倪萌萌+許厚強+趙佳福+陳偉+桓聰聰+周迪
摘要:顯微操作針是顯微操作的必備工具,其制作的好壞直接影響到操作的成敗。介紹了利用拉針儀、斷針儀、磨針儀制備用于小鼠胚胎移植顯微操作的移卵針(moving pipettes)、注射針(injection pipettes)和持卵針(holding pipettes)的制作方法,以供實驗參考。
關鍵詞:顯微操作;移卵針;注射針;持卵針;制作方法
中圖分類號: Q-336 文獻標志碼: A
文章編號:1002-1302(2015)04-0226-03
收稿日期:2014-05-19
基金項目:貴州省科技重大專項(編號:黔科合重大專項字[2013]6008號);貴州大學青年教師科研基金(編號:貴大自青基合字[2012]010號)
作者簡介:倪萌萌(1989—),男,安徽鳳陽人,碩士研究生,研究方向為動物繁殖生物技術。E-mail: 237805700@qq.com。
通信作者:許厚強,教授,博士生導師,研究方向為畜禽種質(zhì)資源保存與創(chuàng)新利用。Tel:(0851)8292183;E-mail:
近20年來,DNA顯微注射技術已成為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中基因轉(zhuǎn)移的重要手段。而顯微操作針是應用于輔助生殖[1]、動物克隆[2]、轉(zhuǎn)基因動物的制備[3]和嵌合體動物制備[4]等方面的重要工具之一。顯微操作的成功與否與顯微操作針制備的好壞密切相關。目前購買成品針用于顯微操作成本太高,許多領域的特殊操作用針只能通過人工拉制,因此,多數(shù)實驗室傾向于自制顯微操作針。目前大多選擇購買拉針儀、斷針儀和磨針儀等儀器設備,自行拉制顯微操作針,從而可以對顯微針的參數(shù)進行精確的控制,獲得理想的實驗用針。本研究通過日本尼康NT88-V3型倒置熒光顯微操作儀,總結出適合該設備系統(tǒng)的顯微操作針制備方法,以供實驗參考。
1 材料與方法
1.1 儀器設備與材料
倒置熒光顯微操作儀(日本,尼康NT88-V3),水平拉針儀(日本,Narishige PN-30),磨針儀(日本,Narishige EG-44),斷針儀(日本,Narishige MF-900),微電極玻璃毛細管(外徑:1.00 mm,內(nèi)徑:0.70 mm)和微電極玻璃毛細管(外徑:1.00 mm,內(nèi)徑:0.66 mm),眼科鑷。
1.2 方法
1.2.1 制針用毛細玻璃管的準備 購買經(jīng)過硅化的毛細玻璃管時,需檢查是否經(jīng)過滅菌處理,多數(shù)商家提供的毛細玻璃管不用滅菌,拆開包裝就可直接使用,最好現(xiàn)用現(xiàn)拆,避免過早打開積累灰塵。但有些廠家的毛細玻璃管出廠前僅用75%乙醇處理,需要經(jīng)過以下處理才能使用:4% HCl浸泡 24 h,除去沾在管壁的污質(zhì),自來水沖洗至中性,用去離子水沖洗后浸泡0.5 h,烘干,75%乙醇浸泡24 h,去離子水沖洗,烘干,包裝后160 ℃干烤滅菌2.5 h[5]。
1.2.2 移卵針的制作 雙手持住一根10 cm的玻璃管(外徑:1.00 mm,內(nèi)徑:0.66 mm)兩端,將玻璃管的中部置于乙醇燈外焰,邊旋轉(zhuǎn)邊加熱,當玻璃管變軟時,迅速水平拉伸,回折至拉細處斷開,并在乙醇燈外火焰上快速拋光移卵針尖端 1~2 s,在體視顯微鏡下觀察針的尖端是否光滑,是否保持一定的內(nèi)外徑。理想的移卵針內(nèi)徑在150~200 μm之間為宜。使用時與口吸硅膠管連接。
1.2.3 注射針的制作 注射針的制備分5步:拉、斷、磨、拔、彎。
拉:使用水平拉針儀拉制。設定好拉針儀的3個參數(shù):熱度、主磁力、副磁力,戴一次性乳膠手套將微電極玻璃毛細管(外徑:1.00 mm,內(nèi)徑:0.70 mm)置于拉針儀“Ω”形鉑絲的中央,并擰緊兩邊的螺絲固定好。運行參數(shù),將拉出的針坯用眼科鑷放置在準備好的塑料泡沫針板上,待用。
斷:使用斷針儀水平斷針。首先在100倍視野下,將電熱絲及事先制作好的玻璃珠調(diào)至最清晰的位置,將拉好的針插入持針器內(nèi),并將其水平放置在支撐架上,在鏡下調(diào)清針的位置,水平調(diào)節(jié)針的位置使其斷針處的位置位于玻璃珠的正上方,踩下踏板接通電源,緩慢調(diào)節(jié)溫度旋鈕使鉑金絲和玻璃珠微微發(fā)紅時(約45 ℃),將針靠近并緊貼,此時,針會有微小的擺動,說明針與玻璃珠開始熔化粘連,松開腳踏板,這時電熱絲和玻璃珠冷卻會產(chǎn)生向下的拉力將針斷開。此時針口將被斷成一個斷面,要求斷面垂直、平滑、干凈(圖1、圖2)。
磨:用磨針儀滴水磨針。將斷好的針插入持針器里,擰緊螺絲后固定在磨針儀上,調(diào)好角度45°~50°,調(diào)節(jié)升降旋鈕,使持針器緩緩下降至針尖與磨石的平面剛好接觸,在磨針儀的注射器內(nèi)加適量的去離子水,使之均勻滴下,調(diào)節(jié)磨石的轉(zhuǎn)
速使水滴不被迅速甩掉為宜,這樣磨出的針比較干凈,6 min磨好1根。
拔:使用斷針儀垂直拔尖。首先在100倍視野下,將鉑金絲和玻璃珠調(diào)至最清晰的位置,將磨好的針插入持針器內(nèi),并將其垂直放置在支撐架上,在鏡下調(diào)清針并使針的位置位于玻璃珠的正上方,磨面正對操作者,踩下踏板接通電源,緩慢調(diào)節(jié)溫度旋鈕使鉑金絲略呈橘紅色(約50 ℃),緩慢下降針尖端,使其靠近玻璃珠并與之接觸,待針尖一接觸玻璃珠就迅速將針向上撤離,此時針尖被拉成一個短而銳利的尖,以利于穿刺進入卵母細胞胞漿膜。
彎:使用斷針儀水平彎針。把持針器調(diào)成水平放置,調(diào)清視野,針在玻璃珠的上方一段距離,踩下腳踏板接通電源,緩緩調(diào)節(jié)溫度,直至鉑金絲和玻璃珠呈橘黃色(約60 ℃),將玻璃珠緩緩向上面靠近玻璃針,同時觀察鏡中的標尺,達到所需要的角度(15°~20°)時,立即松開腳踏板,即成所需角度的注射針(圖3、圖4)。
1.2.4 持卵針的制作 持卵針制備分4步:拉、斷、燒、彎。
拉:同注射針拉針。
斷:同注射針斷針。endprint
燒:將已斷好針的斷面豎直或水平接近玻璃珠,相距 10 μm 左右,不可相互接觸,踩下踏板接通電源,并緩緩調(diào)節(jié)電熱絲的溫度(約60 ℃),鉑金絲和玻璃珠變橘黃色時,針管口內(nèi)徑慢慢回縮,用目鏡中的顯微標尺觀察尖端內(nèi)徑變化情況,直至內(nèi)徑為15~20 μm時松開腳踏板停止加熱,將溫度旋鈕調(diào)回“0”位置。此時持卵針內(nèi)徑大小合適,表面光滑(圖5、圖6)。
彎:同注射針彎針一樣,角度有所差別,一般在20°~30°較為適宜。
1.2.5 針的保存 若針管中有碎屑或灰塵,可用10%氫氟酸溶液沖洗5次,再用去離子水沖洗5次。將制作好的針存
放于75%乙醇清洗過的塑料盒中,固定存放。使用前用紫外線照射30 min 殺菌消毒。
2 討論與結論
轉(zhuǎn)基因小鼠的制作過程中包括許多關鍵步驟,而且每一步又有很多因素對轉(zhuǎn)基因小鼠制備的成敗產(chǎn)生影響,顯微注射是其中核心部分,除了顯微操作的速度、顯微操作的方法、培養(yǎng)液的成分、培養(yǎng)環(huán)境的溫度和pH值的穩(wěn)定等因素[6]外,拉針儀、斷針儀相關參數(shù)設置,斷針、磨針所采取的不同方式及顯微操作針拉制的好壞都會影響轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥某蓴 ?/p>
2.1 拉針儀相關參數(shù)設置對針坯的影響
筆者所在實驗室采用PN-30水平拉針儀(日本,Narishige)拉制顯微操作針,該儀器包括:heater(熱度)、magnet sub(副磁力)、magnet main(主磁力)3個參數(shù),根據(jù)制備針的不同選擇不同的參數(shù)組合。熱度主要是對玻璃管進行加熱,熱度越高,針拉得越快、針尖越長、針尖的口徑越細,數(shù)值范圍一般在70~85之間。主磁力決定針尖的細度,數(shù)值越高針尖越細,數(shù)值范圍一般在65~100之間。副磁力是決定針尖細部的長度,數(shù)值越高針尖口長度越長,數(shù)值范圍一般在22~57之間。這些參數(shù)是相互影響的,拉制針時調(diào)節(jié)一個參數(shù)其余固定,找到一個最合適的參數(shù),并固定下來。如熱度為85 ℃、主磁力為67.2、次磁力為23時,可拉制出長15~20 mm、內(nèi)徑10 μm 左右的操作針。
2.1.1 鉑金圈的形狀對針坯的影響 拉針儀上的鉑金圈很重要,其形狀如“Ω”形,表面要光滑呈圓弧形,如出現(xiàn)任何不規(guī)則的形狀都會影響拉制針的形狀。所以用眼科鑷取出拉制好的針坯時,要特別小心,不可觸碰到鉑金圈,避免外力改變其形狀,導致后續(xù)的工作無法正常進行。放置毛細玻璃管時,要固定在鉑金圈的中央,不接觸到其任何一邊,固定時要擰緊螺絲旋鈕,同時同向旋鈕,防止拉制時一邊沒固定好拉不斷毛細管,從而導致受熱不均,拉力不均,拉不出高質(zhì)量的針坯,此時的針尖端易彎翹、扭曲,影響使用。
2.1.2 鉑金絲上玻璃珠的位置、大小對注射針和持卵針拉制的影響 鉑金絲上玻璃珠的最佳位置是向上有個凸起、外徑80 μm左右為宜(圖7),玻璃珠太大或太小都易使針彎而不斷。玻璃珠往往在煅燒時容易熔化下垂,在鉑金絲下方出現(xiàn)凸起(圖8)或者鉑金絲上沒有玻璃珠(圖9),這2種情況都是不合適的,在斷針、燒針、彎針時容易受熱不均,導致針尖端的不平、針管的變形、針彎而不斷等,拉不出質(zhì)量好的針胚,影響使用。
2.2 斷針儀上不同處理方式和溫度選擇對顯微操作針拉制的影響
2.2.1 斷針方式及溫度控制對注射針和持卵針拉制的影響 使用斷針儀斷針方式分為水平斷針和垂直斷針2種,經(jīng)實踐比較,水平斷針效果優(yōu)于垂直斷針,垂直斷針因看不見玻璃珠和針管的接觸情況,往往會出現(xiàn)視野內(nèi)斷得較直,但是旋轉(zhuǎn)至水平后卻發(fā)現(xiàn)針是彎的。相比之下水平斷針就能避免這樣的問題,它能很好地看清玻璃珠與針管的接觸情況,在視野里能一目了然地觀察斷針情況。 較適宜斷針的溫度應為鉑金絲和玻璃珠微微發(fā)紅時(約 45 ℃)。溫度過高易使針管熔化粘連在玻璃珠上,而且斷的針尖端容易不平整、扭曲;溫度過低則無法把針拉斷。
2.2.2 拔尖的方式及溫度對注射針拉制的影響 拔尖采用水平拔尖或垂直拔尖皆可,要求針尖磨面正對操作者,針與玻璃珠要完全垂直,這樣拔出的尖才不會彎斜。 較適宜拔尖的溫度應為鉑金絲和玻璃珠略呈橘紅色(50 ℃左右)。溫度過高針尖拔得太細長、針口易皺縮熔化乃至封口;溫度太低,針尖拔得很短、不銳利乃至拔不出尖,還易把針拔斷。
2.3 磨針方式對注射針拉制的影響
使用磨針儀磨針的方式有2種:一種是加水磨針,一種是不加水磨針。經(jīng)過實踐比較,加水磨針效果優(yōu)于不加水磨針。不加水磨針,時間較快,但是針管內(nèi)會粘上玻璃碎屑和灰塵,需用氫氟酸和超純水清洗才能使用,比較麻煩;加水磨針,時間相對慢點,但磨出的針較干凈、可直接使用。
2.4 顯微操作針的評定標準
2.4.1 注射針 拉制的針應長5~8 cm,才能保證有適宜的注射用尖端。最好的注射針尖端的直徑應小于1 mm,內(nèi)徑在10~12 μm之間。在光學顯微鏡下無法看清,如果能在光學顯微鏡下看清注射針尖端的開口,則說明針尖端開口直徑過大,注射針開口太大則刺入原核就會很困難,注射后更多的受精卵會裂解;但是,如果開口太小,粉塵堵塞針尖的可能性就會增大。哪種大小的針最佳,必須要試不同規(guī)格的注射針以確定哪一種是最合適的。另外一個重要的參數(shù)即針尖部的錐度,這可以通過測量針的距尖端固定距離處的直徑來估計。在距注射針尖端50 μm處的直徑應為10~15 μm或更小。注射針的肩部到尖端的距離應為5~8 mm。Jeffrey等研究表明8 mm是最佳的[7]。如果這個距離過小,注射針的肩部會使針的尖端在注射小室的底部無法固定,從而影響注射的效果;如果針太長,注射時注射針在穿過厚的礦物油層時容易不穩(wěn)固而彎曲,從而導致注射失敗[8]。
2.4.2 持卵針 管尖端外徑和卵母細胞直徑相差不應超過10~30 μm。管口中央與卵母細胞中央應在同一水平線上,這樣在固定卵母細胞時就不會發(fā)生垂直方向上卵母細胞的運動。管口外徑不宜太大,否則卵母細胞不易按要求固定。在被固定前,垂直方向上的位置變動會導致極體位置變化。如果管口外徑太小,在去核時卵母細胞往往擺動,影響操作。持卵針內(nèi)徑開口在中間為最佳。要做到這一點,必須保持斷端平齊。理想形狀的固定針應是外徑100~120 μm、內(nèi)徑10~20 μm,兩邊對稱并光滑[9]。endprint
2.4.3 移卵針 針管斷面要求平齊、均一、光滑。拉制好的移卵針的外徑應為150 μm,略大于受精卵的透明帶直徑。
參考文獻:
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