劉福，陳誠(chéng)，張凱旋，周美亮*，張新全

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院，四川 成都 611130；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

日本百脈根（Lotus japonicus）是一種百脈根屬豆科牧草，與百脈根（Lotus corniculatus）、細(xì)葉百脈根（Lotus tenuis）和濕地百脈根（Lotus uliginosus）等百脈根屬植物親緣關(guān)系很近［1］。日本百脈根完整的遺傳圖譜、EST序列和參考基因組已經(jīng)建立，在其響應(yīng)不同環(huán)境變化、與微生物共生方面有較深入的研究［2-4］。百脈根屬的牧草品種在土壤貧瘠地區(qū)具有較好的適應(yīng)性，耐熱性強(qiáng)，是溫涼濕潤(rùn)地區(qū)的優(yōu)良豆科牧草［5］。干旱脅迫嚴(yán)重影響植物生產(chǎn)，引起牧草生產(chǎn)力和品質(zhì)的顯著下降。因此，挖掘日本百脈根抗旱耐旱的關(guān)鍵基因，從分子水平上揭示日本百脈根抗旱機(jī)制，對(duì)培育百脈根屬抗逆品種，促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

干旱脅迫會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和生產(chǎn)力產(chǎn)生不利影響，當(dāng)植物受到其脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答機(jī)制來(lái)消除或減弱干旱造成的傷害；而這些應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生涉及多個(gè)基因、多種信號(hào)途徑及不同的代謝產(chǎn)物，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控在這個(gè)過(guò)程中起承上啟下的作用［6-8］。一些被廣泛研究的轉(zhuǎn)錄因子AP2、bZIP、NAC、NF-Y和bHLH在遭受干旱脅迫時(shí)都會(huì)顯著上調(diào)［9］。其中bHLH類轉(zhuǎn)錄因子是存在于所有真核生物中的一類轉(zhuǎn)錄因子，因其表達(dá)蛋白序列含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域高度保守，大約包含60個(gè)氨基酸，一般由兩個(gè)在功能上完全不同的區(qū)域組成：堿性區(qū)域和螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，常以二聚體的形式行使功能；除了存在bHLH結(jié)構(gòu)域之外，bHLH家族蛋白往往還包含了其他的功能結(jié)構(gòu)域如ZIP結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在蛋白與蛋白相互作用、蛋白二聚化中發(fā)揮作用［10-12］。

研究表明，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫，例如蘋果（Malus pumila）MdCIB1（cryptochrome-interacting bHLH 1）與MdCRY2互作，參與藍(lán)光響應(yīng)和開(kāi)花時(shí)間調(diào)控，該基因也受聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)MdCIB1的蘋果愈傷組織對(duì)PEG處理的耐受性增強(qiáng)，同時(shí)在擬南芥中（Arabidopsis thaliana）異位表達(dá)MdCIB1提高其抗旱性，表現(xiàn)為在干旱脅迫下根系較長(zhǎng)、抗氧化酶活性增強(qiáng)等［13-14］。對(duì)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子參與植物非生物逆境脅迫調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能從氣孔發(fā)育、根毛形成及對(duì)脫落酸（abscisic acid，ABA）的敏感性等方面參與植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)［15-17］。擬南芥bHLH122轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫下的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上調(diào)，通過(guò)GUS（β-glucuronidase）分析顯示其表達(dá)部位主要在維管組織及保衛(wèi)細(xì)胞；在干旱條件下，過(guò)量表達(dá)bHLH122會(huì)使植物體內(nèi)的ABA含量升高，同時(shí)bHLH122過(guò)表達(dá)擬南芥相比野生型擬南芥對(duì)干旱脅迫有更好的耐受性［18］。在擬南芥中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子RD22和AtAIB的表達(dá)量受ABA和PEG誘導(dǎo)，同時(shí)與野生型擬南芥相比，過(guò)表達(dá)RD22和AtAIB植株對(duì)干旱脅迫的耐受性更強(qiáng)［17，19］。擬南芥AtbHLH34受非生物脅迫調(diào)控，在甘露醇和ABA處理下上調(diào)；同時(shí)過(guò)表達(dá)AtbHLH34能增加擬南芥對(duì)滲透脅迫的耐受性，對(duì)外源ABA的敏感性低于野生型和RNA沉默株系［20］。水稻（Oryza sativa）OsbHLH148基因的表達(dá)量受茉莉酸、ABA、極端溫度和干旱脅迫的誘導(dǎo)，在水稻中過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)化植株對(duì)干旱的抗性［21］。

干旱是影響環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素，盡管bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物耐旱性方面的研究報(bào)道很多，但針對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子家族在日本百脈根抗旱方面的研究報(bào)道較少。在本研究中，克隆到日本百脈根LjbHLH34，揭示了其序列特征，明確了該基因在日本百脈根中的組織表達(dá)特異性以及在ABA及干旱脅迫條件下的表達(dá)特征，確定LjbHLH34蛋白的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性；此外，本研究將LjbHLH34轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，并對(duì)其陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱處理，進(jìn)而初步分析該基因在干旱脅迫過(guò)程中的功能，為將來(lái)百脈根屬抗旱育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的材料日本百脈根（MG-20）、擬南芥（WT）、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101、酵母菌株P(guān)J69-4A和所有使用到的載體均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物科學(xué)研究所蕎麥（Fagopyrum esculentum）基因創(chuàng)新研究組保存提供，植物材料于2021年種植于實(shí)驗(yàn)室的溫室內(nèi)，培養(yǎng)條件為22℃、16 h光照/8 h黑暗、濕度75%～80%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 日本百脈根LjbHLH34的克隆 以擬南芥AtbHLH34蛋白序列為參考，在日本百脈根參考基因組網(wǎng)站（http://www.kazusa.or.jp/lotus/index.html）中找到一個(gè)同源基因LjbHLH34（Lj3g3v1545570.1），根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)特異性引物T-LjbHLH34-F/R（表1），以日本百脈根的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到目的條帶，切膠回收，將回收產(chǎn)物連接到pTOPO-Blunt Simple載體（北京金百特生物技術(shù)有限公司），得到pLjbHLH34-T載體，轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取單克隆用引物M13-F/T-LjbHLH34-R（表1）進(jìn)行菌液PCR鑒定后測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)得到正確的pLjbHLH34-T載體質(zhì)粒。

表1 引物序列Table 1 Primer list

1.2.2LjbHLH34生物信息學(xué)分析 對(duì)測(cè)序得到的正確序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，首先通過(guò)ExPASy網(wǎng)站（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)LjbHLH34基因編碼氨基酸的數(shù)目、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)，利用在線網(wǎng)站NCBI：Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）分析LjbHLH34基因編碼的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；用MEGA 7.0軟件使用鄰接法（neighbor-joining，NJ）將LjbHLH34蛋白與擬南芥中的bHLH蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，采用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行同源蛋白序列分析。

1.2.3LjbHLH34基因的亞細(xì)胞定位 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)XbaI和PstI亞細(xì)胞定位載體pAN580-LjbHLH34-F/R引物（表1），以pLjbHLH34-T質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pAN580載體上，獲得pAN580-LjbHLH34重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取單克隆用引物pAN580-F/pAN580-LjbHLH34-R（表1）進(jìn)行菌液PCR鑒定后測(cè)序，將測(cè)序正確的菌液用于質(zhì)粒提取，轉(zhuǎn)化擬南芥葉片原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，然后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡（LSM 980，德國(guó)）觀察，使用AtH2B-Mcherry載體作為核定位Marker。擬南芥葉片原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法和試劑配制參考Chen等［22］：將培養(yǎng)1月齡左右未開(kāi)花的擬南芥葉片放入配制好的酶解液中進(jìn)行酶解，然后加W5溶液［2 mmol·L-1pH=5.7的嗎啉乙磺酸（morpholine ethyl sulfonic acid，MES），154 mmol·L-1NaCl，125 mmol·L-1CaCl2和5 mmol·L-1KCl］用細(xì)胞篩（70 mm）過(guò)濾，334 r·min-1進(jìn)行離心，吸去上清液，用W5溶液洗滌2次，吸去上清液，根據(jù)需要加入MMG溶液［4 mmol·L-1pH=5.7的MES，0.4 mol·L-1D-甘露醇（D-Mannitol）和15 mmol·L-1MgCl2］懸浮制成原生質(zhì)體。在2.0 mL離心管依次加入重組質(zhì)粒（10 μg）、核定位Marker（10 μg）、原生質(zhì)體（100 μL）和PEG-calcium溶液（體積為：重組質(zhì)粒+定位Marker+100 μL原生質(zhì)體；配方為20% PEG 4000，0.2 mol·L-1D-Mannitol和100 mmol·L-1MgCl2），靜置10 min，加入1 mL W5溶 液清洗1～2次，最后加入1 mL W1（20 mmol·L-1pH=5.7的MES，0.4 mol·L-1D-Mannitol和20 mmol·L-1KCl）溶液，室溫暗培養(yǎng)過(guò)夜，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄激活活性分析 為了研究LjbHLH34的轉(zhuǎn)錄激活能力，設(shè)計(jì)含有pGBKT7載體上的NdeI和PstI酶切位點(diǎn)的pGBKT7-LjbHLH34-F/R引物（表1），以pLjbHLH34-T質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGBKT7載體上，獲得pGBKT7-LjbHLH34重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，用T7-F/pGBKT7-LjbHLH34-R（表1）進(jìn)行菌液PCR鑒定，測(cè)序正確之后提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pGBKT7-LjbHLH34+pGADT7空載和pGADT7+pGBKT7空載轉(zhuǎn)入酵母PJ69-4A感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至SD-Leu/-Trp缺陷篩選培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性菌液稀釋至10-1、10-2和10-33個(gè)濃度梯度，各取10 μL分別點(diǎn)在SD-Leu/-Trp和SD-Trp/-His/-Ade缺陷篩選培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。pGADT7+pGBKT7作為陰性對(duì)照。

1.2.5 表達(dá)分析 取5周齡的日本百脈根的根、莖、葉和整株，3個(gè)重復(fù)。提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)LjbHLH34基因在日本百脈根各個(gè)組織的表達(dá)量進(jìn)行分析。將5周齡生長(zhǎng)良好、大小一致的日本百脈根無(wú)菌苗放入加有100 μmol·L-1ABA和20% PEG-6000的MS液體培養(yǎng)基中，室溫振蕩處理0、6、12和24 h后取材，分析在ABA和PEG處理下LjbHLH34基因表達(dá)量變化。以日本百脈根的qLj-actin3-F/R（表1）作為內(nèi)參基因，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物qPCR-F/R（表1），應(yīng)用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用RQ=2-ΔΔT的算法，計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 設(shè)計(jì)含有XbaI和PstI酶切位點(diǎn)的pCAMBIA1307-LjbHLH34-F/R引物（表1），以pLjbHLH34-T質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pCAMBIA1307表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆用引物pCAMBIA1307-F/pCAMBIA1307-LjbHLH34-R（表1）進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)及測(cè)序比對(duì)后，得到過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1307-LjbHLH34質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101侵染野生型擬南芥（WT）花序。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè) 將收獲到的擬南芥T0代種子消毒后播種在含有潮霉素（40 mg·L-1）抗性的MS培養(yǎng)基上，篩選出轉(zhuǎn)基因擬南芥株系并用引物pCAMBIA1307-F/pCAMBIA1307-LjbHLH34-R（表1）對(duì)這些株系進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系OE-1、OE-2和OE-3進(jìn)行繁種，獲得T2代種子用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系耐旱性鑒定 將擬南芥過(guò)表達(dá)株系和野生型擬南芥經(jīng)消毒吹干鋪在MS培養(yǎng)基上，4℃暗培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)入溫室豎直培養(yǎng)3 d后，選取生長(zhǎng)一致的幼苗移入含有200 mmol·L-1的MS培養(yǎng)基和對(duì)照MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將50顆左右的過(guò)表達(dá)株系種子和WT撒在含有蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土=1∶1的培養(yǎng)盆中，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。正常生長(zhǎng)兩周后，分為兩組，一組正常澆水作為對(duì)照，另一組不澆水進(jìn)行干旱處理，15 d后觀察其表型變化并取樣。測(cè)定對(duì)照組和處理組的相對(duì)含水量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。相對(duì)含水量的測(cè)定方法是稱取葉片0.2 g，記為Wf，之后將葉片浸入水中8 h，稱其飽和鮮重Wt，再于105℃烘箱中殺青15 min，75℃條件下烘干至恒重，稱干重，記為Wd，按照公式計(jì)算相對(duì)含水量：相對(duì)含水量（%）=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100［23］；SOD和MDA采用超氧化物歧化酶活性檢測(cè)試劑盒（BC0170）和丙二醛活性檢測(cè)試劑盒（BC0025）檢測(cè)。同時(shí)對(duì)干旱處理后的擬南芥進(jìn)行復(fù)水3 d觀察其表型變化。

1.2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥相關(guān)基因的表達(dá)分析 對(duì)正常生長(zhǎng)和干旱處理15 d后的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥取樣提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)幾個(gè)逆境相關(guān)基因的表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel和GraphPad Prism 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本百脈根LjbHLH34的生物信息學(xué)分析

對(duì)獲得的LjbHLH34基因序列（GenBank：Lj3g3v1545570.1）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，該基因包含一個(gè)711 bp的堿基序列，可編碼236個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為25777.16 Da，理論等電點(diǎn)6.19，含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：bHLH_AtILR3_like（79-154）和BRLZ（139-172）（圖1A）。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，LjbHLH34與擬南芥bHLHⅣ亞家族聚為一類，并與擬南芥中的AtbHLH34和AtbHLH104親緣關(guān)系較近（圖1B）。多重序列比對(duì)結(jié)果表明，LjbHLH34與其他植物中的同源蛋白都具有保守的bHLH結(jié)構(gòu)域（圖1C）。

圖1 LjbHLH34蛋白序列分析Fig.1 Sequence analysis of LjbHLH34

2.2 日本百脈根LjbHLH34基因的亞細(xì)胞定位

將融合表達(dá)載體pAN589-LjbHLH34-GFP和核定位MarkerAtH2B-Mcherry共轉(zhuǎn)化擬南芥葉片原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示融合表達(dá)載體pAN589-LjbHLH34-GFP僅在細(xì)胞核中存在綠色熒光（green fluorescent protein，GFP），與核標(biāo)記Marker重疊。綜上可知LjbHLH34定位于細(xì)胞核中（圖2）。

圖2 LjbHLH34的亞細(xì)胞定位Fig.2 Subcellular localization of LjbHLH34

2.3 LjbHLH34基因的表達(dá)特性

通過(guò)檢測(cè)LjbHLH34在日本百脈根不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因在日本百脈根幼苗的根系、莖和葉片中均有不同程度的表達(dá)，其在根中的表達(dá)量最高，其次是葉，在莖中表達(dá)量最少（圖3A）。對(duì)ABA和PEG處理0、6、12和24 h之后的日 本 百脈根的 總RNA進(jìn)行qRT-PCR分 析 的結(jié)果顯 示：LjbHLH34基因 隨 著ABA和PEG處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，且均在12 h表達(dá)量最高（圖3B，C）。

圖3 LjbHLH34在日本百脈根中的表達(dá)模式Fig.3 Expression pattern of LjbHLH34 in L.japonicus

2.4 LjbHLH34轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為了研究LjbHLH34是否有轉(zhuǎn)錄激活活性，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGBKT7-LjbHLH34+pGADT7空載、pGADT7+pGBKT7空載轉(zhuǎn)入酵母PJ69-4A感受態(tài)中，在SD-Leu/-Trp和SD-Trp/-His/-Ade缺陷篩選培養(yǎng)基上觀察酵母菌株的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，在SD-Leu/-Trp培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pGBKT7-LjbHLH34+pGADT7空載質(zhì)粒、pGADT7+pGBKT7空載質(zhì)粒的酵母菌株都能夠正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pGBKT7-LjbHLH34+pGADT7空載質(zhì)粒的酵母菌株在SD-Trp/-His/-Ade缺陷篩選培養(yǎng)基正常生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)入pGADT7+pGBKT7空載質(zhì)粒的酵母菌株不能生長(zhǎng)（圖4），表明LjbHLH34轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖4 LjbHLH34轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性Fig.4 Transcriptional activation activity of LjbHLH34 transcription factor

2.5 轉(zhuǎn)LjbHLH34基因擬南芥的鑒定

采取花序浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（WT），通過(guò)篩選獲得4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，并對(duì)這幾個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示野生型擬南芥沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，而轉(zhuǎn)基因株系均擴(kuò)增出目的條帶（圖5A）；利用qRTPCR對(duì)過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，得到3個(gè)過(guò)表達(dá)OE-1、OE-2和OE-3轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（圖5B）。

圖5 轉(zhuǎn)LjbHLH34基因擬南芥的鑒定Fig.5 Identification of transgenic A.thaliana with LjbHLH34

續(xù)圖1 LjbHLH34蛋白序列分析Continued Fig.1 Sequence analysis of LjbHLH34

2.6 干旱脅迫下轉(zhuǎn)LjbHLH34基因擬南芥的耐旱性表型

根是植物吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，也是植物最早對(duì)干旱脅迫信號(hào)作出反應(yīng)的部分。本研究通過(guò)甘露醇（D-Mannitol）模擬干旱條件對(duì)LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的根長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。將轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型擬南芥在普通MS和含有200 mmol·L-1D-Mannitol的MS固體培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)10 d，發(fā)現(xiàn)在普通MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照的根長(zhǎng)沒(méi)有明顯區(qū)別（圖6A）；而在200 mmol·L-1D-Mannitol處理下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于野生型，分別是野生型的1.41、1.50和1.52倍（圖6A，B）。

此外，本研究還對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行了土壤干旱試驗(yàn)，進(jìn)一步了解其抗旱能力。將正常生長(zhǎng)的擬南芥幼苗進(jìn)行干旱處理15 d后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（OE-1，OE-2和OE-3）和野生型擬南芥在正常澆水的情況下生長(zhǎng)無(wú)明顯差異；在干旱脅迫下，野生型擬南芥地上部分的萎蔫程度比轉(zhuǎn)基因株系嚴(yán)重；復(fù)水后，野生型和轉(zhuǎn)基因株系慢慢轉(zhuǎn)綠，但轉(zhuǎn)基因株系的葉片明顯比野生型綠（圖7）。從LjbHLH34轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫下的表型可以得出LjbHLH34能提高植物的耐旱性。

圖7 干旱脅迫后擬南芥表型Fig.7 Phenotypic of A.thaliana under drought stress

2.7 在干旱脅迫下LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥的生理指標(biāo)變化

相對(duì)含水量可以反映植物體內(nèi)水分情況，SOD是植物細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，而MDA作為氧化脅迫的主要產(chǎn)物會(huì)破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的耐旱性，測(cè)定了經(jīng)過(guò)15 d干旱處理的轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥的相對(duì)含水量、SOD活性和MDA含量。結(jié)果顯示，干旱處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中的相對(duì)含水量和SOD活性顯著高于野生型擬南芥，而MDA含量顯著低于野生型擬南芥（圖8）。干旱脅迫下LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥中含水量、SOD和丙二醛的變化，表明過(guò)表達(dá)LjbHLH34可以通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)的防御成分和減少傷害物質(zhì)的形成來(lái)抵抗干旱脅迫給植物帶來(lái)的氧化傷害。

圖8 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的生理指標(biāo)Fig.8 Physiological indexes of transgenic A.thaliana under drought stress

2.8 干旱處理下LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗性相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了研究在干旱條件下LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)其他調(diào)節(jié)抗逆相關(guān)基因的影響，本研究分析了AtCAT1、AtCAT3和AtRD22這3個(gè) 基 因 的 表 達(dá) 水 平。結(jié) 果 顯 示，在 干 旱 處 理15 d后AtCAT1、AtCAT3和AtRD22在LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中的表達(dá)水平明顯高于野生型（圖9）。在過(guò)表達(dá)LjbHLH34轉(zhuǎn)基因植株中，逆境相關(guān)基因的表達(dá)水平受到相當(dāng)程度的誘導(dǎo)，推測(cè)過(guò)表達(dá)LjbHLH34可以通過(guò)調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)來(lái)提高植物的抗旱性。

圖9 干旱處理下抗性相關(guān)基因的表達(dá)Fig.9 Expression of resistance related genes under drought treatment

3 討論

bHLH蛋白最初是在小鼠中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定出來(lái)的，隨后在酵母和植物中也相繼被發(fā)現(xiàn)和研究［24-25］。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了至少162種bHLH蛋白，分為bHLHⅠ～bHLHⅫ共12個(gè)不同的亞家族［11］。擬南芥bHLHⅣ亞家族的成員有一個(gè)與第二個(gè)bHLH螺旋基序相鄰的高度保守的亮氨酸拉鏈基序［leucine zipper（ZIP）motif］，預(yù)測(cè)該結(jié)構(gòu)域可以使蛋白質(zhì)二聚化［11，26］。在本研究中，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，LjbHLH34與擬南芥bHLH蛋白第Ⅳ亞家族聚為一類，且與擬南芥中的AtbHLH34和AtbHLH104親緣關(guān)系較近，對(duì)三者氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明LjbHLH34與AtbHLH34和AtbHLH104都具有bHLH家族特有的bHLH結(jié)構(gòu)域，同時(shí)各同源蛋白在N末端和C末端表現(xiàn)出明顯的差異；其中LjbHLH34與AtbHLH34同源性最高，預(yù)示LjbHLH34蛋白在植物生長(zhǎng)過(guò)程中與AtbHLH34發(fā)揮著相似或相近的生物學(xué)功能。同時(shí)使用NCBI在線分析LjbHLH34氨基酸的保守域，發(fā)現(xiàn)該基因除了具備bHLH_AtILR3_like結(jié)構(gòu)域外，還存在bHLHⅣ亞家族成員中的一個(gè)ZIP基序（basic region leucin zipper），推測(cè)該基序可能在LjbHLH34基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面行使某種特定的功能。LjbHLH34定位在細(xì)胞核中，暗示LjbHLH34與其他轉(zhuǎn)錄因子一樣在細(xì)胞核中行使功能。

在對(duì)bHLH蛋白研究中，發(fā)現(xiàn)部分家族成員可以通過(guò)結(jié)合上游基因啟動(dòng)子元件激活下游相關(guān)基因來(lái)調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育或?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)，例如Inducer of CBF Expression（ICE1，bHLH116）轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合CBF/DREB1基因的啟動(dòng)子，通過(guò)獨(dú)立ABA途徑激活其轉(zhuǎn)錄以提高植物的耐寒性［27］。擬南芥AtbHLH34在體外與AtPGR基因啟動(dòng)子5′-GAGA-3′元件相互作用并激活A(yù)tPGR的轉(zhuǎn)錄，作為連接葡萄糖和非生物脅迫的調(diào)節(jié)因子來(lái)發(fā)揮作用［20］。本研究通過(guò)酵母試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LjbHLH34轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性，推測(cè)該基因可能具有結(jié)合上游基因的啟動(dòng)子的功能并能激活下游基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控相關(guān)功能。

有報(bào)道顯示bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá)受外界因素的影響，如干旱、滲透脅迫和外源植物激素等，如擬南芥AtbHLH34、AtbHLH104和AtbHLH112基因的表達(dá)受ABA的誘導(dǎo)，同時(shí)AtbHLH34和AtbHLH112也受干旱的誘導(dǎo)［20，28-29］，且它們?cè)诓煌幚頃r(shí)間下表達(dá)量不同。在本試驗(yàn)中，LjbHLH34基因隨著ABA和PEG處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，推測(cè)該基因受PEG和ABA誘導(dǎo)，對(duì)脅迫響應(yīng)存在時(shí)間的特異性。

過(guò)表達(dá)AtbHLH92能適當(dāng)提高擬南芥對(duì)NaCl和滲透脅迫的耐性，耐性表型主要表現(xiàn)在與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)在NaCl和甘露醇脅迫下顯著增加［30］。蘋果MdbHLH130通過(guò)調(diào)節(jié)煙草（Nicotiana tabacum）氣孔關(guān)閉和活性氧清除作為水分脅迫反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)因子［31］，玉米（Zea mays）ZmPTF1通過(guò)促進(jìn)根系發(fā)育和ABA的合成來(lái)調(diào)節(jié)耐旱性［32］。過(guò)表達(dá)AtAIB植株在干旱脅迫10 d后，轉(zhuǎn)基因的葉片萎蔫程度比對(duì)照野生型擬南芥小，更能耐受干旱脅迫［19］。所以為了更好地了解LjbHLH34基因的功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究從日本百脈根中克隆到該基因，利用花序浸染法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。在200 mmol·L-1D-Mannitol模擬干旱脅迫下，LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于野生型擬南芥的根長(zhǎng)；同時(shí)在干旱處理15 d后，轉(zhuǎn)基因株系的葉片萎蔫程度明顯比野生型小，這與AtbHLH92和AtAIB調(diào)控植物耐旱類似。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱表型鑒定，認(rèn)為過(guò)表達(dá)LjbHLH34可以適當(dāng)提高擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受性。

為了進(jìn)一步探究在干旱脅迫下LjbHLH34過(guò)表達(dá)引起的生理生化變化，測(cè)定了在干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)含水量、SOD活性和丙二醛含量。相對(duì)含水量是衡量植物體內(nèi)水分狀況的重要生理指標(biāo)［33］，與對(duì)照相比野生型和LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥的相對(duì)含水量在干旱處理后均降低，但轉(zhuǎn)基因擬南芥的相對(duì)含水量高于野生型。在植物受到干旱脅迫時(shí)，會(huì)打破作為逆境脅迫響應(yīng)的重要介質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)過(guò)度積累，使細(xì)胞膜受到傷害［34］。SOD是植物重要的抗氧化酶，其活性的升高與植物抗旱能力相關(guān)［35］；丙二醛含量作為檢測(cè)膜脂過(guò)氧化的生理指標(biāo)，在相同脅迫條件下，其含量越低，植物的抗旱性越強(qiáng)。在干旱處理后，SOD活性明顯升高，與野生型相比，LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥積累了更多的SOD，說(shuō)明LjbHLH34過(guò)表達(dá)株系具有更高的活性氧清除能力。丙二醛含量也在干旱處理后明顯增加，但轉(zhuǎn)基因株系的含量顯著低于野生型擬南芥，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的細(xì)胞膜損害程度低于野生型。

在干旱脅迫刺激下轉(zhuǎn)錄因子會(huì)不斷合成，將響應(yīng)的干旱脅迫信號(hào)傳遞和放大，最終誘導(dǎo)響應(yīng)干旱基因的表達(dá)，從而引起植物生理生化的改變，使植物產(chǎn)生抗旱性［36］。為了進(jìn)一步探討LjbHLH34提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性的機(jī)制，比較了轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型中幾個(gè)關(guān)于氧化防御主要酶基因和其他抗旱相關(guān)的基因。CAT1和CAT3編碼過(guò)氧化氫酶蛋白，過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、SOD和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）一起構(gòu)成清除超氧自由基和過(guò)氧化氫的防御系統(tǒng)［37］。NmIG1過(guò)表達(dá)植株在干旱脅迫時(shí)SOD1、CAT1、CAT2和APX1的表達(dá)水平上升，從而增加抗氧化防御成分來(lái)更好地保護(hù)和防止ROS的損害［38］；過(guò)表達(dá)AtCAT3可以顯著提高擬南芥的抗旱性，而act3突變體表現(xiàn)出與過(guò)表達(dá)植株相反的表型［39］。干旱處理后LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中CAT1和CAT3的表達(dá)水平比WT高，反映出過(guò)表達(dá)株系中抗氧化防御成分增多，ROS清除能力增強(qiáng)。ABA作為脅迫信號(hào)在調(diào)節(jié)植物的干旱反應(yīng)中起重要作用，RD22轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)源ABA積累過(guò)程中被轉(zhuǎn)錄，作為逆境條件下ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄激活因子，過(guò)表達(dá)RD22可以提高植株對(duì)干旱的耐受性［40］。在干旱脅迫后3個(gè)LjbHLH34轉(zhuǎn)基因植株中RD22的表達(dá)水平顯著高于WT。綜上所述，在過(guò)表達(dá)LjbHLH34轉(zhuǎn)基因植株中，抗氧化酶編碼基因和其他逆境相關(guān)基因的表達(dá)水平受到相當(dāng)程度的誘導(dǎo)，推測(cè)過(guò)表達(dá)LjbHLH34可以通過(guò)調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，在抗旱方面發(fā)揮積極作用。

4 結(jié)論

生物信息學(xué)分析表明，LjbHLH34轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥bHLHⅣ亞家族聚為一類，并與擬南芥中的AtbHLH34和AtBHLH104親緣關(guān)系較近；該基因受PEG和ABA誘導(dǎo)，定位于細(xì)胞核中且有轉(zhuǎn)錄激活活性。在甘露醇處理下，過(guò)表達(dá)LjbHLH34轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于野生型；同時(shí)在土壤干旱處理15 d后，過(guò)表達(dá)LjbHLH34轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)情況明顯比野生型的好，轉(zhuǎn)基因擬南芥的相對(duì)含水量和SOD活性顯著高于野生型擬南芥，丙二醛積累顯著低于野生型。此外，在土壤干旱處理后，3個(gè)與抗逆相關(guān)基因AtCAT1、AtCAT3和AtRD22在轉(zhuǎn)基因中的表達(dá)量顯著升高。綜上所述，在干旱脅迫條件下，LjbHLH34轉(zhuǎn)錄因子在植物中可能起到了正調(diào)控的作用。