在畜禽飼糧中的單一應(yīng)用研究，缺乏關(guān)于兩者聯(lián)合使用的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以10日齡麻黃肉雞為研究對(duì)象，研究飼糧添加抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)其生長性能、血清生化指標(biāo)和腸道形態(tài)等方面的影響，為抗菌肽和中草藥添加劑在麻黃肉雞養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用抗菌肽是來源于原生態(tài)雞腸道菌的一種外泌肽，屬于環(huán)狀多肽類物質(zhì)，分子量約為6 ku，抗菌活性≥25 000 AU/g；其生產(chǎn)工藝為經(jīng)三級(jí)發(fā)酵后滅菌儲(chǔ)存、濃縮和噴霧干燥后預(yù)混制得，由廣州某生物科技有限公司提供。中草藥添加劑中包含的藥材是從廣州市清平藥材市場進(jìn)行購買，然后65 ℃烘干、粉碎，并且過40目篩，密封備用，其主要組成及含量見表1。

表1 中草藥添加劑主要組成及含量Table 1 Composition and content of Chinese herbal medicine

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇600只初始體重相近且健康狀況良好的10日齡麻黃肉仔雞，隨機(jī)分成4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗菌肽組在基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg/kg抗菌肽，中草藥組在基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg/kg中草藥添加劑，抗菌肽+中草藥組在基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg/kg抗菌肽和200 mg/kg中草藥添加劑。試驗(yàn)期47 d，分10～21日齡、22～43日齡和44～56日齡3個(gè)階段飼養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)進(jìn)行設(shè)計(jì)，不同日齡階段肉雞的基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets (DM basis) g/kg

續(xù)表2項(xiàng)目Items10～21日齡10to21daysofage22～43日齡22to43daysofage44～56日齡44to56daysofage合計(jì)Total100010001000營養(yǎng)水平Nutrientlevels2)粗蛋白質(zhì)CP210.0191.0170.1粗纖維CF26.023.123.1鈣Ca9.39.48.1總磷TP7.67.16.5賴氨酸Lys12.811.39.6蛋氨酸Met6.05.75.4蘇氨酸Thr8.57.66.7代謝能ME/(MJ/kg)12.2012.5312.57

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在深圳市神農(nóng)莊家禽育種有限公司惠州博羅縣肉雞繁育場進(jìn)行，所有試驗(yàn)雞均在同一棟雞舍內(nèi)飼養(yǎng)，雞舍內(nèi)保持良好的通風(fēng)，確保溫度和濕度適宜。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，肉雞自由采食和飲水，并且按照常規(guī)管理和免疫接種程序進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.5 樣品采集與制備

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取接近平均體重的1只肉雞，翅靜脈采血于促凝管中，在2 000×g、4 ℃條件下離心15 min，制備血清，并存于-20 ℃冰柜，待測。雞只采血后，采用頸部放血致死，剖取十二指腸、空腸和回腸，各個(gè)腸段從中間部位取2～3 cm，用生理鹽水沖掉內(nèi)容物，然后至于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，用于腸道形態(tài)指標(biāo)觀察。

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 生長性能

分別于肉雞21、43和56日齡時(shí)，禁食12 h，然后對(duì)每只試驗(yàn)雞進(jìn)行稱重，以重復(fù)(欄位)為單位統(tǒng)計(jì)采食量，分別計(jì)算10～21日齡、22～43日齡、44～56日齡肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比和死亡率。

1.6.2 血清生化指標(biāo)

取分裝血清樣品，采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)的方法測定血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素氮、丙二醛和D-乳酸含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。

1.6.3 腸道形態(tài)

從4%多聚甲醛固定液中取出樣品后，通過乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、蘇木精-伊紅染色和中性樹膠封片后，在顯微鏡下觀察并拍照，并且使用Case Viewer軟件分析測量小腸絨毛高度和隱窩深度，最后計(jì)算絨毛高度/隱窩深度值[14]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

利用SPSS 21.0軟件的一般線性模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以分組作為固定影響因素，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)組間差異顯著性，并使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P≤0.05表示差異顯著，0.050.10表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞生長性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)10～21日齡肉雞平均日采食量和料重比存在顯著影響(P<0.05)，其中抗菌肽組和抗菌肽+中草藥組肉雞平均日采食量顯著提高(P<0.05)，且抗菌肽+中草藥組肉雞料重比顯著提高(P<0.05)。

表3 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)10～21日齡肉雞生長性能的影響Table 3 Effects of antimicrobial peptides and Chinese herbal medicine additives on growth performance of broilers from 10 to 21 days of age

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)22～43日齡肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比和死亡率均存在顯著影響(P<0.05)，其中抗菌肽組和中草藥組肉雞平均日增重均顯著提高(P<0.05)，試驗(yàn)組平均日采食量和料重比均顯著降低(P<0.05)，且抗菌肽+中草藥組死亡率顯著提高(P<0.05)。

表4 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)22～43日齡肉雞生長性能的影響Table 4 Effects of antimicrobial peptides and Chinese herbal medicine additives on growth performance of broilers from 22 to 43 days of age

由表5可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)44～56日齡肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比和死亡率均存在顯著影響(P<0.05)，其中抗菌肽組和中草藥組肉雞平均日采食量和平均日增重顯著提高(P<0.05)，料重比顯著降低(P<0.05)；而抗菌肽+中草藥組肉雞平均日采食量顯著降低(P<0.05)，死亡率顯著提高(P<0.05)。

表5 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)44～56日齡肉雞生長性能的影響Table 5 Effects of antimicrobial peptides and Chinese herbal medicine additives on growth performance of broilers from 44 to 56 days of age

2.2 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞血清球蛋白、丙二醛和D-乳酸含量存在顯著影響(P<0.05)，其中抗菌肽組肉雞血清球蛋白含量顯著提高(P<0.05)，試驗(yàn)組血清丙二醛和D-乳酸含量顯著降低(P<0.05)。

表6 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of antimicrobial peptides and Chinese herbal medicine additives on serum biochemical indices of broilers

2.3 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

由表7可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值以及回腸隱窩深度均存在顯著影響(P<0.05)，其中抗菌肽組十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值顯著提高(P<0.05)，中草藥組和抗菌肽+中草藥組十二指腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)；抗菌肽+中草藥組空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值顯著降低(P<0.05)，回腸絨毛高度和隱窩深度顯著降低(P<0.05)，回腸絨毛高度/隱窩深度值顯著提高(P<0.05)。

表7 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響Table 7 Effects of antimicrobial peptides and Chinese herbal medicine additives on intestinal morphology of broilers

3 討 論

3.1 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞生長性能的影響

抗菌肽和中草藥添加劑作為抗菌活性強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性和無污染的添加劑，已經(jīng)在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中開展了相關(guān)研究[15-17]。本研究中，飼糧添加抗菌肽顯著提高22～43日齡和44～56日齡肉雞平均日增重，顯著降低料重比，這可能與抗菌肽能夠改善肉雞免疫功能和腸道健康密切相關(guān)。肉雞生長周期短，營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和腸道的健康水平直接影響著肉雞的生長性能。Zhang等[8]在肉雞飼糧中添加菌絲霉素，使肉雞平均日增重提高了17%。Xie等[18]在1日齡健康818肉仔雞飼糧中添加100 g/t菌絲霉素+100 g/t天蠶素抗菌肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可促進(jìn)雞的法氏囊和胸腺等免疫器官的發(fā)育。此外，本試驗(yàn)中，飼糧添加中草藥添加劑同樣有助于提高肉雞平均日增重和降低料重比，這可能與其含有的活性成分有關(guān)。黃芪多糖和白術(shù)多糖可以增強(qiáng)禽類免疫功能，促進(jìn)機(jī)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而提高生產(chǎn)性能[19-20]。但是，當(dāng)抗菌肽與中草藥添加劑聯(lián)合使用時(shí)卻提高了肉雞的死亡率。我們推測中草藥添加劑中存在與抗菌肽活性成分產(chǎn)生拮抗作用的物質(zhì)，當(dāng)2種或3種以上添加劑聯(lián)合使用時(shí)，可能會(huì)增加潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)[21]。除此之外，抗菌肽與中草藥添加劑聯(lián)合使用可以提高10～21日齡肉雞的平均日采食量，但是降低了22～43日齡和44～56日齡肉雞的平均日采食量。我們推測，隨著肉雞日齡的增加，自身免疫系統(tǒng)日益完善，繼續(xù)聯(lián)合使用抗菌肽和中草藥可能會(huì)對(duì)自身的免疫功能產(chǎn)生負(fù)面影響，從而影響肉雞采食量，但是具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.2 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

動(dòng)物血清生化指標(biāo)變化與機(jī)體代謝密切相關(guān)，是反映機(jī)體生理功能和健康的重要依據(jù)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可以顯著提高青腳麻雞血清球蛋白含量，降低血清丙二醛和D-乳酸含量。球蛋白是反映機(jī)體免疫功能的主要指標(biāo)[22]，丙二醛是機(jī)體活性氧與抗氧化防御系統(tǒng)相互作用的最終產(chǎn)物，與過氧化程度有關(guān)[23]。D-乳酸是細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物，通常反映腸黏膜損傷程度和通透性的變化，是腸道屏障功能的主要參考指標(biāo)[24]。研究表明，天蠶素抗菌肽可以顯著降低肉仔雞血清丙二醛含量[23]。也有研究表明，抗菌肽Microcin J25可以增強(qiáng)腸道機(jī)械屏障和免疫屏障[25]。本試驗(yàn)中，飼糧添加抗菌肽能夠顯著提高肉雞血清球蛋白含量，顯著降低血清丙二醛和D-乳酸含量，與上述研究結(jié)果一致。另外，中草藥添加劑及其與抗菌肽聯(lián)合使用也能顯著降低血清丙二醛和D-乳酸含量?；羟诘萚26]研究發(fā)現(xiàn)，含有黃芪、白術(shù)和防風(fēng)的中草藥添加劑可以提高肉雞免疫器官指數(shù)，提高新城疫血凝抑制(HI)抗體效價(jià)，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖。黃芪多糖可以降低核因子-κB(NF-κB)表達(dá)，促進(jìn)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶表達(dá)，提高機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激能力，減輕急性放射性腸炎組織內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)腸黏膜功能[27]。目前，現(xiàn)代藥理研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，黃芪注射液可以降低血清中二胺氧化酶活性以及D-乳酸和內(nèi)毒素含量，改善腸道屏障功能和微炎性反應(yīng)狀態(tài)[28]。

3.3 抗菌肽和中草藥添加劑對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

小腸是機(jī)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官之一，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性與營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，并且腸道內(nèi)絨毛高度與隱窩深度也是衡量腸道功能的主要指標(biāo)[29-30]。小腸絨毛高度增加有利于腸黏膜與食糜充分接觸，這有助于對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而隱窩深度主要與細(xì)胞增殖速率有關(guān)，隱窩深度變深表明腸道上皮細(xì)胞成熟度降低，吸收能力降低，反之則增強(qiáng)[31]。Hu等[32]在給肉雞口服豬源抗菌肽后發(fā)現(xiàn)，十二指腸和空腸絨毛高度均顯著提高。Ma等[33]研究表明，飼糧添加100和200 mg/kg菌絲霉素能改善肉雞腸道形態(tài)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和腸道健康。Sholikin等[4]系統(tǒng)分析了29項(xiàng)抗菌肽在肉雞上的應(yīng)用試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽添加水平對(duì)肉雞十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值呈線性提高，隱窩深度呈線性降低；空腸黏膜厚度呈二次曲線變化，隱窩深度呈線性降低。本研究結(jié)果表明，飼糧添加抗菌肽可以顯著提高肉雞十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值，這與張凱瑛[31]的研究結(jié)果一致。這說明在飼糧中添加適量的抗菌肽有利于改善肉雞腸道組織形態(tài)，這也解釋了抗菌肽提高肉雞生長性能的原因。黃芪多糖可以提高雛雞空腸絨毛高度/隱窩深度值，增強(qiáng)雛雞的腸黏膜免疫功能[34]。在本試驗(yàn)中，飼糧添加中草藥添加劑能夠顯著提高肉雞十二指腸絨毛高度，這可能與中草藥添加劑含有的活性成分能夠改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)和提高免疫功能有關(guān)。但是，當(dāng)抗菌肽和中草藥添加劑聯(lián)合使用時(shí)，肉雞空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值以及回腸絨毛高度顯著降低，這說明兩者混合對(duì)小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)造成了負(fù)面影響，可能會(huì)抑制肉雞對(duì)飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，這也側(cè)面解釋了肉雞生長性能降低的原因。因此，抗菌肽與中草藥添加劑的組合使用及其影響機(jī)制仍需進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)研究。

4 結(jié) 論

飼糧單獨(dú)添加200 mg/kg抗菌肽或中草藥添加劑可以顯著提高22～56日齡麻黃肉雞平均日增重，顯著降低料重比和血清D-乳酸含量，同時(shí)改善小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)。在本試驗(yàn)條件下，推薦在22～56日齡肉雞飼糧中單獨(dú)添加200 mg/kg抗菌肽或中草藥添加劑(白術(shù)∶黃芪∶防風(fēng)=50∶25∶25)。