王欣欣，吳霞，李德富，穆暢道，葛黎明

(四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都，610065)

傳統(tǒng)由表面活性劑穩(wěn)定的乳液，存在表面活性劑用量較多、成本高、生物毒性較大和不穩(wěn)定等問題。由固體顆粒不可逆地吸附在兩相界面上以改變空間位阻來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的Pickering乳液，具有優(yōu)良的抗聚集、抗絮凝和奧氏成熟等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[1-2]。目前，Pickering乳液的研究多集中在無機(jī)顆粒上，這些無機(jī)或合成的固體顆粒存在著潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，大多被應(yīng)用于石油、化工等領(lǐng)域。當(dāng)前，研究人員致力于研發(fā)以廣泛來源于動(dòng)植物、低/無毒可食、可生物降解和生物相容性好的膠體粒子穩(wěn)定的Pickering乳液[3]。明膠是一種蛋白質(zhì)生物聚合物，由天然膠原部分水解得到。它價(jià)格低廉，具有良好的生物相容性、生物降解性，在制備食品級(jí)膠體粒子方面具有很大的潛力。然而，明膠具有強(qiáng)親水性且能與水形成可逆凝膠，難以制備穩(wěn)定且單分散的明膠納米顆粒[4]。此外，在先前大多數(shù)的研究中，制備明膠基Pickering乳液往往需要加入對(duì)人體有毒害的戊二醛[5]等交聯(lián)劑對(duì)明膠進(jìn)行疏水改性，大大限制了其在食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。京尼平是一種天然環(huán)烯醚萜類化合物，在中藥中廣泛用作利膽劑和消炎劑[6]。據(jù)報(bào)道，京尼平的毒性較戊二醛的毒性低5 000～10 000倍，常被用來替代傳統(tǒng)的小分子醛交聯(lián)劑，是一種生物相容性好和低毒性的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑[7]。因此，京尼平可被用于制備安全無毒的明膠納米顆粒。

基于此，本研究以明膠為基料，通過2次去溶劑結(jié)合京尼平交聯(lián)固化明膠法制備得到明膠納米顆粒，并表征其微觀形貌、三相接觸角、粒徑和Zeta電位。然后以明膠納米顆粒為乳化劑制備Pickering乳液，研究了明膠納米顆粒的濃度、乳化轉(zhuǎn)速、乳化時(shí)間、pH值和鹽濃度對(duì)制備的Pickering乳液的影響，獲得明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的最佳制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B型明膠(醫(yī)用級(jí)，膠強(qiáng)度為Bloom 240 g)、玉米油(AR級(jí))，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙酮(AR級(jí))、NaOH(AR級(jí))、鹽酸(AR級(jí))、NaCl(AR級(jí))，成都市科隆化學(xué)品有限公司；京尼平(HPLC, >98%)，臨川之信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra Turrax T25均質(zhì)乳化機(jī)，德國IKA公司；FE 28-XX pH計(jì)，梅特勒-托利多(上海)有限公司；ST 16R高速冷凍離心機(jī)、Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Helios G4 UC掃描電子顯微鏡，美國FEI公司；SPM-9600原子力顯微鏡，日本Shimadzu公司；Nano-ZS ZEN3600激光粒度儀，英國Malvern公司；OCAH光學(xué)接觸角測量儀，德國DATAPHYSICS公司；PH-100-DB800U-1PL光學(xué)顯微鏡，鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司；MCR302模塊化智能型旋轉(zhuǎn)流變儀，奧地利Anton Paar公司。

1.3 明膠納米顆粒的制備

將1.250 g明膠于45 ℃下溶解于25.0 mL去離子水中得到明膠溶液。然后緩慢加入25.0 mL丙酮，靜置以待溶液分層。取上層乳白色液體復(fù)溶于25.0 mL去離子水中，之后使用NaOH溶液將其pH值調(diào)為12.0。將上述混合液于50 ℃下持續(xù)攪拌，并以1.0 mL/min的速度滴加75.0 mL丙酮。接著加入0.125 0 g京尼平粉末，于50 ℃下繼續(xù)攪拌5 h。將混合液于10 000 r/min下離心35 min后使用去離子水清洗下層沉淀3次。最后將明膠納米顆粒分散于去離子水中，緩慢揮發(fā)掉殘余的丙酮。

1.4 明膠納米顆粒的表征

1.4.1 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察

將明膠納米顆粒懸浮液滴加到導(dǎo)電膠上，真空干燥24 h，在樣品表面噴金后使用掃描電子顯微鏡觀察明膠納米顆粒的微觀形貌。

1.4.2 原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)觀察

將10 μL明膠納米顆粒懸浮液滴于云母片上，真空干燥24 h后使用原子力顯微鏡觀察明膠納米顆粒的微觀形貌。

1.4.3 三相接觸角測定

將1片干凈的玻璃片浸入100 mg/L的明膠納米顆粒懸浮液中，靜置10 s后取出，于真空干燥箱中緩慢蒸發(fā)掉液體，重復(fù)操作3次。將干燥后的玻璃片放置于正己烷中，利用光學(xué)接觸角測量儀測定明膠納米顆粒的三相接觸角。

1.4.4 紅外光譜分析

分別將2 mg明膠和冷凍干燥的明膠納米顆粒與200 mg KBr充分研磨，壓片后利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)儀測定其FTIR光譜。設(shè)置掃描的波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，掃描頻率為4 cm-1/s。

1.4.5 粒徑分布和Zeta電位測定

配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的明膠納米顆粒懸浮液，然后使用激光粒度儀于25 ℃下測定明膠納米顆粒的粒徑。配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的明膠納米顆粒懸浮液，使用0.1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液將其pH值分別調(diào)至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0后使用激光粒度儀于25 ℃下測定明膠納米顆粒在不同pH值下的Zeta電位。

1.5 明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的制備

以明膠納米顆粒為乳化劑，分別研究明膠納米顆粒的濃度、乳化時(shí)間、乳化轉(zhuǎn)速、水相pH值和鹽濃度對(duì)制備的Pickering乳液的影響。

1.5.1 明膠納米顆粒濃度的影響

分別配制質(zhì)量濃度為10.0、15.0、20.0 mg/mL的明膠納米顆粒懸浮液，按照明膠納米顆粒懸浮液與玉米油體積比為1∶4加入玉米油，然后使用均質(zhì)機(jī)于13 000 r/min下乳化90 s，制備得到明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液。

1.5.2 乳化時(shí)間的影響

將質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL的明膠納米顆粒懸浮液與玉米油按體積比為1∶4混合，然后使用均質(zhì)機(jī)于13 000 r/min下乳化30、60、90、120 s，制備得到明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液。

1.5.3 乳化轉(zhuǎn)速的影響

將質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL的明膠納米顆粒懸浮液與玉米油按體積比為1∶4混合，然后使用均質(zhì)機(jī)于7 000、10 000、13 000、16 000 r/min下乳化90 s，制備得到明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液。

1.5.4 水相pH值的影響

配制質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL的明膠納米顆粒懸浮液，分別調(diào)節(jié)其pH值為6.0、8.0、10.0、12.0。按照明膠納米顆粒懸浮液與玉米油體積比為1∶4加入玉米油，然后使用均質(zhì)機(jī)于13 000 r/min下乳化90 s，制備得到明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液。

1.5.5 鹽濃度的影響

配制質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL的明膠納米顆粒懸浮液，分別加入0、25、50、75 mmol/L的NaCl溶液，調(diào)節(jié)其pH值為8.0。按照明膠納米顆粒懸浮液與玉米油體積比為1∶4加入玉米油，然后使用均質(zhì)機(jī)于13 000 r/min下乳化90 s，制備得到明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液。

1.6 明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的表征

1.6.1 Pickering乳液的微觀形貌觀察及粒徑統(tǒng)計(jì)

將制備的Pickering乳液分散在去離子水中，取少量滴在載玻片上，然后使用光學(xué)顯微鏡觀察Pickering乳液的微觀形貌，并通過Nano-measure軟件統(tǒng)計(jì)其粒徑。

1.6.2 Pickering乳液的流變性能測試

使用模塊化智能型旋轉(zhuǎn)流變儀測定Pickering乳液的流變性能。采用平行板流變模式(plate-plate mode, PP25)，并在1 Hz下對(duì)樣品進(jìn)行應(yīng)變掃描，測量溫度為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 明膠納米顆粒的制備及表征

通過2次去溶劑結(jié)合京尼平交聯(lián)固化明膠法制備得到的明膠納米顆粒呈光滑且致密的球形，分散性好，直徑約為150 nm，如圖1-a和圖1-b所示。由原子力顯微鏡的三維高度圖可知，明膠納米顆粒的平均垂直高度約為15 nm，明顯小于其直徑，表明明膠納米顆粒為軟顆粒，有利于制備穩(wěn)定的Pickering乳液[8]。

a-SEM圖;b-AFM圖;c-接觸角測量圖;d-FT-IR圖;e-粒徑分布圖;f-Zeta電位圖1 明膠納米顆粒的SEM圖，AFM圖，接觸角測量圖，F(xiàn)T-IR圖，粒徑分布圖，Zeta電位Fig.1 SEM images， AFM images, contact angel, FT-IR spectra, size distribution and Zeta potential characterization of gelatin nanoparticles

固體顆粒的表面潤濕性直接影響Pickering乳液的類型和穩(wěn)定性，根據(jù)WILLIAMS等[9]提出的“液滴捕獲法”測得明膠納米顆粒的三相接觸角θow為76.6°。表明明膠納米顆粒具有較強(qiáng)的親水性能，適合用于制備水包油(O/W)型Pickering乳液[10]，如圖1-c所示。

由圖1-e可知，利用激光粒度儀測定新制備的明膠納米顆粒的粒徑為(186.7±0.065) nm，其略大于SEM和AFM的測試結(jié)果。主要是因?yàn)榉稚⒃谒械拿髂z納米顆粒充分溶脹，導(dǎo)致其粒徑增大。儲(chǔ)存6個(gè)月后的明膠納米顆粒的粒徑為(186.9±0.028) nm，結(jié)果表明2次去溶劑結(jié)合京尼平交聯(lián)固化明膠法能制備出穩(wěn)定的明膠納米顆粒。

納米顆粒的Zeta電位影響著其自身的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，也決定著其制備的乳液穩(wěn)定性[18]。明膠納米顆粒在不同pH值下的Zeta電位如圖1-f所示。當(dāng)pH≤4.0時(shí)，明膠納米顆粒帶6.0 mV的正電荷；隨著pH值的不斷增加，明膠納米顆粒所帶的正電荷減少，當(dāng)pH值為6.0左右時(shí)，明膠納米顆粒表面所帶的凈電荷為0，即達(dá)到明膠納米顆粒的等電點(diǎn)；隨著pH值的繼續(xù)增大，明膠納米顆粒帶負(fù)電荷，且所帶的負(fù)電荷隨著pH值的增加而逐漸增大。當(dāng)pH值為12時(shí)，明膠納米顆粒的Zeta電位為-28.5 mV。因此明膠是1種兩性電解質(zhì)，含有大量酸性氨基酸(含有羧基)和堿性氨基酸(含有氨基)。明膠分子中的氨基和羧基等官能團(tuán)通過得失電子以分別在較高pH值溶液中帶負(fù)電荷，而在較低pH值溶液中帶正電荷。

2.2 明膠納米顆粒的濃度對(duì)Pickering乳液的影響

不同濃度明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的直觀圖如圖2-a所示。當(dāng)明膠納米顆粒的質(zhì)量濃度大于15.0 mg/mL時(shí)，制備的Pickering乳液在倒置后仍然能夠承受自身質(zhì)量而不流動(dòng)，表明其形成了半固體凝膠狀Pickering乳液。由圖2-b和圖2-c可知，10.0、15.0、20.0 mg/mL明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的液滴直徑分別為(92.50±3.62)、(74.53±4.53)和(43.67±3.37) μm。隨著明膠納米顆粒濃度的增加，制備的Pickering乳液液滴尺寸不斷減小，液滴的均勻性不斷提高。隨著顆粒濃度的增大，油水界面吸附的固體顆粒數(shù)量增多，多余的顆?？梢栽谒嘀休p微絮凝，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性。綜合乳液的穩(wěn)定性及其液滴直徑，確定制備Pickering乳液的最佳顆粒質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL。

a-穩(wěn)定的Pickering乳液;b-Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖;c-平均粒徑圖2 不同濃度的明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液，Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖及平均粒徑Fig.2 Images, optical micrographs and average emulsion particle size of Pickering emulsions prepared using different concentration of gelatin nanoparticles

2.3 乳化時(shí)間對(duì)Pickering乳液的影響

在不同乳化時(shí)間下制備的Pickering乳液如圖3所示。僅有乳化90 s制備的Pickering乳液在倒置情況下能夠承受自身質(zhì)量而不流動(dòng)。當(dāng)乳化時(shí)間從30增加到90 s時(shí)，乳液液滴尺寸不斷減小，與文獻(xiàn)報(bào)道的情況相符[19]。乳化時(shí)間的增加有利于顆粒在體系中的分散，同時(shí)能幫助其遷移到油水界面上進(jìn)行鋪展，形成的液滴尺寸也有所減小[20]。繼續(xù)增加乳化時(shí)間至120 s時(shí)，液滴的尺寸增大。這可能是由于持續(xù)的能量輸入造成已吸附在界面處的顆粒的重排，乳液發(fā)生相反轉(zhuǎn)或形成多重乳液[21]，進(jìn)而破壞了乳液的穩(wěn)定性。因此，確定乳化的最佳時(shí)間為90 s。

a-穩(wěn)定的Pickering乳液;b-Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖;c-平均粒徑圖3 明膠納米顆粒在不同乳化時(shí)間下穩(wěn)定的Pickering乳液，Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖及平均粒徑Fig.3 Images, optical micrographs and average emulsion particle size of Pickering emulsions prepared under different emulsification time

2.4 乳化轉(zhuǎn)速對(duì)Pickering乳液的影響

低乳化轉(zhuǎn)速下制備的Pickering乳液有油相析出，高乳化轉(zhuǎn)速下制備的乳液在倒置后不能承受自身質(zhì)量而發(fā)生流動(dòng)，均不能形成穩(wěn)定的乳液。由圖4可知，在13 000 r/min乳化轉(zhuǎn)速下能夠制備穩(wěn)定的Pickering乳液。

a-穩(wěn)定的Pickering乳液;b-Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖;c-平均粒徑圖4 明膠納米顆粒在不同乳化轉(zhuǎn)速下穩(wěn)定的Pickering乳液，Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖及平均粒徑Fig.4 Images, optical micrographs and average emulsion particle size of Pickering emulsions prepared under different emulsification speed

當(dāng)均質(zhì)乳化轉(zhuǎn)速小于13 000 r/min時(shí)，乳液的液滴尺寸較大。表明均質(zhì)轉(zhuǎn)速過低，輸入體系的能量小，很難打破兩相界面使納米顆粒吸附在油水界面，形成穩(wěn)定的乳液。然而，當(dāng)乳化轉(zhuǎn)速提高到16 000 r/min時(shí)，制備的乳液液滴分散不均勻，很多固體顆粒發(fā)生堆疊形成聚集體。轉(zhuǎn)速過大使得顆粒間的外力增強(qiáng)，將原來已吸附于兩相界面處的顆粒發(fā)生異動(dòng)并重排，部分顆粒游離于水相中，發(fā)生聚集及堆疊。在乳化轉(zhuǎn)速為13 000 r/min下制備的乳液的液滴分散相對(duì)均一，尺寸為(41.71±0.86) μm。綜合乳液的穩(wěn)定性和液滴的顯微鏡圖確定乳化的最佳轉(zhuǎn)速為13 000 r/min。

2.5 水相pH值對(duì)Pickering乳液的影響

如圖5所示，當(dāng)水相pH為12.0時(shí)制備的乳液發(fā)生了油水相分離。明膠納米顆粒在界面上的吸附效率強(qiáng)烈依賴其表面所帶電荷或溶液的離子強(qiáng)度。在pH值較高的條件下，過多NaOH的加入極大程度地改變了體系的離子強(qiáng)度，屏蔽了顆粒表面的電荷量，影響其溶脹程度[22]。而顆粒在界面處的溶脹程度會(huì)影響到其是否能穩(wěn)定吸附，故pH過高時(shí)無法形成穩(wěn)定的Pickering乳液，由此可見顆粒的溶脹性能與乳液的穩(wěn)定性關(guān)聯(lián)較大。當(dāng)水相pH值為6時(shí)，接近明膠納米顆粒的等電點(diǎn)，均質(zhì)乳化后制備的乳液立即發(fā)生大范圍的相分離。此外，通過京尼平與明膠發(fā)生席夫堿反應(yīng)制備的明膠納米顆粒在酸性條件下由于席夫堿的斷裂而遭到不同程度的破壞，從而影響明膠納米顆粒的表面潤濕性。結(jié)果表明，酸性及過堿性環(huán)境不利于制備明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液。然而，在pH為8時(shí)能夠制備乳液液滴直徑為(55.00±5.06) μm的穩(wěn)定的Pickering乳液。帶電的軟顆粒在界面上表現(xiàn)出類似軟凝膠的行為，從而導(dǎo)致更加穩(wěn)定的乳液的形成。而電中性軟顆粒包覆液滴表面所形成的吸附層非常脆弱，因而不能依此制備出穩(wěn)定的乳液。穩(wěn)定的Pickering乳液的制備依賴水相pH值，本研究最佳的水相pH值為8.0。

a-穩(wěn)定的Pickering乳液;b-Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖;c-平均粒徑圖5 明膠納米顆粒在不同pH下穩(wěn)定的Pickering乳液，Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖及平均粒徑Fig.5 Images, optical micrographs and average emulsion particle size of Pickering emulsions prepared under different pH

2.6 鹽濃度對(duì)Pickering乳液的影響

水相中的電解質(zhì)會(huì)在一定程度上影響顆粒的聚沉，從而影響到乳液的形成[23]。由圖6可知，在NaCl濃度為0、25、50和75 mmol/L下制備的Pickering乳液液滴直徑分別為(42.51±1.91)、(50.81±1.75)、(44.43±1.05)、(47.99±1.45) μm。乳液液滴直徑隨著體系中NaCl濃度的增加而略微增加，這歸因于離子官能團(tuán)的水合作用。當(dāng)水化斥力與范德華引力相比較弱時(shí)，粒子就會(huì)聚集，從而影響乳液的穩(wěn)定性[24]。從圖6-b可以看出，當(dāng)NaCl濃度為50 mmol/L時(shí)，制備的Pickering乳液液滴的粒徑分布相對(duì)較均勻?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，明膠納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的最佳制備工藝參數(shù)為：顆粒質(zhì)量濃度20.0 mg/mL，乳化時(shí)間90 s，乳化轉(zhuǎn)速13 000 r/min，水相pH 8.0，NaCl濃度50 mmol/L。

a-穩(wěn)定的Pickering乳液;b-Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖;c-平均粒徑圖6 明膠納米顆粒在不同濃度的NaCl中穩(wěn)定的Pickering乳液，Pickering乳液的光學(xué)顯微鏡圖及平均粒徑Fig.6 Images, optical micrographs and average emulsion particle size of Pickering emulsions prepared under different concentration of NaCl aqueous solution

2.7 Pickering乳液的流變性能研究

由于乳液的流變性可作為食品結(jié)構(gòu)感知的指示，因此對(duì)最佳工藝下制備的Pickering乳液的流變性能進(jìn)行測試，如圖7所示。

圖7 最佳工藝下制備的Pickering乳液的儲(chǔ)能模量(G′)和損失模量(G″)的應(yīng)變依賴性曲線Fig.7 Storage modulus (G′) and loss modulus (G″) of Pickering emulsion prepared under the optimum process

在低剪切應(yīng)變時(shí)，Pickering乳液的儲(chǔ)能模量(G′)大于損耗模量(G″)，表明Pickering乳液在此階段具有彈性或類似固體的行為；隨著剪切應(yīng)變力的增加，G′不斷減小，G″不斷增大。當(dāng)剪切應(yīng)變大于40%時(shí)，G″與G′相交，表明已達(dá)到液體和固體的臨界點(diǎn)。對(duì)Pickering乳液施加的應(yīng)變繼續(xù)增大時(shí)，G″高于G′。這是由于Pickering乳液在高剪切應(yīng)變力下，乳液內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重組或乳液液滴發(fā)生了流動(dòng)[25]。結(jié)果表明，在最佳工藝下制備的Pickering乳液具有良好的穩(wěn)定性，其添加到食品中可以為食物提供形態(tài)可塑性和感官特性，在食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

通過二次去溶劑結(jié)合京尼平交聯(lián)固化明膠法制備得到的明膠納米顆粒的粒徑為(186.7±0.065) nm，等電點(diǎn)約為6，三相接觸角為76.6°。以明膠納米顆粒為乳化劑，通過均質(zhì)乳化技術(shù)制備穩(wěn)定的Pickering乳液的最佳制備條件為：明膠納米顆粒的質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL，乳化時(shí)間為90 s，乳化轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，水相pH值為8.0，NaCl濃度為50 mmol/L。最優(yōu)條件下制備的Pickering乳液的液滴粒徑為(44.43±1.05) μm。最佳工藝下制備的Pickering乳液具有良好的穩(wěn)定性，在食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。