張彩霞，方香玲

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

草類植物主要包括以紫花苜蓿（Medicago sativa，簡(jiǎn)稱苜蓿）、沙打旺（Astragalus adsurgens）、三葉草（Trifolium）和柱花草（Stylosanthes guianensis）等為主的豆科牧草以及以燕麥（Avena sativa）、黑麥草（Loliumperenne）和草地早熟禾（Poa pratensis）等為主的禾本科牧草。病害一直是草類植物生產(chǎn)和畜牧業(yè)發(fā)展的主要限制性因素［1-2］。草類植物病害主要包括白粉病、銹病、炭疽病、霜霉病、枯萎病和根腐病等，病害不僅造成產(chǎn)量的損失和品質(zhì)下降，而且還會(huì)導(dǎo)致草地衰退。如白粉病造成燕麥年產(chǎn)量損失5%～10%［3］；由根腐病造成的苜蓿產(chǎn)量損失約20%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)60%［4］。化學(xué)防治是病害防治的有效途徑，但是對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重且對(duì)人畜健康造成巨大威脅，使其應(yīng)用受到限制?？共∑贩N的開(kāi)發(fā)利用是防治病害最經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境友好的方法［5］，但是目前缺乏高抗品種資源和抗病基因，無(wú)法給抗病育種提供抗性資源。因此研究草類植物的抗病機(jī)理，尋找廣譜和特異性抗病因子是草類植物可持續(xù)生產(chǎn)的重要手段。

植物中存在多種抗性機(jī)制，如組織結(jié)構(gòu)抗性和生理生化抗性等。植物細(xì)胞表面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)主要通過(guò)形成物理障礙阻止病原菌的侵染和進(jìn)一步擴(kuò)散；同時(shí)植物還產(chǎn)生一些化學(xué)物質(zhì)如皂角苷、酚類化合物等抑制病原菌的定殖［6］。病原菌侵染植物時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）迸發(fā)、過(guò)敏反應(yīng)、植物的解毒作用以及信號(hào)傳遞，植物通過(guò)不斷產(chǎn)生一系列化合物來(lái)抑制病原菌的侵入和定殖，形成抑菌活性物質(zhì)殺死病原菌以及形成酶類物質(zhì)消除致病因子［7-8］。此外，在小麥（Triticum aestivum）中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)基因以及后期提出的“基因?qū)颉奔僬f(shuō)為植物的抗病性遺傳研究奠定了基礎(chǔ)［9］。利用抗病基因（R）介導(dǎo)的抗病性進(jìn)行抗病育種是控制病害和減少產(chǎn)量損失的綠色防控策略?？共』蛑袉位蚩剐园@性、部分顯性和隱性等類型，這些基因多數(shù)僅僅對(duì)一種病原菌和一個(gè)小種發(fā)揮作用，但是目前由于新病原小種的出現(xiàn)使得抗性不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致抗病基因的作用消失。因此需要不斷地篩選抗病種質(zhì)資源，不斷地將新的抗病基因應(yīng)用到抗病育種中。因此研究草類植物的抗病分子機(jī)制是目前進(jìn)行抗病育種的重要條件。但是目前關(guān)于分子抗病機(jī)制的研究主要集中在糧食作物小麥和水稻（Oryza sativa）以及模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物中。對(duì)于草類植物的抗病機(jī)制研究相對(duì)較少，已開(kāi)展的研究主要集中在少量的豆科和禾本科草類植物對(duì)白粉病、銹病、炭疽病、霜霉病、枯萎病和根腐病抗性等方面。本研究主要從植物組織結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)植物抗性等生理生化、抗性基因以及抗性數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTLs）定位等分子方面綜述草類植物抗病機(jī)制的研究進(jìn)展。

1 植物組織結(jié)構(gòu)

植物組織結(jié)構(gòu)可以抵抗病原菌的侵入和擴(kuò)展，其中蠟質(zhì)層和氣孔是植物抵御病原菌侵入的最外層防線。蠟質(zhì)層主要通過(guò)防止植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外滲，可以有效地抑制病原菌孢子的萌發(fā)從而阻止許多潛在病原菌的附著和侵入［10］。如白粉病菌侵染蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）時(shí)，葉片表面分泌物影響葉片潤(rùn)濕性和通氣性等從而影響孢子的萌發(fā)和入侵［10］。其次，蠟質(zhì)層還通過(guò)影響植物表面的疏水性，不利于孢子的停滯從而有效地減少病原菌的侵染［11］。氣孔是許多葉部病害病原菌入侵植物的主要途徑，如銹菌通過(guò)氣孔并形成附著胞侵入蒺藜苜蓿［12］。組成氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞是主動(dòng)識(shí)別病原菌的具有高度保守性的結(jié)構(gòu)分子，在真菌侵染植物過(guò)程中，植物保衛(wèi)細(xì)胞能夠識(shí)別幾丁質(zhì)寡糖從而引起氣孔關(guān)閉，阻止病原真菌的入侵［13］。另一方面，病原真菌在入侵過(guò)程中導(dǎo)致幾丁質(zhì)寡糖脫乙?；?yōu)闅す烟牵砻鲙锥≠|(zhì)脫乙?；赡苁遣≡婢种茪饪钻P(guān)閉的生存策略之一［13］。其次氣孔數(shù)量和密度等也是主要的抗侵入因素，如沙打旺對(duì)黃矮根腐?。‥mbellisia astragali）、草地早熟禾和黑麥草等對(duì)禾草離蠕孢（Bipolaris sorokiniana）引起的葉枯病抗性與氣孔密度呈負(fù)相關(guān)，氣孔數(shù)量越少的品種抗性越強(qiáng)［14-15］。也有研究表明氣孔密度和長(zhǎng)度與抗性無(wú)關(guān)，如關(guān)于苜蓿白粉病在田間自然發(fā)病條件下以及室內(nèi)苗期接種的研究，表明不同品種間氣孔密度和長(zhǎng)度差異不顯著［16］。

2 生理生化機(jī)制

2.1 活性氧迸發(fā)

植物被病原菌侵染的早期防御反應(yīng)之一是ROS的迅速增加。一方面ROS在植物與病原菌互作中具有直接殺死病原菌抵抗微生物活性的作用［17］；也可參與植物細(xì)胞壁木質(zhì)化及富含羥脯氨酸糖蛋白的交聯(lián)，使細(xì)胞壁強(qiáng)化，抵御病原菌的入侵；還可以誘導(dǎo)寄主細(xì)胞過(guò)敏性壞死，參與植物細(xì)胞程序性死亡過(guò)程。另一方面ROS可以作為信號(hào)分子直接或間接地激活抗性基因和防衛(wèi)基因表達(dá)［18］，主要表現(xiàn)為超氧陰離子自由基（O2-）和過(guò)氧化氫（H2O2）等含量的突增。病原菌侵染觸發(fā)過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）的產(chǎn)生。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是抵御活性氧的第一道防線，能夠清除自由基O2-，快速將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損害［19］。使用SOD、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）等活性氧清除劑處理則可有效地抑制植物中植保素的合成與積累［20］。H2O2在植物抵抗病原菌侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與植物的抗病反應(yīng)過(guò)程。如施加外源H2O2可以提高沙打旺對(duì)黃矮根腐病病原埃里磚格孢（E.astragali）的抗性，表明H2O2與沙打旺抗病性緊密相關(guān)，并通過(guò)調(diào)節(jié)病程相關(guān)酶活性來(lái)增強(qiáng)沙打旺對(duì)黃矮根腐病的抗性，減少侵染率［21］。研究發(fā)現(xiàn)H2O2對(duì)卵菌根腐絲囊霉（Aphanomyces euteiches）侵染蒺藜苜蓿的體外生長(zhǎng)沒(méi)有不利影響，且對(duì)卵菌根腐絲囊霉沒(méi)有直接的抗菌作用，但是參與根周圍細(xì)胞壁的強(qiáng)化，防止病原菌侵入維管組織。如通過(guò)接種卵菌根腐絲囊霉測(cè)定蒺藜苜?？剐云废怠癆17”和易感品系“F83005.5”根部的H2O2、SOD、POD、可溶性酚類和木質(zhì)素含量，H2O2水平與抗病品種的POD和木質(zhì)素的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)［22］。ROS可以創(chuàng)造不適宜病原菌生存和繁殖的環(huán)境，H2O2還刺激細(xì)胞壁木質(zhì)化和糖蛋白交聯(lián)，從而增強(qiáng)細(xì)胞壁抵抗入侵的病原菌。此外，H2O2和一氧化氮（NO）可誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因的表達(dá)，如苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PR）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）基因的表達(dá)［23］。

2.2 過(guò)敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）和系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）

植物在病害脅迫下進(jìn)化出多種防御機(jī)制，過(guò)敏反應(yīng)是一種早期防御反應(yīng)。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，被侵染部位以局部組織迅速壞死的方式來(lái)阻止病害擴(kuò)散。HR是一種特定類型的程序性細(xì)胞死亡。通過(guò)產(chǎn)生ROS、細(xì)胞壁修飾或抗菌蛋白和化合物來(lái)阻止病原菌進(jìn)一步定殖。如苜蓿對(duì)炭疽病的抗性表現(xiàn)為病原菌侵染后強(qiáng)烈的HR，抗病和易感品種在接種炭疽病菌（Colletotrichum trifolii）72 h內(nèi)，孢子萌發(fā)并在表皮細(xì)胞壁的連接處形成黑色的附生體。植物通過(guò)形成乳突和增厚與附著體接觸的細(xì)胞壁對(duì)接觸角質(zhì)層的穿透釘作出反應(yīng)。細(xì)胞質(zhì)中酚類化合物的產(chǎn)生以及細(xì)胞壁中木質(zhì)素和木栓質(zhì)的沉積可能會(huì)阻止真菌酶在穿透細(xì)胞中擴(kuò)散，從而保護(hù)相鄰細(xì)胞［24］。在抗炭疽病的蒺藜苜蓿品種“Jemalong 6”中，伴隨著ROS和酚類化合物的產(chǎn)生而發(fā)生HR，與植物防御、植物抗毒素產(chǎn)生有關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)［25］。Kemen等［26］對(duì)113份蒺藜苜蓿種質(zhì)抗性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明在銹菌（Uromyces striatus）侵入后，抗性品種表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞死亡反應(yīng)，一些種質(zhì)通過(guò)發(fā)展壞死病變表現(xiàn)出HR。此外，對(duì)銹病表現(xiàn)廣譜抗性的蒺藜苜蓿品種的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于抗性品種在早期可以終止銹菌菌落的生長(zhǎng)從而限制吸器的形成，且在一些品種中可以檢測(cè)到與侵染菌絲相關(guān)的宿主細(xì)胞壞死而表現(xiàn)出抗性［27］。另一方面，植物表現(xiàn)出可誘導(dǎo)的防御機(jī)制來(lái)抵御病原菌的侵染。研究表明，當(dāng)病原菌侵染植物后，SAR的激活依賴于較高水平的內(nèi)源性水楊酸（salicylic acid，SA）和一系列PR蛋白的激活［28］，并伴隨著一系列抗病和防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)，如病程相關(guān)蛋白PR1和NPR1。其中PR1蛋白是SA介導(dǎo)的SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，NPR1基因是植物抗病基因表達(dá)和系統(tǒng)獲得性抗性中的一個(gè)關(guān)鍵基因，其表達(dá)量的變化會(huì)直接影響植物對(duì)病原菌的抵抗能力［29］。

2.3 內(nèi)源激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

水楊酸、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET）是植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的信號(hào)分子［30］。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列與抗病相關(guān)的反應(yīng)，激活植物的防御能力并且誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，JA和ET等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物抗病中發(fā)揮重要作用。SA在活體營(yíng)養(yǎng)型和半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抗性反應(yīng)中起著核心作用，其受體主要有NPR1，NPR3和NPR4［31］，SA通過(guò)誘導(dǎo)植物相關(guān)PR蛋白基因PR1、PR2和PR5的產(chǎn)生，PR2具有β-1，3-葡聚糖酶活性，能催化β-1，3-葡聚糖多聚體水解，可對(duì)真菌的菌絲壁直接進(jìn)行攻擊，從而使植物產(chǎn)生SAR［32-33］。如噴施SA后接種立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）可以使草地早熟禾抗性基因PR1和NPR1的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，從而使植物獲得抗性［33］。此外，SA可作為胞外信號(hào)分子抑制CAT活性而引起H2O2水平上升。一方面，H2O2含量增加導(dǎo)致一系列基因的表達(dá)，從而激發(fā)植物的抗病性。另一方面，誘導(dǎo)植物抗病性酶活性和促進(jìn)植物木質(zhì)素含量增加從而激發(fā)植物的抗病性［34］。如外施SA誘導(dǎo)苜蓿體內(nèi)POD和PAL活性從而提高對(duì)霜霉病的抗性，還可以提高匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）對(duì)鐮刀菌枯萎病和高羊茅（Festuca arundinacea）對(duì)彎孢霉葉斑?。–urvularia lunate）的抗性［35-36］。

JA和ET參與植物對(duì)腐生病原菌的抗性反應(yīng)，與SA存在拮抗作用［37］。外源JA作為廣譜的生理效應(yīng)因子和抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中重要的信號(hào)分子，參與植物對(duì)病原菌的應(yīng)答，激發(fā)植物的防御系統(tǒng)從而誘導(dǎo)植物的抗病反應(yīng)達(dá)到提高植物抵御病原菌侵入的能力。如外源JA處理苜蓿葉片后，再接種病原菌匍柄霉（Stemphylium botryosum）和莖點(diǎn)霉（Phoma medicaginis），可以誘導(dǎo)苜蓿產(chǎn)生抗病性［38］。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是茉莉酸的衍生物，外施MeJA能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，促進(jìn)PR的積累和植保素的合成，改變抗病相關(guān)的防御酶活性。如MeJA可以增強(qiáng)PAL、POD和SOD活性，降低由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的苜蓿根腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)［39］，增加草地早熟禾葉片SOD、POD、CAT、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和PAL酶活性，提高活性氧清除的能力，使草地早熟禾的抗病性增強(qiáng)［40］。植物在受到病原菌侵染后乙烯的釋放量增加，并且能夠調(diào)節(jié)一些抗病基因或蛋白的表達(dá)。Anderson等［41］通過(guò)研究乙烯信號(hào)通路在防御立枯絲核菌和其他根部病害中的作用發(fā)現(xiàn)，立枯絲核菌侵染蒺藜苜蓿后，野生型A17的乙烯和茉莉酮酸酯響應(yīng)的GCC盒（AGCCGCC）啟動(dòng)子被激活，但在突變型skl中未被激活，同時(shí)在野生型A17中乙烯反轉(zhuǎn)錄因子（ethyleneresponse factors，ERFs）的B-3亞組表現(xiàn)上調(diào)。因此，蒺藜苜蓿對(duì)立枯絲核菌的抗性增強(qiáng)主要表現(xiàn)為B-3 ERF，MtERF1-1基因的過(guò)表達(dá)。

3 植物的解毒作用

植物的解毒作用是病原菌侵染后誘導(dǎo)的主動(dòng)保衛(wèi)反應(yīng)，能夠代謝病原菌產(chǎn)生的植物毒素，將毒素轉(zhuǎn)化為無(wú)毒物質(zhì)，降低病原菌的毒性，抑制病原菌在植物組織中的定殖，增強(qiáng)抗病性。此外，植物在解毒過(guò)程中產(chǎn)生的羥基化合物可以誘導(dǎo)植物植保素合成，表明植物抗病機(jī)制是解毒作用和激發(fā)植保素的合成［42］。目前在作物小麥抗赤霉病菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中研究較多［43］，在草類植物燕麥和苜蓿中有少量報(bào)道。如維多菌素（victorin）是燕麥葉枯病菌（Helminthosporium victoriae）產(chǎn)生的寄主特異性毒素，利用燕麥葉枯病菌產(chǎn)生的維多菌素處理燕麥抗病和感病品種，12 h后感病品種胚芽鞘細(xì)胞破裂，停止鈍化毒素，但是抗病品種繼續(xù)保持鈍化能力；24 h后抗病品種胚芽鞘中毒素含量?jī)H為感病品種的1/30［44］。此外，苜蓿素（medicarpin）在抗疫霉根腐病中發(fā)揮重要作用，可以抑制疫霉菌（Phytophthora medicaginis）的生長(zhǎng)［45］。植物抗毒素的產(chǎn)生可能會(huì)殺死菌絲產(chǎn)生抗性。有研究發(fā)現(xiàn)炭疽病菌侵染苜蓿時(shí)，苯丙烷途徑中基因的上調(diào)與抗性植物中苜蓿素和大蒜素（allicin）的增加有關(guān)［46］。

植物產(chǎn)生的初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物在植物防御過(guò)程中發(fā)揮不同的作用，初級(jí)代謝產(chǎn)物作為信號(hào)可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，而次級(jí)代謝產(chǎn)物不僅可以作為誘導(dǎo)抗性的信號(hào)，還可以作為誘導(dǎo)下游抗菌物質(zhì)生成的信號(hào)，直接參與對(duì)病原菌的抑制［47］。植物初級(jí)代謝產(chǎn)物有蔗糖、果糖、脯氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸等。植物體內(nèi)的糖可以提供病原菌生長(zhǎng)所需的能量，也可通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分使病原菌獲得較少的養(yǎng)分，最終導(dǎo)致病原菌適應(yīng)低營(yíng)養(yǎng)的狀態(tài)來(lái)提高植物抗病性［48］。脯氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸分別通過(guò)強(qiáng)化細(xì)胞壁、參與多種代謝物合成以及黃酮類物質(zhì)、細(xì)胞壁木質(zhì)素等一些抗病相關(guān)的代謝物前體來(lái)提高植物的抗病性［49］。次級(jí)代謝產(chǎn)物SA和JA等作為重要的信號(hào)物質(zhì)，激活植物獲得系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)苯丙酸的代謝物，使木質(zhì)素在細(xì)胞壁上沉積，阻止病原菌的侵入［50］。此外，次級(jí)代謝產(chǎn)物異黃酮和紫檀堿生物結(jié)合物的抗毒素前體可以提高鷹嘴豆（Cicer arietinum）對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性［51］。

4 抗病基因和數(shù)量抗性位點(diǎn)

植物的抗病性主要包括由單個(gè)或多個(gè)抗?。≧）基因控制的質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性，其中數(shù)量抗性具有廣譜性和持久性［52-53］。目前已從大麥（Hordeum vulgare）、水稻和番茄（Lycopersicon esculentum）等重要作物中分離出針對(duì)各種病原菌的R基因［54］，但是大多數(shù)R基因在模式植物擬南芥中研究較為深入。定性顯性基因主要對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型和半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌產(chǎn)生抗性，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)完全抗性或質(zhì)量抗性的基因。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，利用數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）可以定位多種病害，QTLs定位是借助遺傳連鎖圖譜，利用表型性狀與連鎖圖譜上的分子標(biāo)記連鎖關(guān)系，將控制表型的位點(diǎn)定位在該連鎖圖譜的某個(gè)區(qū)段內(nèi)，并對(duì)QTLs進(jìn)行遺傳效應(yīng)的評(píng)估［55］。主要集中在水稻、大麥、小麥和玉米（Zea mays）等作物上［56-58］。此外，模式植物蒺藜苜蓿越來(lái)越多地用于對(duì)卵菌根腐絲囊霉，炭疽病菌和莖點(diǎn)霉等病原菌抗性的研究［22，59-60］?？共』蚴桥嘤剐云贩N的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，但草類植物病害抗性基因研究比較薄弱，僅在抗性基因克隆、定位以及相關(guān)分子標(biāo)記方面有報(bào)道。主要集中在苜蓿、蒺藜苜蓿、紅三葉（Trifolium pratense）等少數(shù)豆科牧草以及燕麥、多年生黑麥草和草地早熟禾等禾本科牧草（表1和表2）。

4.1 抗病基因

4.1.1 豆科牧草抗病基因 豆科牧草抗病基因的研究主要集中在炭疽病、枯萎病、霜霉病和根腐病等病害（表1）。炭疽病病原主要有三葉草炭疽菌、毀滅炭疽菌（Colletotrichum destructivum）和長(zhǎng)孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）等［61-62］。苜蓿抗病品種“Arc-1”和“Saranac AR”接種炭疽菌小種1號(hào)和小種2號(hào)的抗性遺傳表明，“Arc-1”對(duì)小種1號(hào)的抗性受顯性基因An1的控制，而“Saranac AR”對(duì)小種1號(hào)和小種2號(hào)的抗性受顯性基因An2的控制［63］。以蒺藜苜蓿品種“Jemalong A17”作為抗性親本進(jìn)行F2代作圖群體，鑒定出對(duì)三葉草炭疽菌小種1號(hào)具有抗性的單個(gè)顯性基因RCT1，RCT1是TIR-NBS-LRR家族基因，位于蒺藜苜蓿4號(hào)染色體上，對(duì)RCT1進(jìn)行克隆，連鎖標(biāo)記鑒定了5個(gè)NLR基因，RCT1是蒺藜苜蓿中對(duì)三葉草炭疽菌多個(gè)小種都具有抗性的基因，轉(zhuǎn)移到易感紫花苜蓿植物中時(shí)賦予廣譜炭疽病抗性［64］。因此，RCT1為開(kāi)發(fā)抗炭疽病的苜蓿品種提供了新資源。盡管從抗病蒺藜苜蓿品種“Jemalong A17”中克隆了RCT1的同源物，但它與An1的關(guān)系以及在抗病中的作用尚不清楚。利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和cDNA末端擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）分子標(biāo)記技術(shù)從柱花草克隆出抗炭疽病有關(guān)的PAL基因，且在抗病品種中的表達(dá)量高于感病品種。此外，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)挖掘出柱花草抗炭疽病苯丙氨酸解氨酶基因SgPAL1，可以通過(guò)提高下游次生代謝產(chǎn)物含量增強(qiáng)柱花草對(duì)炭疽病的抗性［65］。

通過(guò)cDNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（cDNA-AFLP）、微陣列和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）方法研究鷹嘴豆與尖孢鐮刀菌鷹嘴豆專化型1號(hào)小種（F.oxysporumf.sp.Cicerirace 1，F(xiàn)oc1）引起的枯萎病的相互作用。cDNA-AFLP方法確定編碼蔗糖合酶、轉(zhuǎn)化酶和β-淀粉酶的基因在抗性相互作用中被誘導(dǎo)，14-3-3基因在易感品種中過(guò)度表達(dá)，表明存在潛在的營(yíng)養(yǎng)饑餓，而抗性相互作用可能通過(guò)過(guò)度誘導(dǎo)糖代謝基因來(lái)應(yīng)對(duì)這種糖饑餓，表明糖還充當(dāng)響應(yīng)病原菌感知的信號(hào)分子。使用cDNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（cDNA-RAPD）方法進(jìn)行鷹嘴豆與Foc 1、2和7號(hào)的相互作用研究確定了植物葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因在抗性反應(yīng)中的作用［66］。蒺藜苜蓿接種卵菌根腐絲囊霉后的RIL群體（分別命名為L(zhǎng)R3和LR5）受不同基因的控制，如接種同一致病型的兩種不同卵菌根腐絲囊霉菌株，LR3群體中的表型抗性受顯性單基因AER1控制并且是控制蒺藜苜蓿根腐絲霉抗性的主要基因［67］，而LR5群體的表型抗性受隱性基因prAe1控制［24］。從苜蓿品種“Vernal”和“Lahontan”中確定了抗病基因?qū)σ呙垢〔≡秩揪哂羞^(guò)敏反應(yīng)［68］。這些植物材料中的易感性受具有不完全顯性的單一基因Pm制約，已在植物中鑒定出多種病害易感基因，所有促進(jìn)侵染和支持病原菌定殖的植物基因都可以被認(rèn)為是易感基因，易感基因的突變或缺失會(huì)限制病原菌的致病力，從而導(dǎo)致植物具有廣譜抗病性［69］。也有研究發(fā)現(xiàn)抗性是由隱性基因Pm控制［70］。在二倍體和四倍體紫花苜蓿植物中，抗性受兩個(gè)顯性互補(bǔ)基因Pm1和Pm2的限制［71-72］；在四倍體植物中鑒定了另外兩個(gè)不同的顯性抗性基因Pm5和Pm6［73］。研究表明苜蓿對(duì)霜霉病（Peronospora trifoliorum）的抗性遺傳受一個(gè)不完全顯性的四倍體遺傳基因Dm和5個(gè)抗霜霉病苜?；騊tR1～5的影響［74-75］。

4.1.2 禾本科牧草抗病基因 目前禾本科牧草抗病基因主要集中在白粉病和銹病等病害（表1）。Pm4和Pm7基因是燕麥對(duì)白粉病的高抗基因，而Pm1、Pm3和Pm6基因控制的抗性無(wú)效［76］。顯性抗病基因Eg-3存在于燕麥栽培品種“Rollo”與六倍體燕麥品種“Mostyn”中［77］，此外還鑒定出其他顯性抗病基因Eg-1和Eg-5［78］。通過(guò)SCAR-BG8標(biāo)記篩選出燕麥抗白粉病顯性基因OMR1、OMR2和OMR3［79］。對(duì)于抗銹病研究的禾草植物主要有燕麥抗冠銹病和早熟禾抗禾柄銹菌［80-82］。采用分子標(biāo)記的方法鑒定出100多個(gè)燕麥冠銹病抗病基因，其中96個(gè)為Pc基因，大多數(shù)Pc基因是顯性的，有少數(shù)是部分顯性和隱性，抗性可以由兩個(gè)或多個(gè)次要基因累加起作用［83］。目前挖掘出的單個(gè)Pc基因由于生理小種的出現(xiàn)使得品種在短時(shí)間內(nèi)可以喪失抗性而表現(xiàn)出短效性，如培育出含有Pc38、Pc39、Pc48、Pc53、Pc54、Pc58、Pc68、Pc71、Pc91和Pc94等抗病基因的品種，其中Pc54基因?qū)Υ蟛糠止阡P病菌（Puccinia coronata）具有抗性，與其他Pc基因結(jié)合能夠有效地提高抗性［84-85］。隨后發(fā)現(xiàn)了燕麥抗稈銹病基因Pg1～4、Pg6、Pg8～13、Pg15～16和Pg19，其中Pg9和Pg13基因?qū)ι硇》NNA3和NA7具有普遍抗性，但隨著生理小種6AF、C10和NA27的出現(xiàn)，抗性逐漸下降［86-87］。此外也有研究發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)燕麥稈銹病抗病基因的表達(dá)有顯著影響，Pg1和Pg2隨溫度升高抗病性下降，Pg10對(duì)溫度的變化較為穩(wěn)定，而其他基因均表現(xiàn)低溫抗病性［88］。甘露等［82］對(duì)草地早熟禾及其矮化突變材料接種稈銹病菌（Puccinia graminis）的抗病機(jī)理研究表明，抗病基因PR1和NPR1誘導(dǎo)12 h后的表達(dá)量顯著提高，說(shuō)明矮化突變植株對(duì)禾柄銹菌的敏感性更強(qiáng)。多項(xiàng)研究表明，PR1和NPR1基因是調(diào)控植物抗病性的關(guān)鍵基因，其表達(dá)量的變化會(huì)直接影響植物對(duì)病原菌的抵抗能力，其中NPR1基因是植物防御免疫的關(guān)鍵調(diào)控因子，該基因的過(guò)量表達(dá)均使植物增強(qiáng)了對(duì)病原菌的抗性［29］。如禾柄銹菌侵染草地早熟禾后可以使得PR1L、NPR1L基因的轉(zhuǎn)錄水平提高以及PRs蛋白表達(dá)情況發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)PR1L、NPR1L基因在病菌誘導(dǎo)12 h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到了峰值，且在矮化突變植株中的相對(duì)表達(dá)量均大于其在對(duì)照植株中的表達(dá)量［82］。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組挖掘結(jié)縷草（Zoysia japonica）感染立枯絲核菌引起的褐斑病，NCED基因差異表達(dá)調(diào)控植物內(nèi)源ABA的合成并進(jìn)一步參與植物抗病機(jī)制［89］。

4.2 數(shù)量抗性位點(diǎn)QTLs

4.2.1 豆科牧草QTLs 蒺藜苜蓿QTLs的研究主要集中在白粉病、春季黑莖病和黃萎病等病害（表2）。蒺藜苜蓿接種豌豆白粉菌（Erysiphe pisi）后，白粉病的抗性涉及3個(gè)不同的位點(diǎn)，分別為4號(hào)染色體上的Epp1和5號(hào)染色體上的Epa1和Epa2［1］。關(guān)于其他豆科牧草相關(guān)研究表明，利用紅三葉對(duì)白粉病高感和抗病品種雜交F1代為作圖群體，采用AFLP技術(shù)構(gòu)建7個(gè)連鎖群，檢測(cè)到5個(gè)抗白粉病相關(guān)的QTLs位點(diǎn)，其中qrp-5位于LG5，其余位點(diǎn)均位于LG4；5個(gè)QTLs位點(diǎn)均為正效應(yīng)，其中qrp-1為主效QTL，因此qrp-1被確定為控制紅三葉白粉病抗性的主要候選基因［94］。蒺藜苜蓿對(duì)春季黑莖病的一個(gè)抗病和兩個(gè)不同易感品種之間進(jìn)行雜交揭示了抗性的QTL，兩個(gè)基因座分別為位于LG4和LG8的rnpm1和rnpm2［60］，其中rnpm1與一組toll/interleukin1受體核苷酸結(jié)合位點(diǎn)富含亮氨酸重復(fù)序列基因和抗病蛋白基因緊密相連。蒺藜苜蓿利用基因分型測(cè)序產(chǎn)生的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphism，SNP）的單劑量等位基因，構(gòu)建了抗病和感病親本的高密度連鎖圖譜，鑒定了與黃萎病抗性相關(guān)的5個(gè)QTLs，它們位于4個(gè)LG（4D，6B，6D和8C）上。其中3個(gè)QTLs（qVW-6D-1，qVW-6D-2和qVW-8C）的賠率對(duì)數(shù)（LOD score）最高。在qVW-6D-2和qVW-8C的區(qū)間中，分別鑒定了2個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)富含亮氨酸重復(fù)抗病基因的推定候選基因［95］。使用蒺藜苜?？剐云贩N“F83005.5”和易感品種“A17”的重組自交系（RIL）群體接種到馬鈴薯（Solanum tuberosum）分離株LPP0323中研究抗黃萎病的QTL，確定了4個(gè)QTLs［96］。對(duì)蒺藜苜?？共『鸵赘衅贩N接種苜蓿輪枝菌（Verticillium alfalfae）早期的根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，抗性品系在接種后具有更高的防御相關(guān)基因表達(dá)［97］。在3個(gè)RIL群體中進(jìn)行了蒺藜苜蓿黃萎病抗性遺傳作圖的研究，確定了3個(gè)QTLs（MtVa1、MtVa2和MtVa3），這些QTLs在群體“A17”和“DZA45.5”中賦予對(duì)黑白輪枝菌（Verticillium albo-atrum）的抗性，主效QTL位于親本“A17”的LG7上，附加QTL位于親本“DZA45.5”的LG2和LG6上［98］，表型和遺傳分析表明，蒺藜苜蓿群體對(duì)黃萎病存在不同的抗性機(jī)制。

表2 草類植物數(shù)量性狀位點(diǎn)Table 2 Quantitative trait locus of herbaceous plants

4.2.2 禾本科牧草QTLs定位 對(duì)于禾草抗病基因定位的研究相對(duì)較少，主要集中在燕麥、多年生黑麥草（表2）。研究通過(guò)燕麥作圖群體中鑒定出2個(gè)抗冠銹病QTLs（Pcq1和Pcq2），其中Pcq1是控制田間成株期抗性的主要QTL，單獨(dú)存在時(shí)在幼苗期不會(huì)產(chǎn)生抗性，但是當(dāng)Pcq1與Pcq2結(jié)合時(shí)，會(huì)起到增強(qiáng)幼苗抗性的作用［99］。使用連鎖作圖和QTLs分析多年生黑麥草種群中的抗病性，揭示了4個(gè)參與抗冠銹病的基因組區(qū)域，其中2個(gè)QTLs位于LG1（LpPc4和LpPc2），2個(gè)位于LG2（LpPc3和LpPc1）［100］。在燕麥冠銹病部分抗性的數(shù)量性狀基因座的研究中，通過(guò)感病品種“Noble-2”和抗性品種“MN841801-1”雜交的F6燕麥重組自交系群體中生成了遺傳圖譜。該圖譜使用AFLP標(biāo)記，檢測(cè)到4個(gè)抗銹病的主要QTLs，Prq1a、Prq1b、Prq2和Prq7，以及3個(gè)次要QTLs，Prq3、Prq5和Prq6。

5 問(wèn)題與展望

5.1 抗病種質(zhì)資源和廣譜抗病基因的缺乏

目前從已有的抗病品種中選擇高抗品種是抗病育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。但是隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)改變和草地生態(tài)環(huán)境的復(fù)雜性，導(dǎo)致病害種類較多且不同生態(tài)區(qū)同一病害的致病種群結(jié)構(gòu)存在較大差異，造成篩選出的抗病種質(zhì)資源在推廣方面存在較大的區(qū)域性及不確定性。目前針對(duì)重要的草類植物克隆的抗病基因由于病原小種的出現(xiàn)抗性減弱，從而限制在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，這導(dǎo)致在育種過(guò)程中常選擇抗性效果最好的基因進(jìn)行利用，從而出現(xiàn)大面積長(zhǎng)期使用單一基因?qū)Σ≡a(chǎn)生持續(xù)的選擇壓力，使得菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)化產(chǎn)生新的病原菌和小種，最終導(dǎo)致品種喪失抗性。實(shí)現(xiàn)寄主廣譜抗性的常見(jiàn)策略是修改R基因介導(dǎo)的抗性狹窄病原菌的特異性。此外，由于病原菌出現(xiàn)的變種或小種，使得單個(gè)抗病基因?qū)共〈嬖谝欢ǖ南拗?，為抗病品種的選育帶來(lái)很大困難。因此在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)該明確抗病蛋白識(shí)別病原菌信號(hào)激發(fā)免疫的分子機(jī)制，同時(shí)應(yīng)該監(jiān)測(cè)病原菌群落結(jié)構(gòu)與地理環(huán)境之間的關(guān)系以及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，合理輪換使用不同生理小種的抗病基因，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)草類植物的持久抗性。

5.2 建立抗病基因鑒定技術(shù)和加快基因克隆

目前草類植物可利用的抗病基因很少，因此急需開(kāi)發(fā)新技術(shù)加快抗病基因的分離。隨著高通量基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和目的基因遺傳的深度分析，草類植物如苜蓿、蒺藜苜蓿、百脈根（Lotus corniculatus）以及鷹嘴豆的全基因組信息被解析，研究豆科牧草抗病基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化關(guān)系，可以為豆科植物抗病基因研究奠定比較基因組學(xué)基礎(chǔ)。基因編輯技術(shù)在植物抗病性研究中已經(jīng)得到高度重視，為植物的病害抗性研究提供越來(lái)越多的靶點(diǎn)，通過(guò)實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的精準(zhǔn)修飾加速抗病品種的選育。因此可以利用全基因組關(guān)聯(lián)分子技術(shù)與克隆技術(shù)相結(jié)合，加快抗病基因的分離效率。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及轉(zhuǎn)錄因子克隆可以提高草類植物的抗病性。如通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含抗真菌病害的幾丁質(zhì)酶基因Chi和β-1，3-葡聚糖酶基因Glu導(dǎo)入高羊茅愈傷組織細(xì)胞內(nèi)，可以提高高羊茅對(duì)禾谷鐮刀菌引起的病害抗性［101］。