劉梅珍，王立人，李詠梅，馬雪云，韓紅輝，李大力

利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因編輯大鼠模型

劉梅珍，王立人，李詠梅，馬雪云，韓紅輝，李大力

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241

RNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)由單鏈引導(dǎo)RNA(sgRNA)與核酸酶Cas9構(gòu)成。在細(xì)胞內(nèi)，sgRNA能夠按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則引導(dǎo)Cas9與靶點(diǎn)結(jié)合，由Cas9切割目標(biāo)DNA，造成雙鏈DNA斷裂(double stranded break, DSB)。在隨后的DNA修復(fù)過(guò)程中，細(xì)胞主要進(jìn)行非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或在有修復(fù)模板存在的情況下進(jìn)行重組修復(fù)(homology directed repair, HDR)。如果將CRISPR/Cas9系統(tǒng)以及修復(fù)模板通過(guò)顯微注射的方式導(dǎo)入大鼠的胚胎內(nèi)，就能借助細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)大鼠胚胎的基因編輯，由此構(gòu)建各種基因修飾大鼠模型。本文詳細(xì)介紹了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建大鼠模型的具體操作步驟，以期為相關(guān)領(lǐng)域的科研人員提供一種大鼠基因修飾模型的構(gòu)建方法。

大鼠；CRISPR/Cas9；基因編輯；基因敲除

小鼠()和大鼠()是生物學(xué)研究中最為常見(jiàn)的模式動(dòng)物。兩者都具有易飼養(yǎng)、遺傳譜系清晰、品系種類(lèi)豐富等優(yōu)點(diǎn)。小鼠ES細(xì)胞打靶技術(shù)在20世紀(jì)80年代末崛起并逐步走向成熟。在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)逐步累積了各種不同的疾病模型品系，成為各類(lèi)科研工作者的首選模式動(dòng)物[1]。相反，由于大鼠的ES細(xì)胞培養(yǎng)和打靶技術(shù)遲遲未能普及，使其漸漸失去了與小鼠相當(dāng)?shù)哪Ｊ絼?dòng)物地位。但是，大鼠作為疾病動(dòng)物模型有許多小鼠無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)。首先，大鼠的體型大于小鼠，能夠提供更多的組織與血液標(biāo)本，這一點(diǎn)在藥理學(xué)、代謝類(lèi)疾病的研究上尤其重要；其次，大鼠在臟器比例上與人類(lèi)更接近，相對(duì)更大的個(gè)體也降低了各種手術(shù)操作的難度，使其成為諸如心血管研究、神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域的理想模式動(dòng)物。大鼠的智力遠(yuǎn)高于小鼠，在行為學(xué)上也比小鼠更加接近人類(lèi)，適合進(jìn)行各類(lèi)腦功能與認(rèn)知領(lǐng)域疾病的硏究。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，一些大鼠疾病模型能夠很好地模擬環(huán)境因素帶來(lái)的影響。如大鼠糖尿病模型能夠模擬壓力、毒素、飲食、等對(duì)于疾病進(jìn)展的影響[2]。隨著人工核酸酶技術(shù)尤其是CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，大鼠模型的構(gòu)建變得非常高效和便捷[3]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在大鼠胚胎細(xì)胞中有著與小鼠相當(dāng)?shù)母呔庉嬓?，使進(jìn)一步開(kāi)發(fā)大量大鼠疾病動(dòng)物模型成為可能[4]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種RNA介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，主要存在于細(xì)菌或古細(xì)菌中[5,6]，可以保護(hù)菌株免受病毒或外源質(zhì)粒的入侵。源自化膿性鏈球菌(sp.yCas9)的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被改造并廣泛用于基因編輯[4～7]，該系統(tǒng)的主要組成部分是crRNA、tracrRNA和Cas9核酸酶。在細(xì)菌體內(nèi)，Cas9能夠與crRNA:tracRNA形成復(fù)合物，而crRNA上帶有與靶序列互補(bǔ)配對(duì)的RNA序列，稱(chēng)為protospacer[5,6]。不同的Cas9蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合靶序列上的PAM(protospacer adjacent motif)序列，對(duì)于sp.yCas9而言，PAM序列為NGG。結(jié)合PAM序列后，引導(dǎo)RNA便開(kāi)始了與靶序列的互補(bǔ)配對(duì)過(guò)程，靶序列與protospacer完全互補(bǔ)后，便會(huì)促進(jìn)Cas9發(fā)生構(gòu)象變化，切割靶序列DNA造成雙鏈DNA斷裂(double stranded breaks, DSBs)。由于DSBs具有細(xì)胞毒性，細(xì)胞探測(cè)到DNA損傷后，修復(fù)反應(yīng)隨即被啟動(dòng)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，主要通過(guò)兩種途徑進(jìn)行修復(fù)：非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源介導(dǎo)的修復(fù)(homology directed repair, HDR)。NHEJ以一種容易出錯(cuò)的方式促進(jìn)DSB末端的直接連接，通常會(huì)導(dǎo)致隨機(jī)的插入、缺失和替換。HDR修復(fù)則需要一個(gè)同源序列作為模板進(jìn)行高保真修復(fù)，可用于在大鼠基因組中制造點(diǎn)突變、精準(zhǔn)缺失、條件性敲除或報(bào)告基因敲入等。一般來(lái)說(shuō)，雙鏈DNA或單鏈寡核苷酸(ssODNs)都可以用作供體模板。本文以構(gòu)建B型血友病大鼠模型為例，詳細(xì)介紹了利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建大鼠疾病動(dòng)物模型的具體操作步驟(圖1)。

1 材料、試劑及設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)所需材料與試劑

詳見(jiàn)表1。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建大鼠模型流程圖

表1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料及試劑

1.2 溶液配方

詳見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)所需溶液配方

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 sgRNA與Cas9 mRNA的制備

(1)在設(shè)計(jì)靶基因的sgRNA前，建議對(duì)野生型大鼠的靶基因區(qū)段進(jìn)行測(cè)序，或通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)(如NCBI)得到靶基因的序列?？衫迷诰€sgRNA設(shè)計(jì)平臺(tái)(https://design.synthego.com/#/)分析得到目的基因的靶點(diǎn)序列(20 bp)的信息，從中選擇編輯效率評(píng)分高，脫靶評(píng)分低的靶點(diǎn)。以大鼠F9基因?yàn)槔?，選取的sgRNA序列為：5′-GAGATATAAC-TCAGG-GAAAC-3′。sgRNA的骨架序列為：5′-GTTTT-AG-AGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC-CGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCG-GTGC-3′。以化學(xué)合成的方式獲得sgRNA全長(zhǎng)序列。雖然也可以通過(guò)PCR結(jié)合體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得sgRNA全長(zhǎng)序列，但根據(jù)經(jīng)驗(yàn)化學(xué)合成的sgRNA具有更高的動(dòng)物模型構(gòu)建成功率。

(2)以px260質(zhì)粒為模板，以5′-CAATGGG-TGGAGTATTTACGG-3′為正向引物，5′-GGAAA-GGACAGTGGGAGTG-3′為反向引物進(jìn)行PCR，獲得NLS-Cas9-NLS的DNA轉(zhuǎn)錄模板。利用sp6轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)流程進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和純化。Cas9 mRNA也可以在美國(guó)Thermo fisher公司(A29378)購(gòu)買(mǎi)。

(3)顯微注射液的配置：利用無(wú)RNA酶TE-buffer配置Cas9/sgRNA注射緩沖液(Cas9：25 ng/μL；sgRNA：12.5 ng/μL)。

2.2 移卵管、顯微注射針以及固定吸管的制備

2.2.1 制備移卵管

兩手捏著微毛細(xì)管兩端，管中間放在酒精燈外焰灼燒3～5 s后，離火快速向兩邊拉，使微毛細(xì)管均勻變細(xì)，變細(xì)的長(zhǎng)度為6～7 cm，總長(zhǎng)為10～12 cm為宜(圖2)。細(xì)管中間用砂輪劃斷，切口平整，斷端在火焰中來(lái)回使切口邊緣圓潤(rùn)。移卵管口大小為比受精卵稍大一點(diǎn)點(diǎn)即可。連接吸氣軟管等附件即可。

2.2.2 制備注射針

取一根玻璃管放置在拉針儀(美國(guó)Sutter Instru-ment公司, Flaming/Brown Micropipette Puller, P-97) 上，固定兩端后打開(kāi)電源，設(shè)置參數(shù)如下，點(diǎn)擊“PULL”鍵待程序完成，取出其中一邊的玻璃針制作固定吸管(見(jiàn)2.2.3)，另一邊玻璃針作為顯微注射針。拉針儀設(shè)置參數(shù)如表3所示。

圖2 移卵管的制作示意圖

2.2.3 制備固定吸管

按照上述制備注射針?lè)椒ɡ樅?，取出拉針儀一側(cè)的玻璃針固定在煅針儀固定夾上，針尖朝下，使其于煅針儀(日本NARISHIGE SCIENTIFIC INSTRUMENT公司, MF-830)的顯微視野內(nèi)，上下移動(dòng)到適當(dāng)孔徑大小，腳踏加熱源控制器，進(jìn)行固定吸管的制作(圖3)。固定吸管的內(nèi)外徑分別為30 μm、80 μm較為合適。

2.3 結(jié)扎公鼠的制備(腹部切開(kāi)法)

(1) 選取7～8周的SD雄鼠。應(yīng)選擇毛色具有光澤、機(jī)警、行動(dòng)靈活的健康個(gè)體。

(2) 異氟烷吸入性(5%)麻醉大鼠。此后操作均在異氟烷維持麻醉(3%)的情況下進(jìn)行。

表3 利用拉針儀制作固定吸管與纖維注射針的參數(shù)設(shè)置

*每一列的數(shù)值為Sutter P-97拉針儀所顯示數(shù)值，單位的儀器內(nèi)部單位。

(3) 將雄鼠腹部朝上放在手術(shù)臺(tái)上，用70%乙醇噴灑雄鼠腹部，用棉球擦凈。用剪刀剪開(kāi)下肢上緣水平線位置的皮膚沿腹中線切口1.5 cm (圖4)，在腹壁肌肉切口，并鈍性分離肌肉層約1 cm的口，暴露腹腔。

(4) 用11 cm無(wú)齒鑷子輕輕夾住肌肉固定，用另一鑷子探測(cè)脂肪墊右側(cè)位置(必要時(shí)將脂肪墊夾出)，輸精管位于脂肪墊側(cè)緣，一小部分游離，伴行血管易于識(shí)別，夾住稍微拖拉下，分離系膜后用加熱的煅熔筆(Gutta cutter, 佛山市御田醫(yī)療科技有限公司，VT-06)燒掉一段輸精管；若有夾出脂肪墊睪丸等組織，將其一一送回腹腔內(nèi)(圖5)。重復(fù)以上步驟，處理另一側(cè)輸精管。最好將燒斷一段的輸精管放在一張紙上，以便檢查和確認(rèn)每只鼠的兩側(cè)輸精管都結(jié)扎過(guò)。依次結(jié)節(jié)縫合腹壁肌和皮膚。

圖3 利用煅針儀煅針制作固定吸管

圖4 術(shù)口位置

陰莖海綿體上方1.5 cm處腹中線位置，切口長(zhǎng)度以1.5 cm為宜。

(5) 術(shù)后將鼠放置于干凈的鼠籠內(nèi)，籠盒放在保溫臺(tái)上，直到其蘇醒為止。術(shù)后兩周即可與母鼠交配制備假孕母鼠?？梢允褂靡荒曛烈荒臧朐偬蕴?/p>

圖5 利用熔斷筆進(jìn)行大鼠輸精管切除手術(shù)

2.4 準(zhǔn)備假孕母鼠

(1) 購(gòu)買(mǎi)7～8周齡的SD雌鼠，觀察3天后備用。

(2) 制備假孕大鼠的前一天下午，挑選健康活潑、腹部飽滿(mǎn)的雌鼠與結(jié)扎公鼠合籠，按1只雄鼠與1只雌鼠的比例合籠。

(3) 次日早晨8:00～10:00檢栓：左手拇指和食指向上提起鼠尾巴中部，手外緣頂住尾骨，露出陰道，右手用一個(gè)鈍頭彎鑷撥開(kāi)陰道口，可見(jiàn)有乳白色的栓塞，即為假孕母鼠，檢出備用(圖6)。

2.5 胚胎供體雌鼠超排卵(以SD大鼠為例)

(1) 購(gòu)買(mǎi)所需品系大鼠，周齡6～7周為宜；觀察3天后備用。

(2) 第一天中午13:00～14:00 注射PMSG，劑量為20 IU/只，注射方式為腹腔注射。

(3) 48 h后腹腔注射HCG，劑量為30 IU/只。與成年雄鼠按1∶1比例合籠。

(4) 次日早晨8:00檢栓，同檢測(cè)假孕鼠方法，檢出備用。未觀察到栓塞的鼠按照3只/籠飼養(yǎng)，一周后可再次使用。

2.6 受精卵獲3取

(1) 有栓的大鼠，用異氟烷(5%)麻醉后取出，脫頸安樂(lè)死，腹部朝上，噴灑70%酒精消毒后切開(kāi)腹部皮膚及肌肉層，暴露腹腔，找到左右兩側(cè)的輸卵管并剪下。

圖6 檢查母鼠陰栓操作圖示

(2) 輸卵管放置在有透明質(zhì)酸酶的M2溶液中，顯微鏡下用精細(xì)鑷子撕開(kāi)輸卵管的膨大部，受精卵在壓力下自動(dòng)留出管腔外，移除取完后的輸卵管。

(3) 受精卵脫顆粒：由于大鼠受精卵表面的顆粒細(xì)胞較難脫去(區(qū)別于小鼠受精卵)，作用時(shí)間較小鼠受精卵脫顆粒長(zhǎng)，一般需要3～5 min甚至更長(zhǎng)時(shí)間。用移卵管多次吸吹受精卵將有利于脫顆粒。

(4) 受精卵脫顆粒后用移卵管移到無(wú)透明質(zhì)酸酶的M2培養(yǎng)液中，洗滌3～4次以清除殘留的透明質(zhì)酸酶后，移到KSOM培養(yǎng)滴(每個(gè)液滴約25 μL，一個(gè)皿可滴3～5個(gè)液滴，上面覆蓋礦物油放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)待注射)。

2.7 顯微注射

(1) 將固定吸管安裝在倒置顯微鏡左邊的顯微操作系統(tǒng)的固定臂上，旋緊，調(diào)整合適的角度。用微量上樣針(德國(guó)Eppendorf公司, micro-loaderTM)吸取5～10 μL待注射樣品，將樣品推入制備好的注射針針尖端位置。

(2) 將顯微注射針安裝在倒置顯微鏡右邊顯微操作系統(tǒng)的注射臂上，旋緊，調(diào)整合適的角度。利用同側(cè)的顯微操作儀(德國(guó)Eppendorf公司, TransferMan NK 2 micromanipulator, 92000001)將其調(diào)到合適的顯微視野內(nèi)，與固定吸管相對(duì)。顯微注射針自針尖起20 μm處的外徑為4 μm時(shí)，可以獲得較好的注射效果。針尖太粗會(huì)導(dǎo)致插入透明帶及原核的阻力增加，且DNA流量過(guò)多，受精卵易于裂解。針尖太細(xì)則導(dǎo)致針內(nèi)DNA流速過(guò)慢，且易阻塞，使DNA無(wú)法順利流入，影響最終的整合效率。

(3) 將一硅化載玻片放在倒置顯微鏡載物臺(tái)上，取25 μL的M2培養(yǎng)液形成豎形液滴，用礦物油將其全部覆蓋，防止液體蒸發(fā)。

(4) 將受精卵移到玻片的液滴內(nèi)，依次排列成一直線。首視野為受精卵線的下面，注射時(shí)依次上移視野。

(5) 固定吸管位置由左側(cè)顯微操作儀調(diào)節(jié)固定臂實(shí)現(xiàn)，使固定吸管前端口調(diào)到合適的顯微視野內(nèi)。固定吸管的壓力由右手調(diào)節(jié)右側(cè)固定泵來(lái)固定受精卵。

(6) 注射針位置由右側(cè)顯微操作儀調(diào)節(jié)注射臂實(shí)現(xiàn)，使注射針尖在合適的顯微視野內(nèi)。注射流量大小由左側(cè)注射泵調(diào)節(jié)。

(7) 調(diào)整顯微鏡倍數(shù)，由低倍數(shù)到高倍數(shù)。注射物鏡鏡頭用RC鏡頭，可以清晰可見(jiàn)受精卵的形態(tài)及原核。

(8) 注射：左邊的固定吸管吸取一個(gè)受精卵，右邊的顯微注射針依次扎入透明帶和卵膜內(nèi)(圖7)，見(jiàn)有微量液流進(jìn)入胞漿內(nèi)后，抽離受精卵；固定吸管釋壓，受精卵推到視野下方。非受精、畸形等無(wú)效卵吹移到右邊。

(9) 注射滴內(nèi)的受精卵注射完成后，吸取良好的受精卵移到KSOM培養(yǎng)滴中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min左右，待移植。

2.8 受精卵移植

(1) 檢測(cè)出來(lái)有栓的假孕大鼠放在麻醉箱內(nèi)，異氟烷吸入性麻醉大鼠(5%)；此后操作均在異氟烷維持麻醉(3%)情況下操作。

(2) 吸入受精卵前先在移植管中吸入少量M2培養(yǎng)液，再吸入一個(gè)小的氣泡，然后再吸入M2培養(yǎng)液，之后再吸入第二個(gè)小氣泡，如此重復(fù)直到降低虹吸作用能夠很好的控制液體的進(jìn)出為止。

(3) 將受精卵(10～15枚)及盡可能少的M2培養(yǎng)液吸入移植管(高度大約為5～7 mm)，在移植管的末端再吸入一個(gè)小氣泡。

(4) 將連接嘴控制管的移植管搭在體式顯微鏡目鏡架上備用，直到輸卵管胚胎移植。

(5) 用寵物推子去掉大鼠右側(cè)大腿前沿上2～3 cm周?chē)拿?0%酒精棉球消毒剃毛過(guò)的皮膚并擦去殘留的毛發(fā)(圖8)。

(6) 觀察背中線從最后肋骨附近透過(guò)皮膚可見(jiàn)背腹部?jī)?nèi)有白色的脂肪墊的位置(左右兩側(cè)都有)，用帶鉤鑷子小心夾起皮膚用剪刀在皮膚上剪一個(gè)小口，鈍性分離該切口約1.5 cm，再用帶鉤鑷子避開(kāi)血管夾取肌肉，避開(kāi)血管剪一個(gè)小口并鈍性分離，切口只要能拉出脂肪墊(白色)和卵巢(粉色)即可(圖9)。

圖7 大鼠受精卵顯微注射

圖8 假孕大鼠進(jìn)行胚胎移植手術(shù)切口位置

(7) 將鼠放到體式顯微鏡基座上(型號(hào)szx10)。大鼠的頭朝左側(cè)，尾朝右側(cè)橫放(左右輸卵管移植體位一致)。

(8) 動(dòng)脈夾夾住卵巢上的脂肪墊，搭在脊背上起固定作用，在顯微鏡下找到輸卵管的開(kāi)口(輸卵管傘)和卵巢囊之下膨大的輸卵管壺腹部位置。卵巢囊是輸卵管和卵巢周?chē)囊粚佑醒芊植纪该鞯哪?。調(diào)整好大鼠及輸卵管的位置，以便于很容易將移植管進(jìn)入輸卵管。用精密手術(shù)鑷子在輸卵管傘部的卵巢囊上撕開(kāi)一個(gè)小口(要注意避開(kāi)血管，否則影響操作視野)，找到輸卵管口。

(9) 左手用直鑷子小心固定輸卵管傘，右手用彎鑷探測(cè)輸卵管口的位置后，將移植管插入輸卵管開(kāi)口，將胚胎吹入輸卵管壺腹部。若在輸卵管內(nèi)看到氣泡就說(shuō)明移植成功。也可選擇精細(xì)手術(shù)剪于輸卵管膨大部和輸卵管口之間合適位置剪個(gè)斜切口，將受精卵吹入膨大部?jī)?nèi)?？蛇M(jìn)行單側(cè)輸卵管移植(15～ 20枚受精卵)，也可雙側(cè)移植(每側(cè)10枚左右為宜)。

(10) 松開(kāi)動(dòng)脈夾，將大鼠從顯微鏡臺(tái)上取下，用普通手術(shù)鑷子(不帶鉤的)夾取脂肪墊，將子宮、輸卵管、卵巢等放回腹腔。分別結(jié)節(jié)縫合肌肉層和皮膚。

(11) 術(shù)后將大鼠放置于干凈的鼠籠里，鼠籠放置于37℃的恒溫加熱臺(tái)上，直至蘇醒。

圖9 術(shù)口曳出卵巢及脂肪墊

A：紅色箭頭所示為卵巢，藍(lán)色箭頭所示為脂肪墊組織；B：卵巢囊相對(duì)位置示意圖。

2.9 基因型鑒定

(1) 設(shè)計(jì)基因鑒定PCR引物。靶點(diǎn)的兩側(cè)與正反向引物的3′端保留50 bp以上的距離以便后續(xù)通過(guò)一代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步分析。以構(gòu)建的B型血友病大鼠模型為例。PCR正向引物(P1)：5′-TCA-TT-ATTGACACTCAACCGAT-3′；反向引物(P2)：5′- GATGTGGACTCCTTTCCTTTT-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為747 bp (圖10)。

(2)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品收集。胚胎移植后在新生大鼠出生的第5～7天，剪取其尾尖組織或腳趾。同時(shí)收集1～2組野生型大鼠尾尖組織或腳趾作為對(duì)照組。每份組織分別放入1.5 mL離心管中，加入500 μL消化液和1 μL 蛋白酶K母液。在55℃水浴消化約8 h。

(3) 利用酚氯仿-乙醇沉淀法抽提大鼠的基因組DNA并將其溶解在30～50 μL無(wú)核酸酶的水中。

(4) PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表4。在PCR儀上于98℃預(yù)加熱30 s，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于98℃保持15 s使模板變性然后將溫度降到復(fù)性溫度(合適的退火溫度)，一般保持30 s，使引物與模板充分退火；在72℃保持20 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)30次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持3～7 min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣觀測(cè)，如產(chǎn)物特異則可以進(jìn)行后續(xù)Sanger測(cè)序。

表4 基因型鑒定的PCR反應(yīng)體系

(5) F0(Founder)代大鼠基因型分析。PCR產(chǎn)物純化后可進(jìn)行Sanger測(cè)序。F0代大鼠可能是嵌合子通過(guò)Sanger測(cè)序時(shí)序列在接近靶點(diǎn)處會(huì)出現(xiàn)套峰，為便于分析可通過(guò)在線網(wǎng)站(https://ice.synthego.com)分析該嵌合子中可能存在的基因型(圖11)。

(6) 通過(guò)Founder大鼠與野生型大鼠交配可得到F1代雜合子。利用上述基因鑒定的方法再次鑒定F1代大鼠的基因型。利用相同基因型的F1代大鼠之間交配可以得到F2純合大鼠。

(7) 表型鑒定。對(duì)于不同基因編輯的大鼠模型，還需要建立相應(yīng)的表型鑒定方法。以本文構(gòu)建的B型血友病大鼠模型為例。F9基因參與體內(nèi)的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，F(xiàn)9基因缺失的大鼠將表現(xiàn)為凝血功能異常，并伴有關(guān)節(jié)腫大。我們對(duì)8周左右F2代純合型大鼠進(jìn)行觀察，可明顯觀察到F9敲除大鼠的關(guān)節(jié)腫大(圖12A)。眼眶取血后檢測(cè)大鼠的凝血酶原時(shí)間(prothrombin time, PT)與活化部分凝血活酶時(shí)間aPTT)，B型血友病大鼠模型的表型PT時(shí)間正常(表示外源性凝血途徑正常)，aPTT時(shí)間延長(zhǎng)(圖12B)。

3 結(jié)語(yǔ)

長(zhǎng)久以來(lái)，大鼠一直是實(shí)驗(yàn)室中很有價(jià)值的模式動(dòng)物，其較大的體型使其一度受到生理與藥理學(xué)研究者的青睞。然而由于早期缺乏大鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)手段以支持相應(yīng)的ES細(xì)胞打靶技術(shù)，使得大鼠的基因編輯動(dòng)物模型構(gòu)建在起步時(shí)落后于小鼠。直到ZFN、TALEN這兩種核酸酶技術(shù)出現(xiàn)之后，大鼠的胚胎編輯才得到了一定程度的改觀。但由于這兩種技術(shù)在載體構(gòu)建上都較為繁瑣，所以直到CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)以后，才真正實(shí)現(xiàn)了在大鼠胚胎內(nèi)進(jìn)行高效、靈活地進(jìn)行基因編輯。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)于不同的基因靶點(diǎn)只需合成相應(yīng)的引導(dǎo)RNA便能夠靈活地切換靶點(diǎn)，甚至實(shí)現(xiàn)同時(shí)編輯多個(gè)基因位點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)室曾利用該技術(shù)構(gòu)建了多種大鼠基因編輯疾病模型，包括高草酸尿癥模型[8]、酪氨酸血癥模型[9]、血友病模型等[10]。綜上所述，本文詳細(xì)介紹了如何利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因編輯大鼠模型，以及如何進(jìn)行常規(guī)表型的鑒定等步驟，為大鼠疾病動(dòng)物模型的構(gòu)建提供了一種簡(jiǎn)易且高效的方法，同時(shí)也讓大鼠這一經(jīng)典的模式動(dòng)物重新回到研究人員的視野，成為候選模式動(dòng)物。在實(shí)驗(yàn)顯微注射與胚胎移植的操作方面，大鼠的操作基本與小鼠一致，大鼠的體型更能從一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)的難度。需要注意的是，大鼠受精卵脫顆粒需要較長(zhǎng)時(shí)間；另外輸卵管口位置的囊膜上多數(shù)會(huì)有較粗的血管，需要小心避開(kāi)。

圖10 鑒定B型血友病大鼠模型的引物設(shè)計(jì)示意圖

P1為正向引物，P2為反向引物。

圖11 利用Sanger測(cè)序結(jié)果分析F0代B型血友病大鼠基因型

通過(guò)在線網(wǎng)站(https://ice.synthego.com)分析得出的F0代大鼠靶點(diǎn)區(qū)域所包含的基因型。

圖12 B型血友病大鼠模型表型鑒定

A：紅色箭頭所示位置為B型血友病大鼠自發(fā)性關(guān)節(jié)腫大；B：F9–/–大鼠PT與aPTT時(shí)間。n.s.：無(wú)顯著差異；***<0.001。

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[3] Qiu Z, Liu M, Chen Z, Shao Y, Pan H, Wei G, Yu C, Zhang L, Li X, Wang P, Fan HY, Du B, Liu B, Liu M, Li D. High-efficiency and heritable gene targeting in mouse by transcription activator-like effector nucleases., 2013, 41(11): e120–e120.

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[10] Guan Y, Ma Y, Li Q, Sun Z, Ma L, Wu L, Wang L, Zeng L, Shao Y, Chen Y, Ma N, Lu W, Hu K, Han H, Yu Y, Huang Y, Liu M, Li D. CRISPR/Cas9-mediated somatic correction of a novel coagulator factor IX gene mutation ameliorates hemophilia in mouse., 2016, 8(5): 477–488.

Generation of genetically modified rat models via the CRISPR/Cas9 technology

Meizhen Liu, Liren Wang, Yongmei Li, Xueyun Ma, Honghui Han, Dali Li

The RNA-guided CRISPR/Cas9 genomic editing system consists of a single guide RNA (sgRNA) and a Cas9 nuclease. The two components form a complex in cells and target the genomic loci complementary to the sgRNA. The Cas9 nuclease cleaves the target site creating a double stranded DNA break (DSB). In mammalian cells, DSBs are often repaired via error prone non-homologous end joining (NHEJ) or via homology directed repair (HDR) with the presence of donor DNA templates. Micro-injection of the CRISPR/Cas9 system into the rat embryos enables generation of genetically modified rat models. Here, we describe a detailed protocol for creating gene knockout or knockin rat models via the CRISPR/Cas9 technology.

rat; CRISPR/Cas9; genome editing; gene knockout

2022-11-10;

2022-12-23;

2023-01-01

國(guó)家自然科學(xué)基金杰出青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：32025023 )，國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：81873685，31971366)，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2019YFA0110802, 2019YFA0802802)，上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(編號(hào)：20140900200)和華東師范大學(xué)閔行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心平臺(tái)(011)項(xiàng)目資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.32025023, 81873685, 31971366), the National Key Research and Development Program of China (Nos.2019YFA0110802, 2019YFA0802802), the Shanghai Municipal Commission for Science and Technology (No.20140900200) and the Animal Center of East China Normal University (011)]

劉梅珍，碩士，工程師，研究方向：動(dòng)物模型構(gòu)建。E-mail: mzliu@bio.ecnu.edu.cn

王立人，博士，副研究員，研究方向：基因編輯。E-mail: lrwang@bio.ecnu.edu.cn

劉梅珍和王立人并列第一作者。

李大力，博士，教授，研究方向：基因編輯開(kāi)發(fā)及基因治療。E-mail: dlli@bio.ecnu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-354

(責(zé)任編委: 谷峰)