陳粵瑛 王浩 胡玉剛 黃鑫 陳金玲 鄧傾 曹省 潘桔紅 周青

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死、外周血管病等心血管疾病發(fā)生的主要原因，目前臨床主要通過藥物調(diào)脂和針對心腦血管的靶器官損害展開綜合治療，但尚無有效干預重度病變的手段，也無法阻斷和逆轉AS進展。研究［1］表明，聲動力治療（sonodynamic therapy，SDT）能治療AS斑塊并抑制AS進展，可能彌補常規(guī)治療方法的不足。SDT是利用超聲儀器將聲能聚焦于斑塊部位，并激活聚集在斑塊內(nèi)的聲敏劑，從而阻止病變增殖的靶向治療方式，具有對正常組織影響小、體內(nèi)穿透性強、能量無明顯衰減等優(yōu)點。其中，二氫卟吩e6（chlorine e6，Ce6）作為目前有代表性和發(fā)展前景的第2代聲敏劑，具有無毒安全、代謝快等優(yōu)點，但游離Ce6不能高濃度、選擇性地聚集在AS病變部位，且受到超聲激發(fā)后可能對鄰近組織產(chǎn)生聲毒副作用，故需要通過納米技術改造游離Ce6，提高其組織選擇性［2-3］。研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，AS斑塊內(nèi)的巨噬細胞特異性表達A類清道夫受體（scavenger receptor-A，SR-A）可成為靶向斑塊的位點，其靶向多肽PP1（氨基酸序列：LSLERFLRCWSDAPAK）可與SR-A共價結合，從而特異性識別斑塊尤其是不穩(wěn)定斑塊。本實驗將Ce6和PP1裝載于脂質(zhì)納泡（nanobubbles，NB）上，制備載Ce6和SR-A靶向多肽PP1的納泡（Ce6-PP1 NB），評價其靶向性和安全性，并通過體外實驗初步探討其增強SDT療效的能力。

材料與方法

一、主要實驗材料及儀器

1.主要實驗材料：Ce6（上海源葉生物科技有限公司）；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-生物素（DSPEPEG2000-Biotin）均購于深圳市魅羅科技有限公司；全氟丙烷（遼寧奧斯?？萍加邢薰荆?；三氯甲烷（武漢欣申試化工科技有限公司）；鏈霉親和素［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；PP1、生物素化FITC標記的PP1（FITC-PP1-biotin）均購于吉爾生化（上海）有限公司；脂多糖（北京索萊寶科技有限公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（上海碧云天生物技術有限公司）；干擾素-γ（美國Bioworld technology公司）。小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7細胞）細胞株（批號：CL-0190）、細胞培養(yǎng)液均購于武漢普諾賽生命科技有限公司；CD206抗體、CD86抗體均購于美國Biolegend公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、活性氧檢測試劑盒、CCK-8細胞計數(shù)試劑盒均購于合肥蘭杰柯科技有限公司。

2.主要實驗儀器：旋轉蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；納米粒度電位儀（Zetasizer Nano ZSP，英國Malvern公司）；透射電子顯微鏡（JEM-2100，日本電子株式會社）；酶聯(lián)免疫檢測儀（EnSight，美國Perkin Elmer公司）；紫外可見分光光度計（DU730）、流式細胞儀（CFXconnect）均購于美國Beckman Coulter公司；激光共聚焦掃描顯微鏡（FV1200，日本Olympus公司）；低強度脈沖超聲波治療儀（RS232，重慶醫(yī)科大學超聲影像研究所）。

二、實驗方法

1.Ce6-PP1 NB的制備：采用薄膜水化法制備Ce6-PP1 NB。將DPPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Biotin、Ce6按質(zhì)量比5∶1∶1∶0.25溶解于三氯甲烷中，避光、40℃旋轉蒸發(fā)60 min，待圓底燒瓶內(nèi)形成墨綠色薄膜時，加入甘油與磷酸鹽緩沖液（PBS）混合液（體積比1∶9），恒溫振蕩直至附壁薄膜充分溶解，將瓶內(nèi)液體分裝至3 ml棕色西林瓶，全氟丙烷置換空氣，高頻振動60 s，靜置后分層，下層墨綠色液體即為生物素化載Ce6納泡（Ce6 NB）。取50 μl生物素化Ce6 NB加入3 μl鏈霉親和素，37℃孵育1 h，然后加入6 μl FITC-PP1-biotin，37℃孵育2 h，即得到Ce6-PP1 NB。

2.Ce6-PP1 NB的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性及細胞毒性檢測：①檢測理化性質(zhì)及穩(wěn)定性。應用普通光學顯微鏡觀察其形狀、大??；熒光顯微鏡觀察Ce6、PP1在納泡上的結合情況；透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)、結構；納米粒度電位儀檢測其粒徑、多分散指數(shù)及Zeta電位；紫外可見分光光度計檢測Ce6吸收光譜并繪制標準曲線，計算Ce6包封率；流式細胞儀檢測PP1連接率。將Ce6-PP1 NB置于4℃冰箱內(nèi)避光保存，于不同時刻（0、1、3、7 d）檢測其粒徑、Zeta電位、Ce6包封率及PP1連接率。②檢測細胞毒性。將RAW264.7細胞接種于96孔板，孵育24 h，分為6組，每組3個復孔，分別加入不同濃度（0、5、10、20、30、40 μg/ml）Ce6-PP1 NB，孵育12 h，然后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1 h，應用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測并計算細胞存活率。

3.體外尋靶實驗：將RAW264.7細胞接種于1 ml共聚焦培養(yǎng)皿中孵育24 h，分別加入濃度為30 μg/ml的Ce6和Ce6-PP1 NB共同孵育6 h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定細胞，加入100 μl DAPI染色液對細胞核進行染色，于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察細胞內(nèi)Ce6熒光強度（λ激發(fā)波長：630 nm，λ發(fā)射波長：680 nm）。

4.Ce6-PP1 NB的聲敏性和聲動力效應評估：將RAW264.7細胞接種至6孔板，每孔分別加入濃度為20 ng/ml干擾素γ和100 ng/ml脂多糖各500 μl，建立體外炎癥模型。按照不同處理方法將細胞分為空白對照組、低強度脈沖超聲（LIPUS）組、Ce6+LIPUS組和Ce6-PP1 NB+LIPUS組。其中，Ce6+LIPUS組加入濃度為30 μg/ml Ce6，Ce6-PP1 NB+LIPUS組加入濃度為30 μg/ml Ce6-PP1 NB，均孵育6 h；空白對照組、LIPUS組加入等量PBS，然 后 將LIPUS組、Ce6+LIPUS組 和Ce6-PP1 NB+LIPUS組以0.4 W/cm2、2 MHz超聲輻照1 min，繼續(xù)孵育6 h后進行檢測。

（1）活性氧熒光探針（DCFHDA）法檢測細胞內(nèi)活性氧生成情況：PBS洗滌細胞3次，加入DCFH-DA 37℃孵育30 min，再用PBS洗滌3次充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察細胞內(nèi)活性氧生成情況。

（2）流式細胞術檢測M1型、M2型巨噬細胞的比例：收集細胞重懸于含1%牛血清白蛋白的PBS（BSAPBS），加入5.0 μl流式抗體CD86混勻，于4℃避光孵育30 min；1000 r/min離心5 min棄上清，固定破膜后，加入2.5 μl流式抗體CD206混勻，于4℃避光孵育30 min；加入2.0 ml 1% BSA-PBS，1000 r/min離心5 min棄上清；加入0.5 ml 1%BSA-PBS重懸細胞，應用流式細胞儀檢測并計算M1型、M2型巨噬細胞的比例。

（3）ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-10濃度：收集細胞上清液，2300 r/min離心10 min，嚴格按照試劑盒說明書測定TNF-α、IL-6、IL-10濃度。

三、統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、Ce6-PP1 NB的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性及細胞毒性

光學顯微鏡及透射電子顯微鏡下，Ce6-PP1 NB呈圓形，形態(tài)規(guī)則，表面光滑，大小均一，分散均勻（圖1A、B）；熒光顯微鏡下，Ce6-PP1 NB殼膜既能呈現(xiàn)紅色熒光，也能呈現(xiàn)綠色熒光（圖1C、D），提示Ce6和PP1均裝載成功。

圖1 Ce6-PP1 NB鏡下觀

Ce6-PP1 NB平均粒徑為（504.25±149.13）nm，多分散指數(shù)為0.301±0.07，平均Zeta電位為（-8.67±0.78）mV。紫外可見吸收光譜顯示Ce6分別在400 nm和660 nm處可見吸收峰，Ce6-PP1 NB吸收光譜與Ce6一致。Ce6標準回歸方程為：Y=0.0401X-0.0009（R2=0.9979），Ce6包封率為（85.63±4.39）%，PP1連接率為（92.78±4.57）%。放置0、1、3、7 d后，Ce6-PP1 NB粒徑和Zeta電位均逐漸增大，Ce6包封率和PP1連接率均逐漸下降。CCK-8細胞毒性實驗結果顯示，0、5、10、20、30 μg/ml的Ce6-PP1 NB與RAW264.7細胞共孵育12 h后，細胞存活率均＞90%；當Ce6-PP1 NB濃度達40 μg/ml時，細胞存活率明顯下降（P＜0.01）。見圖2。

二、體外尋靶實驗結果

RAW264.7細胞與Ce6-PP1 NB共同孵育后，細胞核周圍和細胞膜內(nèi)均可見明顯紅色熒光，提示大量Ce6-PP1 NB聚集；而細胞與Ce6共同孵育后，細胞核周圍和細胞膜內(nèi)紅色熒光不明顯。見圖3。

圖3 體外尋靶實驗觀察Ce6-PP1 NB與RAW264.7細胞結合情況

三、Ce6-PP1 NB的聲敏性和聲動力效應

1.DCFH-DA法檢測結果顯示，Ce6-PP1 NB+LIPUS組細胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，表現(xiàn)為細胞內(nèi)綠色熒光顯著增加，其余各組細胞內(nèi)綠色熒光不明顯。見圖4。

圖4 各組細胞內(nèi)活性氧生成情況

2.流式細胞術檢測結果顯示，與空白對照組比較，LIPUS組和Ce6+LIPUS組M1、M2型巨噬細胞的比例均未見明顯變化，而Ce6-PP1 NB+LIPUS組M1型巨噬細胞的比例減少、M2型巨噬細胞的比例增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖5A～C。

3.ELISA法檢測結果顯示，Ce6-PP1 NB+LIPUS組細胞TNF-α、IL-6濃度均減小，而IL-10濃度增大，與其余各組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖5D～F。

討 論

AS是導致心腦血管疾病的主要病因，其發(fā)病率逐年增高，目前他汀類藥物治療和介入手術治療雖可以延緩斑塊形成，但并不能逆轉AS病程和消除已形成的斑塊。細胞免疫治療已被開始嘗試用于穩(wěn)定斑塊和消退AS病變［6］。巨噬細胞是AS發(fā)生和發(fā)展中最主要的免疫炎癥細胞，主要分為M1型和M2型。其中M1型巨噬細胞有促炎作用，能分泌TNF-α、IL-6、白細胞介素-12等炎癥因子，導致慢性炎癥和斑塊不穩(wěn)定；而M2型巨噬細胞有抑制炎癥作用，能分泌IL-10、轉化生長因子-β等，對AS有治療作用。M1型與M2型巨噬細胞之間的平衡關系可能與血栓栓塞等斑塊結局有關，因此干預巨噬細胞表型轉化可能是治療心血管疾病的一種新策略［6-7］。超聲介導的SDT被證實能調(diào)控巨噬細胞極化，但在抗AS方面的研究剛起步［8-9］，面臨著聲敏劑靶向性差、療效不理想等問題。微泡作為一種多功能載體，不僅可以載藥，還可在超聲刺激下激發(fā)超聲靶向微泡破壞效應，從而提高細胞膜通透性，增強組織對外源性小分子的靶向攝取［10］，而納泡的粒徑較微泡更小，能穿過血管內(nèi)皮細胞之間的孔隙，具有更強的滲透性和滯留效應［11］。本課題組前期實驗研究［12］結果表明，將聲敏劑Ce6與納泡結合，能增加組織對聲敏劑的攝取，增強SDT療效，有望解決SDT在AS研究中的不足?；诖?，本實驗以斑塊SR-A為靶點，構建一種靶向聲敏納泡——Ce6-PP1 NB，以期提高聲敏劑在AS部位的聚集，調(diào)控巨噬細胞極化，達到增強SDT療效的目的。

本實驗制備的Ce6-PP1 NB本質(zhì)是靶向納米超聲造影劑，其大體結構與目前臨床上廣泛應用的超聲造影劑聲諾維相似，由脂質(zhì)外膜和氣體內(nèi)核組成。Ce6-PP1 NB的外膜成分為DPPC和DSPE-PEG，DPPC作為主要脂質(zhì)時，其配體分布均勻、結合面積大、結合后呈圓頂狀，有利于提高納泡的靶向性；DSPE-PEG能顯著增強納泡抵抗氣體損失、氣泡溶解和氣泡聚結的能力，從而提高納泡的穩(wěn)定性。Ce6-PP1 NB的內(nèi)核成分為全氟丙烷，其是一種惰性氣體，常溫下無色、無味、無毒、無生理或藥理活性。本實驗結果顯示，制備的Ce6-PP1 NB呈圓形，形態(tài)規(guī)則，大小均一，分散均勻，Ce6和PP1均成功裝載至納泡上，且Ce6包封率和PP1連接率均較高。制備0～1 d時，Ce6-PP1 NB的粒徑、Zeta電位、Ce6包封率和PP1連接率均無明顯變化；制備3 d以上，Ce6-PP1 NB的粒徑增大，Zeta電位升高，Ce6包封率和PP1連接率均明顯下降，表明Ce6-PP1 NB在制備1 d內(nèi)穩(wěn)定性良好，可以滿足后續(xù)實驗要求。本實驗通過CCK-8細胞毒性實驗檢測其安全性，結果表明Ce6-PP1 NB濃度≤30 μg/ml時，不會對細胞的增殖及活性產(chǎn)生影響，而當其濃度達到40 μg/ml時，會導致細胞活性下降。因此，本實驗后續(xù)采用濃度為30 μg/ml的Ce6-PP1 NB進行體外細胞實驗。

單一的納泡并不能高效、精準地輸送至靶器官或靶組織，而經(jīng)過功能化修飾如連接特異性抗體或配體的納泡才具備主動靶向能力［11］。為了更高效地將納泡輸送至斑塊，需在納泡上裝載一個可精準識別AS的靶點。SR-A是位于單核-巨噬細胞表面的三聚體跨膜糖蛋白，主要參與低密度脂蛋白的轉運和利用，其在AS部位的表達水平隨斑塊內(nèi)巨噬細胞數(shù)量的增加而升高［4，13］，因此可成為靶向斑塊的位點［14］。SR-A能與氨基酸、多肽等多種配體結合，其中PP1（氨基酸序列：LSLERFLRCWSDAPAK）是16個氨基酸分子組成的多肽，其N端的亮氨酸能與SR-A C端的半胱氨酸共價結合，從而識別斑塊［5］?；诖耍緦嶒炌ㄟ^生物素-親和素系統(tǒng)將生物素化PP1連接至生物素化處理后的納泡表面，結果發(fā)現(xiàn)PP1連接率為（92.78±4.57）%。體外尋靶實驗證明，Ce6-PP1 NB對RAW264.7細胞具備主動靶向能力，呈紅色花環(huán)狀分布于細胞核周圍和細胞膜內(nèi)。

SDT主要作用機制之一是活性氧生成，即聲敏劑在超聲作用下獲得能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，由于激發(fā)態(tài)的聲敏劑不穩(wěn)定，當其恢復至基態(tài)時將釋放部分能量，細胞內(nèi)的基態(tài)三重態(tài)氧分子獲得該能量進而變成活性氧如單線態(tài)氧、超氧自由基等［15］?；钚匝跏荢DT治療斑塊最關鍵的聲化學物，可引發(fā)線粒體膜電位降低、細胞骨架收縮、染色質(zhì)濃縮、膜破裂及DNA斷裂等一系列生物學反應從而導致細胞凋亡［16］?；钚匝跎墒锹暶魟┗罨慕Y果，也是目前評價SDT療效的主要指標［17-18］。本實驗通過DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)活性氧生成情況，結果顯示Ce6-PP1 NB+LIPUS組細胞內(nèi)綠色熒光最為明顯，表明Ce6裝載至納泡后并不影響其被細胞攝取及活性氧生成。

以往調(diào)控巨噬細胞極化的研究主要涉及各種生物因素或化學藥物［19-20］，關于物理刺激對巨噬細胞極化的調(diào)控所知有限。超聲作為一種物理治療方式，與化學治療相比，其優(yōu)勢在于靶向性和生物安全性較好，因此治療性超聲越來越受到關注和重視。既往研究［21］表明，LIPUS能調(diào)控巨噬細胞極化，促進其從M1型向M2型轉化。在骨關節(jié)炎小鼠模型中，LIPUS能減少滑膜中M1型巨噬細胞極化，并促進M2型巨噬細胞極化［22］；陳績等［23］研究也發(fā)現(xiàn)LIPUS不僅能阻止巨噬細胞向M1型極化，還能減弱巨噬細胞的吞脂能力。Yang等［9］研究發(fā)現(xiàn)SDT處理的斑塊中M1型巨噬細胞減少，M2型巨噬細胞增多，M2/M1值增大，表明LIPUS介導的SDT也具有調(diào)控巨噬細胞極化的作用。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和Ce6+LIPUS組比較，Ce6-PP1 NB+LIPUS組M1型巨噬細胞的比例減少，M2型巨噬細胞的比例增加；進一步通過ELISA法證實，Ce6-PP1 NB+LIPUS組中TNF-α、IL-6濃度均減小，IL-10濃度增大，提示Ce6裝載至納泡后能增強SDT療效，促進M1型巨噬細胞向M2型轉化，從而改善炎癥。

綜上所述，本實驗成功制備AS靶向聲敏納泡Ce6-PP1 NB，其藥物包封率高、細胞相容性好、組織靶向性高，在LIPUS作用下能增強SDT療效，并促進M2型巨噬細胞極化，有望提高AS斑塊的靶向精準治療。后期將對SDT調(diào)控巨噬細胞極化的分子機制和不同LIPUS參數(shù)下SDT對巨噬細胞極化的效應進一步研究。