張瑾，劉開會，張穎，郝金萍，張廣峰，徐小玉，暢晶晶，劉興朋，楊雪瑩，葉健

轉錄組分析在血液樣本時間和供體特征刻畫中的應用研究

張瑾1,2，劉開會2，張穎2，郝金萍2，張廣峰2，徐小玉2，暢晶晶2，劉興朋3，楊雪瑩2，葉健1,2

1. 中國人民公安大學，北京 100038 2. 公安部鑒定中心，北京 100038 3. 瑞金市公安局，瑞金 342500

案件現(xiàn)場生物物證信息深度挖掘與刻畫，可以為案件偵查、涉案人員查找提供豐富可靠線索，是當前法醫(yī)DNA檢驗的有效補充，也是國內外法庭科學的研究熱點之一。本研究以血液樣本為研究對象，證實了0～168天內離體血液樣本轉錄組變化的時間相關性，并建立隨機森林模型實現(xiàn)不同離體時間血液樣本分類。同時，進一步證實相同離體時間段內，不同吸煙習慣和不同性別供體來源的血液樣本轉錄本具有顯著差異，、和可以作為供體吸煙習慣判別標志，Y染色體非重組區(qū)(non-recombining Y, NRY)的轉錄本和可以作為供體性別特征判別標志。本研究為法庭科學領域建立基于轉錄組分析的血液樣本遺留時間和供體特征刻畫方法提供了理論基礎和實驗依據(jù)。

法庭科學；血液；遺留時間；吸煙習慣；性別

案件現(xiàn)場生物樣本是應用最為廣泛的物證種類之一，可以為案發(fā)過程重建、涉案人員查找提供重要線索。隨著生命科學技術和理論研究的不斷發(fā)展，生物物證核酸深度解析為涉案人員個體識別和親權鑒定提供了重要技術手段，如目前DNA STR分析已經成為對涉案人員進行比對的金標準[1,2]。面對案件復雜程度和犯罪手段的不斷“升級”，深入發(fā)掘物證信息，提升物證證據(jù)能力和證明力，已經成為法庭科學和公安技術發(fā)展的新趨勢。通過包括種族、身高、膚色、發(fā)質、骨骼、面部特征等在內的生物物證供體特征分析刻畫[3]，供體的香煙、毒品、藥物等攝入習慣刻畫[4]，供體生活時空信息刻畫[5]，以及生物物證遺留時間刻畫[6]，可以為案件偵辦提供更為直接、可靠、全面的偵查線索，為涉案人員的主動查找提供技術手段。

生物物證遺留時間(time since deposition, TSD)推斷，因其在案發(fā)時間分析、犯罪過程重建、犯罪主體甄別中的重要作用，近年來備受國內外法庭科學矚目。研究人員應用免疫電泳[7]、光學檢驗[8～15]、RNA降解程度分析[16～24]、DNA降解程度分析[25～27]、外源性核酸變化分析[28]等不同技術手段，從生物斑跡蘊含的蛋白質、核酸、微生物等不同角度，開展了生物斑跡遺留時間、生物節(jié)律等時間信息關聯(lián)關系和預測方法研究。已有研究證實，離體血液樣本轉錄本丟失具有時間相關性[29]。本研究收集制備了不同離體時間血液樣本，考察了血液轉錄組在不同離體時間段的變化情況，并分析比較了血液轉錄組在供體性別、吸煙習慣特征中的差異，證實了血液轉錄組在血液離體時間、供體吸煙習慣和供體性別分析鑒定中的應用潛力，為血液樣本時間和供體特征刻畫提供方法。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本采集與制備

采集無關健康漢族志愿者(男性10人，女性10人)外周血液樣本，EDTA抗凝處理后，在EDTA抗凝管中置于4℃恒溫密閉保存，于不同取樣時間點收集樣本檢測，取樣時間點包括新鮮采集(D0)和離體保存0.5天(D0.5)、1天(D1)、2天(D2)、4天(D4)、7天(D7)、14天(D14)、21天(D21)、28天(D28)、56天(D56)、84天(D84)、112天(D112)、140天(D140)、168天(D168)。實驗樣本分組和組內樣本數(shù)量見表1。本研究獲得公安部鑒定中心倫理委員會批準，所有志愿者均簽署知情同意書。

1.2 轉錄組測序

應用TRIzolTMReagent (Thermo Fisher, 美國)按照說明書方法分離純化血液樣本總RNA[30]，使用Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit (Illumina, 美國)去除核糖體RNA后，使用NEBNext?Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs, 美國)將RNA打斷至250～300 bp大小的片段，使用M-Mulv reverse transcriptase system (Thermo Fisher, 美國)反轉錄為cDNA，應用Agencourt AMPure XP (Backman Coulter, 美國)富集250～300 bp大小的cDNA片段，使用NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit (New England Biolabs, 美國)構建文庫，在Novaseq 6000 Sequencing System (Illumina, 美國)測序平臺上進行150 bp雙端測序[31,32]。下機raw data去除接頭、含N reads和低質量reads后獲得clean data，計算Q20(測序錯誤率<1%的序列百分比)、Q30(測序錯誤率<0.1%的序列百分比)。選用Hisat2 v2.0.4進行參考基因組(_Ensembl_97)定位[33,34]。選用HTSeq v0.9.1計算轉錄本FPKM (expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced)，即每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)目[35,36]。

表1 實驗樣本分組

吸煙組(smoker)及其對照組(control)樣本均來源于男性志愿者，入組吸煙組的志愿者均自述近2年有吸煙習慣、每日吸煙5支以上，入組對照組的志愿者均自述近2年無吸煙習慣；男性組(male)、女性組(female)、吸煙組(smoker)及其對照組(control)樣本均包含4℃恒溫密閉保存0～168天的樣本。

1.3 統(tǒng)計分析

使用Novomagic平臺(https://magic.novogene.com)進行主成分分析(principal component analysis, PCA)和差異轉錄本分析。使用Microsoft Excel 2010進行相對表達比(relative expression ratio, RER)計算、相對表達比分布分析和FPKM分布分析。使用Graph-pad 5.0進行置信區(qū)間(confidence interval, CI)統(tǒng)計。

1.4 隨機森林模型構建

使用R軟件randomForest包構建隨機森林模型，使用pROC包計算AUC值，通過important函數(shù)得到MDA(mean decrease accuracy)排序[37～39]。

2 結果與分析

2.1 測序質量與數(shù)據(jù)

各組樣本合計278個，均成功構建文庫并獲得轉錄組測序數(shù)據(jù)，raw reads、clean reads、Q20和Q30統(tǒng)計見表2。278個樣本平均獲得57 849 014.65條raw reads和56 644 226.98條 clean reads，堿基≥Q30占比平均為94.83%，比對到參考基因組的平均比對率為97.28%。

2.2 供體特征相關差異轉錄本

PCA可以應用方差分解提取數(shù)據(jù)的主要元素和結構，樣本轉錄組結構越相似，在PCA圖中的距離越接近，反之則距離越遠[40]。本研究應用主成分分析，考察不同離體時間血液樣本組間差異，結果表明，隨著血液樣本離體時間延長，樣本組間轉錄組差異逐漸增大，而同一時間段組內樣本則具有相近的轉錄組結構(圖1A)。同時，在針對吸煙組和對照組以及男性組和女性組的PCA分析中，樣本呈現(xiàn)與不同離體時間組相似的分布規(guī)律和形態(tài)，但并未表現(xiàn)出與吸煙特征或性別特征相關的分布差異(圖1，B和C)。這提示離體血液樣本轉錄組變化具有時間相關性，并且與吸煙和性別特征相比，時間特征對血液樣本轉錄組結構差異影響更為顯著，可以根據(jù)轉錄組結構差異刻畫血液樣本離體時間。

表2 測序質量與數(shù)據(jù)

根據(jù)不同離體時間血液樣本的分布特征，本研究進一步考察了相同離體時間下吸煙習慣和性別特征對血液樣本分布的影響。結果表明，在離體時間相同的血液樣本中，吸煙組與對照組樣本在0～2天、4～14天、21～56天時間段均呈現(xiàn)出不同程度的分散分布(圖1，D～G)，男性組與女性組也在0～2天、4～14天、21～56天、84～168天時間段分別呈現(xiàn)出不同程度的分散分布(圖1, H～K)，提示血液樣本轉錄組中可能存在可以用于吸煙習慣和性別特征判別的標志轉錄本。

通過差異表達分析，在吸煙組中發(fā)現(xiàn)差異轉錄本25個，其中上調差異轉錄本14個，下調差異轉錄本11個(圖2A，表3)。參考文獻[16]，根據(jù)以下方法計算差異轉錄本(differential expressed transcripts)與管家基因(house-keeping genes)和的相對表達比：

RER=FPKMdifferential expressed transcripts/

FPKMhouse-keeping genes

比較發(fā)現(xiàn)，上調轉錄本、和下調轉錄本與管家基因、的相對表達比(RER/ACTB、RER/GAPDH、RER/ACTB、RER/ACTB和RER/GAPDH)在吸煙組和對照組樣本中具有不同的分布區(qū)域(圖3)，可以作為樣本是否具有吸煙特征的判別標志。

同時，在女性樣本與男性樣本的差異表達分析中，共有差異轉錄本1577個(上調差異轉錄本1049個，下調差異轉錄本528個)(圖2B)。進一步分析差異轉錄本在基因組中的定位，定位于X染色體的差異轉錄本有65個，定位于Y染色體的差異轉錄本有18個，其中有7個轉錄本位于Y染色體非重組區(qū)(non-recombining Y, NRY)(表4)，這些轉錄本具有單倍體遺傳特性，可以用于男性性別鑒定[41]。對這些NRY轉錄本在男性、女性血液樣本中的FPKM進行統(tǒng)計，結果表明，NRY轉錄本在女性樣本中FPKM值均小于1，多數(shù)女性樣本中FPKM值為0(圖4)，可以應用NRY轉錄本的FPKM值進行性別特征判斷。

2.3 供體特征綜合分析

PCA結果表明，離體血液樣本轉錄組呈現(xiàn)不同離體時間段的分散分布。本研究應用隨機森林算法，隨機抽取70%的樣本作為訓練集，建立了不同離體時間血液樣本分類模型。交叉驗證結果表明，當mtry取值11、ntree取值900時，錯誤率最低，最低為5% (圖5A)，此時，根據(jù)MDA排序，獲得11個重要特征變量(表5)。同時繪制ROC (receiver opera-ting characteristic)曲線，計算ROC曲線下面積AUC (area under curve)，通常情況下，它的值介于1.0和0.5之間，當 AUC>0.5時，AUC越接近于1，模型分類預測性能越好。本研究建立的模型中，D0～2、D4～14、D21～56和D84～168各組樣本可以根據(jù)轉錄本FPKM很好區(qū)分(AUC＞0.75)，其中D21～56和D84～168組間可能存在少量誤判(AUC = 0.765)，與PCA分析結果一致(圖6，圖1A)。在剩余30%的樣本中進行測試，D0～2、D4～14、D21～56和D84～168各組分類正確率分別為92.31%、85.71%、76.92%和100% (表7；圖5，B和C)，表明基于血液樣本轉錄組的隨機森林模型可以有效實現(xiàn)不同離體時間血液樣本分類，為血液樣本離體時間刻畫提供方法。

圖1 主成分分析中的血液樣本分布

A：不同離體時間(0～2天、4～14天、21～56天和84～168天)血液樣本分布；B：0～168天時間段吸煙組(smoker)及對照組(control)血液樣本分布；C：0～168天時間段男性組(male)及女性組(female)血液樣本分布；D：0～2天時間段吸煙組(smoker)及對照組(control)血液樣本分布；E：4～14天時間段吸煙組(smoker)及對照組(control)血液樣本分布；F：21～56天時間段吸煙組(smoker)及對照組(control)血液樣本分布；G：84～168天時間段吸煙組(smoker)及對照組(control)血液樣本分布；H：0～2天時間段男性組(male)及女性組(female)血液樣本分布；I：4～14天時間段男性組(male)及女性組(female)血液樣本分布；J：21～56天時間段男性組(male)及女性組(female)血液樣本分布；K：84～168天時間段男性組(male)及女性組(female)血液樣本分布。坐標軸分別表示第一、第二、第三主成分，百分比則表示該主成分對樣品差異的貢獻值；圖中的每個點表示一個樣品，同一個組的樣品使用同一種顏色表示。

圖2 供體特征相關差異轉錄本

A：吸煙組(smoker)及對照組(control)差異分析火山圖；B：男性組(male)及女性組(female)差異分析火山圖。有顯著性差異表達的基因用紅色點(上調)和綠色點(下調)表示，無顯著性差異表達的基因用藍色點表示；橫坐標代表基因在不同樣本中表達倍數(shù)變化；縱坐標代表基因表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著性(|log2foldchange| > 0.5，-adjusted < 0.05)。

表3 吸煙特征相關差異轉錄本

表4 位于Y染色體非重組區(qū)的差異轉錄本

根據(jù)吸煙特征差異轉錄本與管家基因相對表達比分布，本研究選擇、和作為吸煙特征判別標志，計算吸煙組及其對照組血液樣本、和與管家基因和的相對表達比(RER/ACTB、RER/GAPDH、RER/ACTB、RER/ACTB和RER/GAPDH)，分別統(tǒng)計得出吸煙組和對照組基因相對表達比的置信區(qū)間，以≥lower 95% CI[上調轉錄組本(和)]和≤upper 95% CI[下調轉錄本()]作為“吸煙”特征的判斷標準，以≤upper 95% CI[上調轉錄組本(和)]和≥lower 95% CI[下調轉錄本()]作為“不吸煙”特征的判斷標準(表6)。隨機抽取10%樣本進行五次十折交叉驗證，正確率最高為92.31%、最低為46.15%，其中，RER/ACTB、RER/GAPDH和RER/ACTB五次交叉驗證平均正確率高于70%，具有較好的實踐參考意義(表7)。

圖3 吸煙特征判別標志轉錄本與管家基因相對表達比分布圖

3個吸煙特征判別標志轉錄本與管家基因相對表達比在對照組和吸煙組分布區(qū)域不同；藍色代表對照組(control)樣本相對表達比，黃色代表吸煙組(smoker)樣本相對表達比；D0～D168分別代表離體時間為0～168天的樣本FPKM平均值的相對表達比，total代表所有不同離體時間樣本FPKM平均值的相對表達比。

圖4 位于Y染色體非重組區(qū)基因FPKM分布

Male和female分別代表男性組和女性組；D0～D168分別代表離體時間為0～168天的樣本FPKM平均值，total代表所有不同離體時間樣本FPKM平均值。

圖5 隨機森林模型錯誤率分布與交叉驗證

A：隨機森林模型錯誤率分布矩陣圖；B：測試集各分組預測概率箱形圖；C：測試集的預測概率箱形圖。測試集的預測概率值(Prob)即為在不同分組的可能性，可能性最高的分組即為模型對該樣本的分類分組，當分類分組與樣本真實分組一致是，分類結果視為正確。

表5 隨機森林模型11個重要特征轉錄本

根據(jù)NRY轉錄本FPKM分布特征，本研究選擇在不同離體時間男性樣本中FPKM平均值均≥1的轉錄本和作為性別特征判別標志，分別以FPKM≥1和FPKM<1作為男性和女性判斷依據(jù)，隨機抽取樣本進行5次十折交叉驗證，正確率均為100% (表7)。

3 討論

生物物證是案件現(xiàn)場最為常見的物證之一，不僅可以通過法醫(yī)DNA STR檢驗為涉案相關個體識別、親子鑒定等提供重要線索，還蘊含著RNA、DNA和微生物等更為豐富的生物分子信息，可以為供體特征[3,42]、組織來源[43～47]、生活習慣[4,6]、年齡推斷[48]、時空信息[5]等的分析與刻畫提供重要依據(jù)。其中，在生物物證離體時間推斷領域，已有研究證實離體生物樣本中核酸降解變化具有時間相關性，并應用嵌套方差分析、邏輯回歸、一元二次回歸等模型建立了基于RNA降解的血液樣本離體時間分析方法。但由于樣本數(shù)量、觀測時間有限，以及DNA本身在較長時間內的穩(wěn)定性[49]、分子標記相對單一等，尚未建立確切的現(xiàn)場生物斑跡遺留時間分析方法。

圖6 隨機森林模型ROC曲線及AUC值

表6 特征判別標志及判別閾值

隨著RNA檢測技術的發(fā)展，研究人員認為，獲得更多的RNA標志片段，有望提升血液斑跡離體時間分析準確率，可以為建立血液斑跡時間分析方法提供更為可靠的基因信息。Katelyn等[29]應用轉錄組測序技術，證實血液樣本轉錄本丟失的時間相關性，并篩選出、、、作為目的片段，應用熒光定量PCR技術分別檢測其3′端和5′端含量變化，建立了基于、、3′端、5′端片段Cq值差值的離體時間線性回歸方程，在8份離體時間不超過1年的血液斑跡中測試，遺留時間推斷誤差不超過6周[24]。本研究同樣應用轉錄組測序技術，證實了隨離體時間延長，血液樣本中可檢測到的轉錄本(FPKM>1)數(shù)量下降且大量轉錄本的豐度呈現(xiàn)下降趨勢，與文獻報道一致。在此基礎上，本研究基于主成分分析進一步證實了離體血液樣本轉錄組變化的時間相關性，并應用隨機森林模型，在血液樣本中較好的實現(xiàn)以離體時間為要素的樣本分類(AUC>0.75)，同時發(fā)現(xiàn)、、、、、、、、、、等11個基因在隨機森林分類中貢獻度高，可能成為血液樣本離體時間分析的潛在基因標志。同時，本研究針對這些貢獻度高的轉錄本進行功能聚類分析，并未獲得具有統(tǒng)計學意義(<0.05)的功能通路，因此，這些轉錄本隨離體時間延長豐度下降且在模型分類中表現(xiàn)出更高的貢獻度，可能與已知的基因自身功能關聯(lián)較小，是否由mRNA降解方式[50]或組織降解相關功能導致，還需開展深入研究。

表7 樣本離體時間和供體特征分析交叉驗證結果

在證實了血液樣本轉錄組變化具有時間相關性的同時，本研究考察了相同離體時間段內供體性別特征、吸煙習慣相關的轉錄組水平差異。結果表明，NRY轉錄本和在不同離體時間男性樣本中FPKM平均值均≥1，在女性樣本中FPKM平均值均<1，十折交叉驗證正確率均為100%，可以作為血液樣本供體性別特征的判別標志。、和在吸煙組及其對照組中表達差異顯著(|log2foldchange| > 0.5，-adjusted < 0.05)，其與管家基因和的相對表達比在吸煙組及其對照組中具有不同分布。十折交叉驗證中，RER/ACTB、RER/GAPDH和RER/ACTB的平均正確率高于70%、正確率最高為92.31%，可以作為供體特征吸煙習慣的判別標志。、和，同屬于編碼人類主要組織相容性復合體(major histocom-pati-bility complex，MHC)的基因簇，定位于第6染色體，參與編碼MHC-II類分子，通過抗原加工提呈在機體免疫應答中發(fā)揮重要作用[51～53]。本研究對25個吸煙相關轉錄本進行功能聚類分析，獲得21個具有統(tǒng)計學意義(<0.05)的功能通路，其中包括類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、哮喘(asthma)功能通路。這與文獻報道中吸煙是類風濕性關節(jié)炎、哮喘發(fā)生的危險因素一致[53,54]，提示、和的表達改變，可能與吸煙影響機體免疫繼而誘發(fā)機體免疫功能障礙和相關疾病有關。而吸煙特征判別標志基因表達改變與吸煙相關的功能機制、煙草中哪些成分是基因表達改變的誘發(fā)因素仍需要深入研究，進而為供體吸煙特征判別方法的建立和刑事案件偵辦提供科學可靠的技術支撐。同時我們也注意到，與相比，和在吸煙特征判斷中的正確率較高，這可能與二者較高的FPKM值和在吸煙組中上調的表達方式有關，當然，不同差異轉錄本的吸煙特征判別效能還需要進一步研究評判。

本研究選取4℃恒溫密閉保存的EDTA抗凝血為研究對象，有效避免了環(huán)境溫度、濕度、微生物改變等導致的血液樣本轉錄組變化，客觀證實離體血液樣本轉錄組變化的時間相關性以及相同離體時間段內來源于不同吸煙習慣、性別特征供體的血液樣本在轉錄組水平的差異，為血液樣本時間分析和供體吸煙習慣、性別特征刻畫提供方法。同時，EDTA抗凝后4℃恒溫密閉保存，是酒精檢測、毒品檢測、毒物檢測、興奮劑檢測等血液樣本的標準保存方式，本研究建立的時間和供體特征分析方法可以為上述檢測中樣本采集時間和樣本來源爭議解決提供有效途徑。需要指出的是，環(huán)境溫度、濕度、光照、微生物等對于離體血液樣本核酸降解變化具有不可忽視的重要影響[55～57]，本研究僅考察了4℃恒溫密閉保存的EDTA抗凝血液樣本轉錄組與物證特征關聯(lián)關系，還需進一步研究不同溫度、濕度、光照條件下的血液樣本轉錄組變化，以適應不同環(huán)境案件現(xiàn)場物證刻畫需要。同時，在明確標志轉錄本與血液樣本時間和供體特征關聯(lián)關系的基礎上，研究建立樣本需求量小、實驗方法簡單、實驗周期短、與當前法醫(yī)DNA實驗室發(fā)展相匹配的標志轉錄本檢驗分析方法，實現(xiàn)更為廣泛、更具實踐應用價值的案件現(xiàn)場血液斑跡時間和供體特征刻畫，可以為案件偵辦和涉案人員的主動查找提供更為直接、可靠、全面的偵查線索和技術手段。

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Application of transcriptome in time analysis and donor characterization in blood samples

Jin Zhang1,2, Kaihui Liu2, Ying Zhang2, Jinping Hao2, Guangfeng Zhang2, Xiaoyu Xu2, Jingjing Chang2, Xingpeng Liu3, Xueying Yang2, Jian Ye1,2

Asan effective supplement to the current forensic DNA typing and one of the research hotpots in forensic science, the in-depth mining and characterization of biological evidence can provide rich and reliable clues for case investigation. In this study, the time-dependent variations of transcriptome were confirmed inblood samples within 0-168 days and a random forest model was established to realize the classification of blood samples with different TSD (time since deposition). Meanwhile, significant differences were observed in the transcripts of blood samples with different smoking habits and genders within a certain time period.,andwere identified as markers for smoking habit identification, while the transcripts forandfrom the non-recombining region of the Y chromosome (NRY) were identified as markers for male sex identification. Thus, this study provides a theoretical foundation and experimental strategy for establishing a transcriptome-based method for characterizing blood sample retention time and donor characteristics in the field of forensic investigation.

forensic science;blood; time since deposition; smoking habit; gender

2022-10-31;

2022-11-29;

2022-12-09

公安部技術研究計劃項目(編號：2017JSYJC22)，公安科技成果推廣引導計劃項目(編號：2020TGYDBGAES25)和中央級公益類科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(編號：2020JB008)資助[Supported by the Science and Technology Development Programs of Ministry of Public Security P.R.C (No. 2017JSYJC22), the Public Security Scientific and Technological Achievements Promotion and Guidance Programs of Ministry of Public Security P.R.C (No. 2020TGYDBGAES25), and the Basic research Funds for Public Welfare Research Institutes of the Central Government (No. 2020JB008)]

張瑾，在讀博士研究生，副高級警務技術任職資格，研究方向：法醫(yī)物證學。E-mail: zhangjin1101@126.com

楊雪瑩，博士，正高級警務技術任職資格，研究方向：法醫(yī)物證學。E-mail: yxystyhhp@163.com

葉健，博士，主任法醫(yī)師，研究方向：法醫(yī)物證學。E-mail: yejian77@126.com

10.16288/j.yczz.22-293

(責任編委: 朱波峰)