朱愛民， 張玉霞， 王顯國， 田永雷

(1. 內(nèi)蒙古民族大學， 內(nèi)蒙古通遼 028041； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100083)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草(Leguminosaesp.)[1]，在我國生態(tài)環(huán)境建設和畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用[2]?？茽柷叩貐^(qū)在氣溫較低的年份紫花苜蓿普遍有凍害現(xiàn)象，直接制約該地區(qū)苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。國內(nèi)外有關苜蓿抗寒方面的研究資料[3-8]很多，研究表明紫花苜?？购芰Φ拇笮∨c其根系中保護酶活性密切相關[9-10]，過氧化物酶(peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)是酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶類，對于維護細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用，對苜?？购Φ奶岣哂刑厥庖饬x[11-13]，其活性的變化可作為植物的耐寒指標[14-16]。

刈割是人工草地有效利用的重要措施之一，合理刈割對苜蓿的安全越冬和再生具有重要意義[17]，刈割與苜蓿根系特征[18-19]及根頸氧化酶活性關系密切，有學者如Silkett[20]、Grand-field[21]、Jackobs[22]等認為第一次殺霜(殺霜日是指氣溫首次降至-20C )之前4～6周，是中、高維度地區(qū)紫花苜蓿刈割秋季敏感期。在該時段刈割紫花苜蓿導致草地持久性和隨后年份草產(chǎn)量降低。但Reynolds[23]、Mays等[24]認為當苜蓿品種秋眠和抗病性強、土壤肥力高、刈割次數(shù)和生育時期(或間隔期)適宜，秋季刈割不會造成草地持久性和產(chǎn)草量降低。有關刈割的爭議，究竟孰是孰非，需要更多的研究去佐證。孫浩等[25]在2015年對阿魯科爾沁旗最佳末次刈割期研究中表明，末茬秋季敏感期刈割導致苜蓿越冬率將低，但未對苜蓿根頸中抗氧化物酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化做深入研究，苜蓿根頸中抗氧化物酶活性在植物越冬期間存在怎樣的變化規(guī)律及與越冬有無直接聯(lián)系還需進一步探究。

本試驗通過在科爾沁地區(qū)對8個苜蓿品種秋季敏感兩時期刈割處理同未刈割對照，探究苜蓿根頸中抗氧化物酶活性及游離脯氨酸變化，分析科爾沁沙地秋末是否應該刈割及最佳刈割時期，為解決科爾沁沙地苜蓿末茬刈割及越冬問題提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)自然概況

試驗地設在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市阿魯科爾沁旗草源合作社公司，地理位置東經(jīng)116°21′～120°58′，北緯41°17′～45°24′，溫帶半干旱大陸性氣候。年平均氣溫0～6℃，≥10℃積溫3 000～3 200℃，無霜期140～150天，年平均降水量350～400 mm，蒸發(fā)量是降水量的5倍左右，年平均風速3～4.4 m·s-1。試驗田土壤為沙土，新開墾草地。

1.2 試驗材料

供試材料如表1所示。

1.3 試驗方法

小區(qū)布局及管理：采用隨機區(qū)組設計，小區(qū)試驗面積20m2(5m×4m)，8個品種，3次重復，共設24個小區(qū)，小區(qū)之間設50 cm過道。所有小區(qū)底肥均施750 kg·hm-2安琪有機肥、300 kg·hm-2過磷酸鈣、7 kg·hm-2硫酸鉀、60 kg·hm-2尿素(機施)，播量22.5 kg·hm-2，8月4日播種，人工撒播，試驗田正常管理。

表1 紫花苜蓿品種及來源Table 1 Alfalfa varieties and sources

刈割處理：分別于10月1號和10月15號兩秋季敏感期對每小區(qū)4 m×1.5 m進行刈割并標記，未刈割作為對照。

取樣時期：分別于土壤凍融交替時期(秋冬晚上溫度低于0℃土壤凍結與白天溫度大于0℃，土壤凍融交替出現(xiàn)的時期)、土壤封凍期(冬季全天溫度低于0℃，土壤完全凍結的時期)取樣，并測定相關指標。

1.4 測定項目及方法

每處理隨機挖取長勢良好且根頸粗度一致的紫花苜蓿根系30株，于實驗室中用蒸餾水沖洗干凈后用濾紙吸出根系表面的水分，用刀片對根頸部進行切片、備用，進行試驗：游離脯氨酸用茚三酮法測定；丙二醛用硫代巴比妥酸法測定；POD用愈創(chuàng)木酚法測定；SOD用氮藍四唑法測定；CAT用紫外吸收法測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 軟件處理并做表格，SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中SOD活性的影響

根據(jù)表2可知，土壤凍融交替期，未刈割苜蓿根頸中SOD活性顯著高與10月1號刈割苜蓿根頸中SOD活性(P<0.05)，除‘龍牧801’和‘公農(nóng)1號’品種外未刈割苜蓿根頸中SOD活性顯著高于10月15號刈割苜蓿根頸中SOD活性(P<0.05)。10月15號刈割的苜蓿根頸中SOD活性均顯著高于10月1號刈割的根頸中SOD活性。不同時期刈割苜蓿不同品種間根頸中SOD活性強度不同：未刈割和10月15號刈割，‘龍牧801’、‘農(nóng)菁1號’、‘農(nóng)菁8號’苜蓿根頸中SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割，‘龍牧801’、‘東苜1號’、‘公農(nóng)號’和‘農(nóng)菁1號’根頸中SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；無論是未刈割還是不同時期刈割‘草原2號’品種苜蓿根頸中SOD活性與其他品種相比較弱。

土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中SOD活性均顯著高于不同時期刈割苜蓿根頸中SOD活性(P<0.05)，10月15號刈割的苜蓿根頸中SOD活性高于10月1號刈割苜蓿根頸中SOD活性，但是只有‘東苜1號’、‘公農(nóng)1號’、‘農(nóng)菁1號’、‘農(nóng)菁8號’SOD活性變化達到顯著水平(P<0.05)。不同品種間根頸中SOD活性有明顯差異：未刈割‘農(nóng)菁8號’苜蓿根頸中SOD活性顯著低于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割，‘肇東’、‘草原2號’及‘公農(nóng)1號’苜蓿根頸中SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)，‘農(nóng)菁8號’品種根頸中SOD活性最低；10月15號刈割，公農(nóng)一號苜蓿根頸中SOD活性最強，且顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，‘農(nóng)菁1號’和‘草原3號’品種根頸中SOD活性顯著低于其他品種(P<0.05)。

表2 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中SOD活性的影響Table 2 Effect of cutting on the activity of SOD in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·g-1 FW

注：不同小寫字母表示差異顯著性水平P< 0.05，“/”左邊表示同列相同時期測定不同苜蓿品種間差異顯著性，右邊表示同一品種刈割處理差異顯著性，下同

Note: The different letters indicate significant differences at the 0.05 level, On the left side of‘/’ indicate significant difference of the same column among different alfalfa varieties that determined at the same time ,On the right side of‘/’ indicate significant difference of the same variety betwen cutting treatments. The same as below

2.2 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中POD活性的影響

由表3可知，秋末不同時期刈割處理對8個苜蓿品種根頸中POD活性影響不同，不同苜蓿品種間根頸中POD活性強度不同。

土壤凍融交替期，10月1號刈割苜蓿根頸中POD活性均顯著高于未刈割和10月15號刈割根頸中POD活性(P<0.05)；未刈割苜蓿根頸中POD活性均顯著高于10月15號刈割根頸中POD活性(P<0.05)。未刈割苜蓿，‘公農(nóng)1號’根頸中POD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割和10月15號刈割‘公農(nóng)1號’、‘東苜1號’根頸中POD活性均顯著高于其他品種(P<0.05)。

土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中POD活性顯著高于不同時期刈割苜蓿根頸中POD含量(P<0.05)；10月1號刈割除‘農(nóng)菁1號’和‘農(nóng)菁8號’外其他苜蓿根頸中POD活性均顯著高于10月15號刈割根頸中POD含量(P<0.05)。未刈割‘農(nóng)菁1號’、‘農(nóng)菁8號’、‘東苜1號’苜蓿根頸中POD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割‘東苜1號’苜蓿根頸中POD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；10月15號刈割‘農(nóng)菁1號’、‘農(nóng)菁8號’根頸中POD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；無論未刈割還是不同時期刈割‘龍牧801’和‘草原3號’根頸中POD含量均顯著低于其他苜蓿品種(P<0.05)。

表3 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中POD活性的影響Table 3 Effect of cutting on the activity of POD in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·min-1·g-1 FW

2.3 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中CAT活性的影響

根據(jù)表4可知，土壤凍融交替期測定結果表明未刈割與不同時期刈割苜蓿根頸中CAT活性均無顯著性差異。未刈割、10月1號刈割、10月15號刈割‘龍牧801’苜蓿根頸中CAT活性均是最高，與其他品種比較差異顯著(P<0.05)，無論是未刈割還是不同時期刈割‘農(nóng)菁8號’苜蓿根頸中CAT活性均較弱。

土壤封凍期，10月1號刈割苜蓿根頸中CAT活性顯著高于未刈割和10月15號刈割苜蓿根頸中CAT活性(P<0.05)，除‘公農(nóng)1號’外未刈割苜蓿根頸中CAT活性均顯著高于10月15號刈割苜蓿根頸中CAT活性(P<0.05)。未刈割‘東苜1號’、‘草原2號’苜蓿根頸中CAT活性顯著高于其它苜蓿品種(P<0.05)，草原3號苜蓿根系中CAT活性顯著低于其他苜蓿品種(P<0.05)；10月1號刈割‘肇東’、‘草原2號’苜蓿根頸中CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05)，‘農(nóng)菁8號’苜蓿根頸中CAT活性顯著低于其他品種(P<0.05)；10月15號刈割‘公農(nóng)1號’品種根頸中CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05)，‘草原3號’苜蓿根頸中CAT活性最弱，與其他品種相比，差異性顯著(P<0.05)。

表4 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中CAT活性的影響Table 4 Effect of cutting on the activity of CAT in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·min-1·g-1 FW

2.4 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中丙二醛含量的影響

由表5可知，土壤凍融交替期，10月1號刈割苜蓿根頸中丙二醛含量顯著高于10月15號刈割苜蓿根頸中MDA含量(P<0.05)，與未刈割苜蓿相比除‘肇東’、‘公農(nóng)1號’品種外其他品種MDA含量均顯著增加(P<0.05)。未刈割苜蓿根頸中MDA含量高于10月15號刈割苜蓿根頸中MDA含量，但只有‘肇東’和‘公農(nóng)1號’苜蓿根頸中MDA含量變化達到顯著水平(P<0.05)。未刈割‘農(nóng)菁8號’苜蓿根頸中MDA含量顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)；10月1號刈割‘農(nóng)菁8號’、‘草原3號’和‘龍牧801’根頸中MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；10月15號刈割‘農(nóng)菁1號’、‘農(nóng)菁8號’及‘龍牧801’苜蓿根頸中MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；未刈割10月1號刈割及10月15號刈割根頸中MDA含量最低的苜蓿品種分別是‘東苜1號’、‘公農(nóng)1號’、‘肇東’(P<0.05)。

土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中MDA含量顯著高于10月1號刈割苜蓿根頸中MDA含量(P<0.05)，與10月15號刈割相比苜蓿根頸中MDA含量變化不顯著。10月15號刈割苜蓿根頸中MDA含量顯著高于10月1號刈割根頸中MDA含量(P<0.05)。未刈割和10月15號刈割‘農(nóng)菁1號’、‘農(nóng)菁8號’、‘草原2號’苜蓿根頸中MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割‘農(nóng)菁1號’、‘農(nóng)菁8號’、‘草原2號’、‘草原3號’苜蓿根頸中MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；未刈割與不同時期刈割肇東和東苜1號苜蓿根頸中MDA含量相比其他品種顯著降低(P<0.05)；

表5 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中MDA含量的影響Table 5 Effect of cutting on the content of MDA in the root neck of 8 alfalfa varieties/ nmol.ml-1FW

2.5 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中游離脯氨酸含量的影響

土壤凍融交替期測定結果表明，如表6所示，未刈割苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于10月1號刈割和10月15刈割苜蓿根頸中含量(P<0.05)。10月1號刈割苜蓿根頸游離脯氨酸含量高于10月15號刈割苜蓿根頸中含量，但只有‘農(nóng)菁1號’和‘農(nóng)菁8號’苜蓿根頸中游離脯氨酸含量變化達到顯著差異水平(P<0.05)。不同品種間未刈割、10月1號刈割和10月15號刈割根頸中游離脯氨酸含量最高的分別是‘東苜1號’、‘龍牧801’、‘龍牧801’，含量最低的分別是‘草原2號’、‘農(nóng)菁1號’、‘農(nóng)菁1號’。

土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于10月1號刈割苜蓿根頸中脯氨酸含量(P<0.05)，與10月15號刈割相比僅‘草原2號’和‘草原3號’差異達到顯著水平(P<0.05)；10月1號刈割苜蓿根頸中游離脯氨酸含量除‘草原2號’和‘草原3號’外其他品種均顯著低于10月15號刈割根頸中脯氨酸含量(P<0.05)。未刈割‘肇東’苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)；10月1號刈割‘肇東’、‘公農(nóng)1號’苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)；10月15號刈割‘龍牧801’、‘肇東’、‘東苜1號’苜蓿根頸中游離脯氨酸含量較其他苜蓿品種高，差異顯著(P<0.05)；未刈割、10月1號刈割和10月15號刈割根頸中游離脯氨酸含量最低的分別是‘草原3號’、‘農(nóng)菁8號’和‘草原2號’。

表6 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中游離脯氨酸含量的影響Table 6 Effect of cutting treatment on free proline content in root neck of 8 alfalfa varieties/ μg·g-1 FW

3 討論與結論

3.1 秋末刈割處理對沙地苜蓿根頸中抗氧化酶活性的影響

研究表明逆境脅迫因素可誘發(fā)植物組織細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的H2O2等活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS 過剩積累會造成膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和 DNA 分子結構等損傷。為抵御 ROS 對細胞的毒害，植物細胞便啟動一些活性氧清除機制[26]，SOD、POD、CAT 是植物體內(nèi)清除過量活性氧的重要酶促防御系統(tǒng)，可減輕或避免植物體的氧化損傷，抗寒性和耐刈割苜蓿品種在逆境條件下能維持較高的SOD、CAT 和 POD 等酶的活性，以利于清除超氧陰離子，降低膜質(zhì)過氧化水平，從而減輕膜傷害程度[27]。季楊[28]等研究表明在逆境條件下鴨矛根系中SOD、POD酶活性增強。本試驗研究表明，刈割后紫花苜蓿根頸中SOD活性較未刈割均明顯減弱，推測刈割后苜蓿的抗逆性減弱。土壤凍融交替期，10月1號刈割苜蓿根頸中POD活性顯著大于未刈割和10月15號刈割根頸中POD活性，可能由于取樣測定時間和刈割時間長短有關，10月1號刈割后當白晝溫度大于5℃時苜蓿仍繼續(xù)再生，根系中POD活性逐漸增強，10月15號刈割距測定時期較短，晝夜溫度逐漸降低，苜蓿進入休眠，苜蓿根頸中POD活性下降。土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中POD活性顯著高于不同時期刈割苜蓿根頸中POD活性，土壤封凍后苜蓿根系已進入休眠狀態(tài)，根頸中各物質(zhì)處于穩(wěn)定狀態(tài)，此時未刈割苜蓿根頸中POD活性強，推斷未刈割苜?？购詮娪诓煌瑫r期刈割苜蓿。譚淑端等[29]研究表明，持續(xù)逆境脅迫下雙穗雀稗根系POD活性持續(xù)增加，劉建新[30]等研究表明，逆境脅迫下燕麥葉片中SOD、POD、CAT活性顯著增加。本試驗中，土壤凍融交替期，未刈割和不同時期刈割苜蓿根頸中CAT活性無顯著差異；土壤封凍期，10月1號刈割苜蓿根頸中CAT活性顯著高于未刈割和10月15號刈割苜蓿根頸中CAT活性，出現(xiàn)這種差異的原因是由于土壤封凍期溫度晝夜均低于0℃，刈割和低溫雙重因素導致苜蓿根系中產(chǎn)生大量超氧陰離子，從而誘導苜蓿啟動CAT保護機制，根系中CAT活性顯著增加，協(xié)同SOD和POD作用將超氧陰離子分解為H2O和O2。這與彭淼等[31]研究一致，其研究表明SOD 作為抵御活性氧傷害的“第一道防線”能使 O2發(fā)生歧化作用而轉(zhuǎn)化為H2O2，而 SOD 與H2O2清除酶 POD 和 CAT 的平衡對維持細胞功能至關重要，一般認為，其協(xié)調(diào)作用使細胞內(nèi)活性氧維持在較低的水平。

3.2 秋末刈割處理對沙地苜蓿根頸中MDA含量的影響

丙二醛能抑制細胞保護酶的活性和降低抗氧化物的含量，是膜質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物[32]。許多研究都將MDA含量作為衡量植物耐旱性強弱的一個重要指標[33-35]，張紅萍等[36]研究指出隨著逆境條件的加劇，丙二醛的含量也會逐漸增加。本試驗與其研究結果一致，土壤凍融期，10月1號刈割苜蓿根頸中MDA含量大于未刈割苜蓿根頸中含量，且均顯著大于10月15號刈割苜蓿根系中含量，這可能與苜蓿刈割后根頸抗逆性下降，苜蓿根頸細胞膜脂過氧化有關。土壤封凍期，10月1號刈割由于苜蓿根頸中CAT活性顯著增強，協(xié)同SOD、POD共同作用清除自由基，所以此時測得MDA含量顯著降低；10月15號刈割后隨著溫度的降低苜蓿進入休眠，此時根頸中物質(zhì)含量維持在較穩(wěn)定的范圍，所以土壤封凍期測得苜蓿根系中MDA含量與未刈割根頸中含量相比無差異顯著性。

3.3 秋末刈割處理對沙地苜蓿根頸中游離脯氨酸含量的影響

目前針對脯氨酸的積累與抗寒性是否相關還存在爭議，有些學者認為逆境環(huán)境下植物體內(nèi)脯氨酸的積累是其對逆境環(huán)境的適應反應[37]，但有學者認為脯氨酸的積累是由逆境脅迫造成的傷害結果[38]，本試驗表明土壤凍融交替期和土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中游離脯氨酸含量均高于不同時期刈割根頸中含量。未刈割較刈割苜蓿受逆境脅迫小，而游離脯氨酸含量反而增加，所以推斷逆境條件下植物體內(nèi)脯氨酸的積累是其對逆境的適應反應，且未刈割苜蓿較刈割苜蓿適應低溫脅迫能力強。

本研究初步結論為：進入寒冬，刈割與未刈割相比，未刈割苜蓿根頸中SOD、POD活性增強，游離脯氨酸含量增加，適應低溫環(huán)境能力強，秋末敏感期刈割刺激苜蓿根頸中CAT活性增強，但SOD、POD活性較低，游離脯氨酸含量下降，適應低溫環(huán)境能力弱，因此不建議秋末敏感期刈割。