王曉龍，楊曌，來永才，李紅，鐘鵬，徐艷霞，柴華，李莎莎，吳玥，宋敏超，周景明

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈 161005；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院，黑龍江 哈爾濱 150086）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科牧草，具有產(chǎn)量高、抗逆性強、適應性廣等優(yōu)良特性，已成為奶牛等草食動物的優(yōu)質(zhì)飼草［1］。紫花苜蓿種植面積的不斷擴大，有利于積極推進“糧改飼”及“種養(yǎng)結合”模式試點，適當?shù)睦貌糠指貋矸N植青貯玉米（Zea mays）和紫花苜蓿，可以優(yōu)先滿足區(qū)域內(nèi)的飼草供求，進而促進苜蓿產(chǎn)業(yè)持續(xù)、健康、穩(wěn)定發(fā)展［2］。黑龍江省西部地區(qū)處于中溫帶，土壤肥沃，地勢平坦，水源充沛，擁有全省得天獨厚的黑土地資源，是發(fā)展苜蓿產(chǎn)業(yè)的重要區(qū)域，但由于該地區(qū)冬季低溫、暴雪、寒潮等極端天氣時有發(fā)生，苜蓿易遭受冷害或凍害威脅，導致苜蓿生產(chǎn)能力下降，越冬耐寒能力降低，對草牧業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)造成巨大損失［3］。因此，苜蓿根系的越冬問題一直是影響我國北方一些極寒地區(qū)苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關鍵問題。

秋眠性（fall dormancy）是苜蓿對晚秋環(huán)境（日照時數(shù)減少）變化的適應性反應，植株表現(xiàn)為由向上生長轉向匍匐生長，致使總產(chǎn)量減少的一種生長特性，它與產(chǎn)量和越冬性緊密相關，已經(jīng)成為北美評定苜蓿品種生產(chǎn)性能的重要參考指標［2］。根系是養(yǎng)分和水分吸收、運輸、存儲的主要功能組織［4-5］，特別是根系作為貯藏營養(yǎng)物質(zhì)和供給植株生長的重要器官［6-7］，其生長狀況直接影響苜蓿的生產(chǎn)性能及持久利用［8-9］。正是因為根系生長情況直接影響地上生物量，而根系形態(tài)結構又一定程度上決定了根系生長狀況［10］，所以通過探究苜蓿根系表型性狀來剖析苜蓿的生產(chǎn)能力及越冬性具有重要意義。大量研究表明，根系形態(tài)可以影響苜蓿的生物固氮［8］、水分利用率［11］、再生特性［12］及抗寒性［13］，尤其是對苜蓿能否多年可持續(xù)利用起關鍵作用。而在苜蓿根系形態(tài)結構中，靠近地面的根冠部為根頸，作為地上部分與根系的交接部位，其對低溫具有較強的耐受性，這可能與品種的遺傳特性及環(huán)境刺激等諸多因素有關［14］，但是關于苜蓿根系性狀對秋眠性及越冬抗寒性影響的報道卻較少，以前有過一些研究和評估方法，如通過標準主軸分析（standardized major axis，SMA）法，解析不同秋眠級苜蓿根系性狀在越冬過程中的差異化響應［3］，采用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）法，揭示根系性狀對不同秋眠級苜蓿越冬率的影響程度及抗寒效應的關鍵因子［15］。鑒于目前仍不清楚苜蓿根頸、根系表型性狀與秋眠性及越冬抗寒能力強弱的相互關系，本研究選取國內(nèi)外不同秋眠級的苜蓿品種為試驗材料，通過對苜蓿的地上、地下生物量、根系特征、越冬率及產(chǎn)量進行初步研究，力求探究苜蓿越冬耐寒性與根系特征和產(chǎn)量之間的關聯(lián)，旨在為培育耐寒苜蓿品種提供優(yōu)良種質(zhì)資源，為苜蓿耐寒種質(zhì)篩選提供參考與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于黑龍江省齊齊哈爾市富拉爾基科研基地，E 123°24′36″，N 47°09′00″，最高溫度38.5℃，最低溫度-39.5℃，年均氣溫3℃，積溫（≥10℃）為2722.1℃，年均降水量約480 mm，無霜期132 d左右。試驗地土壤為黑風沙土，有機質(zhì)含量19.89 g·kg-1，全氮1.19 g·kg-1，速效磷為10.60 mg·kg-1，速效鉀為124.84 mg·kg-1，pH為7.4。

1.2 試驗材料

選取國內(nèi)外苜蓿材料8份，包括國內(nèi)審定品種3份（草原3號、肇東、公農(nóng)2號），國外引進品種5份（馴鹿、金皇后、420、三得利、賽迪），所有供試苜蓿材料的品種名稱、秋眠級及來源信息見表1。

表1 供試苜蓿材料及來源Table 1 Source and materials of tested alfalfa

1.3 試驗設計

試驗小區(qū)面積為15 m2（3 m×5 m），2020年6月進行人工條播，行距30 cm，播種量15 kg·hm-2，采用完全隨機區(qū)組設計，重復3次，每小區(qū)種植10行，各小區(qū)之間留60 cm間隔。播前精細整地，以確保種子發(fā)芽一致。試驗期間實行常規(guī)田間管理，適時除草、病蟲害防治，越冬前灌水1次，灌溉定額為225～375 m3·hm-2。建植當年9月下旬采用壕溝法，每小區(qū)隨機選取30株重復，用鐵鍬挖取苜蓿根系，用自來水沖洗干凈并吸干水分，帶回實驗室進行根系表型性狀測量。2021年初花期（6月10日、7月20日、9月10日）進行3次刈割，留茬高度5 cm，測定產(chǎn)量。各項指標的具體測定方法如下：

采用根系分析系統(tǒng)（WinRHIZO）測量根系總長度、根頸體積、根尖數(shù)量等指標。

采用Marquez-Ortiz等［16］的方法測定根系形態(tài)性狀。根頸直徑：根頸膨大處直徑采用游標卡尺測量；根頸入土深度：測量從地表到根頸上端距離；主根直徑：根頸以下10 cm處主根直徑；側根數(shù)量：當距離主根0.5 cm處的側根直徑≥0.1 cm時，可計入側根總數(shù)量，當直徑＜0.1 cm時，則不計入總數(shù)量；側根直徑：一級側根距離主根2 cm處為側根直徑；側根位置：地表與第一個側根的距離；生物量：取30株單株苜蓿，分離莖稈（含葉片）和根系，在65℃烘箱內(nèi)烘干24 h，稱重后再烘6 h至恒重，即莖稈和根系干重。

產(chǎn)量：初花期測定每小區(qū)的鮮草產(chǎn)量，從刈割后苜蓿中稱取1.0 kg，3次重復，65℃烘箱內(nèi)烘干24 h，稱重后再烘6 h至恒重，折算每hm2產(chǎn)量。

越冬率：每小區(qū)隨機選取樣段3處，樣段長為1 m，越冬前及次年返青分別統(tǒng)計樣段中植株總數(shù)，越冬率（%）=返青的植株數(shù)量/越冬前植株的總數(shù)量×100。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，采用SAS 9.0軟件進行方差分析、相關性分析和主成分分析。

應用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法［17-18］對所測指標進行綜合評價，求各項指標隸屬函數(shù)值，若測定指標與苜蓿越冬耐寒性呈正相關，則

測定指標與越冬耐寒性呈負相關，則

式中：Fij為i草種j指標值；Xij為鑒定i草種j指標隸屬值；Ximax為所鑒定i草種j指標最大值；Ximin為所鑒定i草種j指標最小值。將i草種各項指標函數(shù)值進行累加，求平均值，均值越大則苜蓿品種耐寒性越強。最后將8個苜蓿品種的耐寒性進行比較，得出品種間抗寒強弱順序。

2 結果與分析

2.1 越冬率和根頸特征

由表2可知，不同品種之間越冬率存在顯著差異，以品種公農(nóng)2號、肇東和草原3號越冬率較高，分別為96.73%、95.48%、95.31%，顯著高于其他品種（P＜0.05）；其次是馴鹿、金皇后、420和三得利苜蓿，分別是越冬率最低（賽迪）苜蓿的3.12、2.74、2.38、2.32倍。整體上看，秋眠等級越高的品種，其越冬率越低。根頸是苜蓿重要的貯藏器官，其直徑大小是維持苜?？购芰Φ闹匾δ苄誀?。隨秋眠級的增加，根頸直徑、體積、入土深度均呈降低的變化趨勢。各品種根頸直徑為4.75～5.20 mm；根頸入土深度為2.88～3.17 cm；根頸體積為0.265～0.299 cm3。不同品種間根頸直徑、體積及入土深度差異較大，其中公農(nóng)2號和肇東苜蓿的根頸直徑、入土深度均顯著高于其他品種（P＜0.05）；公農(nóng)2號的根頸體積最大，肇東苜蓿（0.298 cm3）和草原3號（0.296 cm3）次之，賽迪苜蓿最小。

2.2 生物量

隨秋眠級的增加，苜蓿建植當年地上生物量變化的總趨勢表現(xiàn)為增高態(tài)勢。由表2可知，品種金皇后、三得利、賽迪和420地上生物量顯著高于公農(nóng)2號、草原3號和肇東苜蓿（P＜0.05），其中賽迪苜蓿地上生物量（37.59 g·plant-1）最高，尤其比地上生物量最低的公農(nóng)2號高1.25倍。各品種的根系生物量為20.55～30.05 g·plant-1，以品種金皇后的根系生物量最高，其次為三得利、賽迪和420苜蓿，與公農(nóng)2號相比分別增加了46.23%、42.19%、37.57%、25.01%。上述結果表明建植當年苜蓿地上生物量和根系生物量之間的關聯(lián)程度很高，隨秋眠等級增加，各品種的地上、根系生物量均表現(xiàn)為增加趨勢，秋眠等級較高的品種地上生物量較高，則相應的地下生物量也較高。

表2 不同苜蓿的地上、根系生物量、根頸特征和越冬率比較Table 2 Comparison of shoot biomass，root biomass，root crown characteristic and winter survival rate of different alfalfa

2.3 根系特征

苜蓿屬于直根系，是由主根和側根組成，在土壤狀況良好或地下水位偏低的地區(qū)，根系深達2～3 m。由表3可知，不同品種間根系長度、主根直徑和根尖數(shù)量差異較大，其中草原3號的根尖數(shù)量（2128.51）和根系長度（208.21 cm）最高，主根直徑以品種金皇后、賽迪、420和三得利較高，分別為4.55、4.41、4.38、4.25 mm，顯著高于其他品種（P＜0.05）。各品種間側根位置、側根直徑和側根數(shù)量也存在顯著差異，品種420、金皇后和賽迪的側根位置顯著高于其他品種（P＜0.05）；側根直徑以金皇后最大，比側根直徑最小的公農(nóng)2號高25.35%；草原3號的側根數(shù)量（3.20）最多，顯著高于其他品種（P＜0.05）。

表3 不同苜蓿的根系特征比較Table 3 Comparison of root characteristics of different alfalfa

2.4 產(chǎn)量

產(chǎn)量是苜蓿生產(chǎn)能力及耐寒適應性的綜合體現(xiàn)，為探究建植次年苜蓿產(chǎn)量對越冬性的響應，測定2021年苜?？偖a(chǎn)量，由圖1可知，各品種全年總產(chǎn)量為1465.28～12746.73 kg·hm-2，以肇東苜蓿產(chǎn)量最高，草原3號（11921.24 kg·hm-2）和公農(nóng)2號（11416.77 kg·hm-2）次之，賽迪苜蓿最低；在飼草產(chǎn)量構成中，第1茬產(chǎn)量為808.25～6311.06 kg·hm-2；第2茬為470.91～4870.21 kg·hm-2；第3茬為186.11～1565.45 kg·hm-2，由此看出，第1茬產(chǎn)量明顯高于第2和3茬。第1茬苜蓿產(chǎn)量占全年總產(chǎn)量的44%～56%；第2茬占32%～45%；第3茬占10%～13%。第1茬產(chǎn)量中，草原3號和肇東苜蓿顯著高于其他品種（P＜0.05），第2和3茬產(chǎn)量中，肇東苜蓿的產(chǎn)量均為最高，與其他品種相比差異顯著（P＜0.05）。該結果表明，品種產(chǎn)量高低可充分反映苜蓿耐寒性強弱，耐寒性強的品種越冬率較高，建植次年第1茬苜蓿產(chǎn)量較高，說明苜蓿產(chǎn)量與越冬率之間具有一定的相關性。

圖1 不同苜蓿產(chǎn)量比較Fig.1 Comparison of yield of different alfalfa

2.5 綜合評價分析

相關性分析結果表明，苜蓿的越冬率與根頸直徑、入土深度之間存在顯著正相關（P＜0.05），相關系數(shù)為0.797、0.756，說明苜蓿根頸直徑越大、入土越深，則苜蓿的越冬耐寒能力越強。苜蓿根頸直徑與根頸體積、入土深度之間存在顯著或極顯著正相關，相關系數(shù)0.821和0.979，表明品種的根頸直徑越大，則根頸入土越深。苜蓿越冬率與根系生物量呈顯著負相關（-0.762；P＜0.05），與產(chǎn)量呈極顯著正相關（0.956；P＜0.01），說明秋眠級越高的苜蓿品種地下生物量越大，其越冬能力越弱，則翌年越冬存活植株數(shù)越少、產(chǎn)量越低（表4）。

主成分分析是將12項指標轉化成3個綜合指標（F1、F2、F3）來彌補單一指標對苜?？购栽u價的不足，根據(jù)累積貢獻率≥85%原則，第一主成分（F1）特征值為7.019，貢獻率58.50%，特征向量中數(shù)值較大的指標為根頸體積（0.368）、越冬率（0.331）和側根數(shù)量（0.313）；第二主成分（F2）特征值為2.146，貢獻率17.89%，對應特征向量主要表現(xiàn)在根頸直徑（0.321）、入土深度（0.349）和主根直徑（0.386）。第三主成分（F3）特征值為1.223，貢獻率10.19%，數(shù)值較大的指標是根系長度（0.522）和側根直徑（0.614）。上述3個主成分的累積貢獻率達86.58%，基本包含所測指標的大部分信息（表5）。

表5 主成分分析Table 5 Principal component analysis

通過對12項指標進行相關性及主成分分析，篩選出根頸直徑、入土深度、根頸體積、根系長度、主根直徑、側根直徑、側根數(shù)量、越冬率作為評價耐寒種質(zhì)材料的重要參考指標。采用隸屬函數(shù)法對不同苜蓿品種的抗寒性進行綜合評價，最終得出8個苜蓿品種的抗寒強弱順序依次為：肇東（0.848）＞公農(nóng)2號（0.666）＞草原3號（0.650）＞金皇后（0.551）＞馴鹿（0.505）＞420（0.366）＞三 得 利（0.293）＞賽 迪 （0.268）（表6）。

表6 不同苜蓿各項指標隸屬函數(shù)分析Table 6 Analysis of the membership function of different alfalfa indexes

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3 討論

紫花苜蓿的抗寒性既受自身遺傳因素影響，又與生長環(huán)境緊密相關。本研究發(fā)現(xiàn)，不同秋眠級苜蓿品種的越冬率存在明顯差異，秋眠等級低的肇東、公農(nóng)2號和草原3號越冬率均大于95%，而秋眠等級較高的品種如420、三得利、賽迪（fall dormancy 4～7）越冬率卻較低，盧欣石［19］通過對國內(nèi)審定苜蓿品種（23個）及地方品種（92個）的秋眠等級進行研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿秋眠級別與其耐寒能力強弱有直接關系，這與Wang等［20］和Brummer等［21］研究得出的規(guī)律相一致，說明秋眠等級低的品種越冬能力強，更適應當?shù)睾涞臍夂颦h(huán)境［2］，究其原因可能與苜蓿根系中積累了較多的棉子糖和氨基酸（如蘇氨酸、組氨酸、脯氨酸和甘氨酸）有關［22］。盡管秋眠性與抗寒性在一定程度上存在關聯(lián)，但二者并不屬于同一性狀，今后可以利用雜交育種方法將弱秋眠和強抗寒基因重新組合，進而選育出弱秋眠耐寒性強的新品種。

根系不僅具有養(yǎng)分和水分吸收、運輸、貯藏功能，而且還是與越冬或抗寒性密切相關的主要功能器官［16］。在寒冬氣候條件下，不同苜蓿根系性狀表現(xiàn)出對冬季寒冷的不同響應，本研究所有供試品種中，主根直徑對秋眠等級的響應尤為突出，隨著秋眠級的升高，主根直徑顯著增大，這與徐大偉［23］的研究結果相一致。隨著秋眠級升高，建植當年苜蓿根系生物量呈現(xiàn)逐步增高的變化趨勢，且與越冬率呈較強的負相關，說明秋眠等級高的品種秋季根系貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)有向主根深處轉移的傾向，致使主根過度消耗營養(yǎng)物質(zhì)用于根系繼續(xù)生長，導致根系總生物量增加，越冬率下降。側根則呈現(xiàn)相反的規(guī)律，品種的側根數(shù)量與越冬率呈顯著正相關，這與Smith［24］的研究結果趨于一致，說明抗寒品種具有較多的側根。同時Johnson等［25］研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿品種由秋眠型至非秋眠型，側根數(shù)量呈從多到少的變化趨勢，原因在于側根數(shù)量越多，則越有利于苜蓿從土壤中吸收較多水分和養(yǎng)分元素來供給越冬植株對營養(yǎng)物質(zhì)的需求。另外，隨側根位置的加大即側根距離地表越遠，品種的越冬率呈下降趨勢，可能由于越冬前地上莖葉組織的營養(yǎng)物質(zhì)向地下深處轉移，而轉移的養(yǎng)分則在地下表現(xiàn)為逐級遞減的規(guī)律，即側根位置越靠下吸收的養(yǎng)分就越少，越冬率下降。本研究所用品種的根長、主根直徑、根尖數(shù)、側根直徑與越冬率之間均未達到顯著相關，說明根系表型特征并不是判定苜蓿抗寒能力強弱的關鍵因子，而抗寒性強弱還取決于根頸性狀［26］。

根頸為連接植物莖部與根部的過渡結構，是連接地上部和地下部的關鍵部位，對低溫的反應較為敏感，與苜蓿越冬及返青密切相關。本研究表明，隨著秋眠級升高，根頸直徑呈下降趨勢，秋眠性較強的品種更傾向于增大根頸直徑，這與劉志英［15］的研究結果基本一致，呈現(xiàn)這種變化規(guī)律可能與生長時期、遺傳特性和環(huán)境因子的相互作用有關。相關性分析結果表明，根頸直徑與越冬率呈現(xiàn)出很強的正相關，耐寒能力強的品種如肇東苜蓿、草原3號、公農(nóng)2號根頸直徑較大，可見根頸對低溫有較強的適應性［27］。為適應寒冬，秋眠性較強的品種通過增大根頸直徑來抵御低溫，而秋眠性較弱甚至非秋眠型品種根頸直徑增粗幅度較小，抗寒性較弱［23］。韓清芳等［28］研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿的秋眠性還與根頸入土深度緊密相關，秋眠級越低的品種根頸入土深度越深，同時抗寒性與根頸入土深度也存在一定的關聯(lián)，如抗寒性較強的公農(nóng)2號和肇東苜蓿根頸入土較深，即抗寒品種根頸入土深度增加，越冬耐寒能力增強［4，28］。由此得出，苜蓿越冬率與根頸的大小及入土深度密切相關，根頸越大、根頸入土深度越深，則翌年苜蓿的越冬率越高。

產(chǎn)量是衡量苜蓿生產(chǎn)性能的重要指標，不同品種在同一生態(tài)區(qū)的產(chǎn)量存在明顯差異［20］，本研究中，品種肇東、草原3號和公農(nóng)2號的產(chǎn)量明顯高于其他品種，而秋眠等級為4～7級的420、三得利、賽迪苜蓿不僅越冬率較低，而且產(chǎn)量較低，表明品種的越冬率與秋眠性和產(chǎn)量之間存在很強的正相關，而秋眠等級為2～3級的馴鹿和金皇后苜蓿的產(chǎn)量亦較低，這與王曉龍等［2］和Malinowski等［29］的研究結果相一致，說明品種的秋眠等級與生產(chǎn)能力并無必然關聯(lián)，究其原因可能與該地區(qū)氣候、土壤及品種的遺傳特性有關，因而秋眠等級并不是影響苜蓿產(chǎn)量的關鍵因子，而確定適合的種植（播種量、行距、播種深度）及收獲（刈割時期、刈割高度）因子才是決定苜蓿高產(chǎn)的主要因素［29-31］。有研究指出，產(chǎn)草量因刈割茬次不同而差異明顯，苜蓿第1茬產(chǎn)量對全年總產(chǎn)量貢獻率大于第2和3茬［32］。本研究結果也得出同樣規(guī)律，產(chǎn)量表現(xiàn)為第1茬＞第2茬＞第3茬，各茬苜蓿產(chǎn)量占全年總產(chǎn)量比例分別為50%、38%、12%，說明第1茬產(chǎn)量對苜蓿全年總產(chǎn)量十分重要，即使第1茬苜蓿的生長受到冬春季低溫影響，但對全年總產(chǎn)量貢獻仍最大，因此做好第1茬苜蓿田間管理是實現(xiàn)增產(chǎn)的關鍵。

4 結論

1）通過相關性及主成分分析確定根頸直徑、入土深度、根頸體積、根系長度、主根直徑、側根直徑、側根數(shù)量、越冬率可作為評價耐寒種質(zhì)材料的重要參考指標。

2）苜蓿品種由秋眠型、半秋眠型至非秋眠型，越冬率呈現(xiàn)逐步下降的變化；建植當年苜蓿主根直徑和根系生物量呈現(xiàn)增高的變化；側根數(shù)量呈現(xiàn)由多到少的變化趨勢；根頸直徑和根頸入土深度表現(xiàn)為下降的變化趨勢。

3）采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法評價得出8個不同秋眠等級苜蓿抗寒性強弱順序為：肇東＞公農(nóng)2號＞草原3號＞金皇后＞馴鹿＞420＞三得利＞賽迪。

4）綜合比較得出公農(nóng)2號、草原3號和肇東苜蓿的產(chǎn)量和越冬性均表現(xiàn)較好，較適宜黑龍江省西部地區(qū)種植推廣。