馮荊舒，張榮，高獻(xiàn)禮，代春華，何榮海*，馬海樂

1(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)2(江蘇大學(xué) 食品物理加工研究院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

食醋作為我國傳統(tǒng)的食品調(diào)味品，是由糧食蔬果在多種微生物的作用下，通過淀粉糖化、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵制成[1]，其營養(yǎng)價值豐富，含有多酚[2]、黃酮[3]等物質(zhì)，具有殺菌消炎[4]、降血壓、降血脂[5]、預(yù)防癌癥、心血管疾病[6]等功效。

醋酸菌為革蘭氏陰性好氧菌，可將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸[7]，產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味，進(jìn)而影響產(chǎn)品的品質(zhì)[8]。醋酸菌作為醋酸發(fā)酵這一過程的“主力菌”，在食醋的生產(chǎn)發(fā)酵過程中不可或缺，其發(fā)酵性能很大程度地影響食醋企業(yè)的生產(chǎn)發(fā)展[9]，篩選高產(chǎn)酸且具有良好耐受性的醋酸菌菌株始終是食醋產(chǎn)業(yè)的研究方向。楊杰等[10]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法從廣西民間釀醋作坊的醋醅中分離1株產(chǎn)酸量高且具有一定耐熱和耐乙醇性能的醋酸桿菌。王超敏等[11]從山西老陳醋醋醅中分離篩選出18株巴氏醋桿菌、2株醋化醋桿菌，其中巴氏醋桿菌SAV-CP 1884性能最好。趙馨儀等[12]從山西老陳醋醋醅中篩選出7株產(chǎn)酸菌，其中有3株產(chǎn)酸量高且耐受性良好，分別為巴氏醋桿菌SAV-1、植物乳桿菌SAV-7和SAV-8。

鎮(zhèn)江香醋作為我國四大名醋之一，以優(yōu)質(zhì)糯米為原材料，采用多菌混合式固態(tài)分層發(fā)酵的方法，其醋醅中蘊(yùn)藏著較為豐富的菌種資源。因此，本實(shí)驗(yàn)以鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過程中的醋醅為樣品，分離篩選出優(yōu)良醋酸菌，并進(jìn)行生理生化及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)，以期篩選出優(yōu)良菌株，豐富菌種資源，為食醋行業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋醅，鎮(zhèn)江恒順香醋有限公司；酵母粉、葡萄糖、瓊脂、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaOH、溴甲酚紫，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HVE-50滅菌鍋，日本Hirayama公司；OptiClean1300垂直流潔凈工作臺，瑞士Kuhnrikon公司；SPX250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器公司；HYL-C3組合搖床，太倉強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，0.04%(體積分?jǐn)?shù))溴甲酚紫50 mL，瓊脂20，121 ℃滅菌20 min，待溫度降約70 ℃時加入30 mL無水乙醇。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min，待溫度降約70 ℃時加入30 mL無水乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏10，葡萄糖10，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.1，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min，待溫度降約70 ℃時加入60 mL無水乙醇。

1.3 分離及鑒定流程

醋醅樣品→稀釋涂布→分離純化→革蘭氏染色→定性試驗(yàn)→定量試驗(yàn)→培養(yǎng)單菌落→形態(tài)觀察→生理生化試驗(yàn)→分子生物學(xué)鑒定→斜面保藏

1.3.1 分離

稱取10 g樣品置于含有90 mL無菌生理鹽水的三角燒瓶，振蕩30 min，梯度稀釋后涂平板，置于30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d。從中挑選變色圈大而清晰，且長勢較好的單菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 純化

將上述單菌落純化培養(yǎng)3次，確認(rèn)形態(tài)一致后，挑選其中長勢較好、變色圈大而清晰的單菌落保藏[13]。

1.3.3 革蘭氏染色

對篩選菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并借助顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)[14]。

1.3.4 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)

取5 mL種子液，離心去除菌體，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，加入5～6滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% FeCl3溶液，離心取上清液，若水浴加熱5 min有紅褐色沉淀，則初步認(rèn)定為產(chǎn)醋酸菌。離心分離沉淀后加入1 mL濃硫酸，沉淀溶解，再加1 mL無水乙醇，若加熱沸騰產(chǎn)生乙酸乙酯香味，則為醋酸菌[15]。

1.3.5 初篩

根據(jù)革蘭氏染色和產(chǎn)酸定性試驗(yàn)初步篩選出醋酸菌。

1.3.6 復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)6 d，采用酸堿滴定法測定發(fā)酵液總酸度[16]，并根據(jù)結(jié)果篩選出產(chǎn)量較高的菌株。酸堿滴定法[17]：將2 mL發(fā)酵液加至50 mL蒸餾水中，加入3～5滴0.5%(體積分?jǐn)?shù))酚酞酒精溶液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至淺粉色。發(fā)酵產(chǎn)酸量的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：L，產(chǎn)酸量，g/L；V，發(fā)酵液樣品消耗NaOH溶液的體積，mL；V0，對照組(空白培養(yǎng)基)消耗NaOH溶液的體積，mL；c，NaOH溶液的濃度，mol/L；60，醋酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；V1，樣品的體積，mL。

1.3.7 菌種鑒定

1.3.7.1 生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)[18]與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]對菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.7.2 分子生物學(xué)鑒定

由于上述方法不夠精準(zhǔn)，因此采用分子生物學(xué)鑒定方法進(jìn)一步鑒定菌株[20]。按照DNA提取試劑盒的說明提取DNA。選取通用引物27F和1492R(27F：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對菌株的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21]。純化后送至上海生工測序。根據(jù)檢測結(jié)果，在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫檢索同源序列，找到與目標(biāo)菌株同源性最大的模式菌株，利用MEGA7.0對DNA序列進(jìn)行多序列比對[22]，并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23]，以確定篩選菌株的種屬[24]。

1.4 生長發(fā)酵性能的測定

1.4.1 生長曲線的測定

菌株活化后接至種子液培養(yǎng)基，置于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，以空白培養(yǎng)基作對照，每2 h測定樣品在600 nm處的吸光度值OD600，并繪制生長曲線。

1.4.2 乙醇對菌株生長發(fā)酵的影響

將活化的菌株分別接入加有3%、9%、12%、15%(體積分?jǐn)?shù))無水乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h分別取樣，測定醋酸菌在600 nm下的吸光度值OD600，并測量培養(yǎng)72 h的產(chǎn)酸量。

1.4.3 乙酸對菌株生長發(fā)酵的影響

將活化的菌株分別接入加有1、2、3、4%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h分別取樣，測定醋酸菌在600 nm下的吸光度值OD600，并測量培養(yǎng)72 h的產(chǎn)酸量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。運(yùn)用統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，顯著性水平設(shè)定值為0.05，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選結(jié)果

2.1.1 分離純化

溴甲酚紫在pH為5.2～6.8內(nèi)，顏色會由黃色變成紫色。1992年BOARD等[25]利用該特性分離產(chǎn)酸菌。由于產(chǎn)酸菌代謝產(chǎn)酸，菌落在紫色的平板上就會呈現(xiàn)出黃色的變色圈，挑取其中長勢較好的98個單菌落分離純化。

2.1.2 初篩

通過革蘭氏染色和產(chǎn)酸定性試驗(yàn)，剔除部分革蘭氏陽性及不產(chǎn)醋酸的菌株，初步篩選出41株醋酸菌。

2.1.3 復(fù)篩

通過產(chǎn)酸定量試驗(yàn)，復(fù)篩出其中產(chǎn)酸量較高的5株菌。如圖1所示，各菌株的產(chǎn)酸量隨時間的增加而不斷增高，發(fā)酵1～4 d，產(chǎn)酸量均迅速增加，而發(fā)酵4～6 d，產(chǎn)酸量緩慢增加并趨于平緩。菌株H3的產(chǎn)酸量始終高于其他菌株，最高為44.16 g/L。

圖1 各菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.1 Acid production curves of each strain

然后對其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，如表1所示，各菌株每代的產(chǎn)酸量均發(fā)生不同程度的變化。其中菌株H3各代的產(chǎn)酸量之間沒有顯著性差異，遺傳性能穩(wěn)定。結(jié)合圖1和表1，選擇菌株H3為目的菌株。

表1 各菌株傳代培養(yǎng)產(chǎn)酸量的測定 單位：g/LTable 1 Determination of acid production of each strain in subculture

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征

如圖2所示，菌株H3的菌落在溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基上呈米黃色，不透明，圓形，邊緣規(guī)整，有凸起，質(zhì)地稀軟，表面光滑；革蘭氏染色后呈革蘭氏陰性且短桿狀，單個或成對、成鏈排列，無芽孢。

a-菌落形態(tài);b-細(xì)胞形態(tài)圖2 菌株H3的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)圖Fig.2 Colony morphology and cell morphology of strain H3

2.2.2 生理生化鑒定

接觸酶試驗(yàn)陽性；不產(chǎn)生水溶性棕色色素；不產(chǎn)纖維素；不水解淀粉；生酮試驗(yàn)菌落周圍有紅色沉淀生成；在乙酸、乳酸氧化試驗(yàn)中菌落周圍產(chǎn)生乳白色的暈圈；產(chǎn)葡萄糖酸試驗(yàn)中菌落周圍產(chǎn)生透明圈。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步確定菌株H3屬于醋桿菌屬(Acetobacter)。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.2.3.1 基因片段提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

將提取的DNA片段擴(kuò)增后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶如圖3所示，可以看出菌株H3的16S rDNA序列長度約1 500 bp，與預(yù)計的片段大小相符，表明DNA提取擴(kuò)增成功，可進(jìn)行后續(xù)操作。

圖3 菌株H3的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of strain H3

2.2.3.2 核苷酸序列分析

將菌株H3的16S rDNA序列上傳到數(shù)據(jù)庫中比對，結(jié)果如表2所示，通過比對發(fā)現(xiàn)H3與序列號為KF030784.1的Acetobacterpomorum的同源性最高，相似度達(dá)到99.86%。因而可確定篩選菌株屬于果實(shí)醋桿菌(Acetobacterpomorum)。

表2 菌株H3的序列比對結(jié)果Table 2 Sequence alignment results of strain H3

2.2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析菌株H3的親緣關(guān)系，結(jié)果如圖4所示，菌株H3與A.pomorum處于同一分支，表明親緣關(guān)系最近。綜合上述分析結(jié)果，最終將菌株H3鑒定為果實(shí)醋桿菌(A.pomorum)。

圖4 菌株H3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain H3

2.3 生長發(fā)酵性能的測定

2.3.1 生長曲線的測定

如圖5所示，菌株H3在接種后至10 h生長較為遲緩，處于生長延滯期；在10～20 h生長曲線呈現(xiàn)直線增長的趨勢，處于指數(shù)生長期；在20～28 h生長狀態(tài)趨于穩(wěn)定，處于穩(wěn)定期；而后呈現(xiàn)出略微下降的趨勢，逐步進(jìn)入衰退期。

圖5 菌株H3的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain H3

2.3.2 乙醇對菌株生長發(fā)酵的影響

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對菌株的影響如圖6所示，在發(fā)酵產(chǎn)酸方面，菌株H3的產(chǎn)酸量隨乙醇濃度的升高而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，體積分?jǐn)?shù)6%時產(chǎn)酸量最大，為40.5 g/L；在生長量方面，體積分?jǐn)?shù)3%的乙醇能促進(jìn)醋酸菌的生長；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為9%時，生長量略微下降；而體積分?jǐn)?shù)12%～15%的乙醇則會抑制菌株生長。這種現(xiàn)象可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時可為醋酸菌提供營養(yǎng)，利于其生長代謝，而體積分?jǐn)?shù)過高，則會損傷醋酸菌的細(xì)胞膜，不利于細(xì)胞生長。綜合分析，菌株H3可耐受體積分?jǐn)?shù)9%的乙醇。

a-產(chǎn)酸量;b-生長量圖6 不同乙醇含量對菌株產(chǎn)酸量和生物量的影響Fig.6 Effect of different ethanol content on acid production and biomass of strain注：不同小寫字母表示各組之間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3.3 乙酸對菌株生長發(fā)酵的影響

不同體積分?jǐn)?shù)的乙酸對菌株的影響如圖7所示。

a-產(chǎn)酸量;b-生長量圖7 不同乙酸含量對菌株產(chǎn)酸量和生物量的影響Fig.7 Effect of different acetic acid content on acid production and biomass of strain

在發(fā)酵產(chǎn)酸方面，菌株H3的產(chǎn)酸量隨著乙酸體積分?jǐn)?shù)的增高而呈現(xiàn)出先升高后下降再升高的變化趨勢，體積分?jǐn)?shù)4%時產(chǎn)酸量最大，為70.2 g/L，由于乙酸使發(fā)酵液酸度增加，因而測得總酸量包含乙酸的添加量。在生長量方面，隨著乙酸含量的增加，醋酸菌的生長受到不同程度的抑制，這種現(xiàn)象可能是由于酸性環(huán)境會影響醋酸菌的相關(guān)酶活性，從而影響菌株的生長發(fā)酵。綜合分析，菌株H3可耐受體積分?jǐn)?shù)3%的乙酸。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以發(fā)酵過程中的醋醅為樣品，利用溴甲酚紫顯色平板結(jié)合初篩復(fù)篩試驗(yàn)，篩選出一株產(chǎn)酸量較高、耐受性良好且遺傳性穩(wěn)定的優(yōu)良醋酸菌，通過形態(tài)觀察、生理生化以及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，最終確定該菌株為果實(shí)醋桿菌(Acetobacterpomorum)。該菌株在發(fā)酵第5天產(chǎn)酸量最高，為44.16 g/L；能夠耐受體積分?jǐn)?shù)9%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)3%的乙酸。本實(shí)驗(yàn)由于采用的是自然發(fā)酵過程中的醋醅，相較于純種AS1.41和滬釀1.01，篩選菌株的產(chǎn)酸及耐受能力還有待提高，在后續(xù)研究中可采用物理或化學(xué)誘變的方法進(jìn)一步選育優(yōu)良醋酸菌，推動純種液態(tài)發(fā)酵的食醋工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。