程磊，王正祥

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

蛋白質(zhì)水解物包括多肽、寡肽和氨基酸，是食品、發(fā)酵、化工、醫(yī)藥、飲料、飼料等行業(yè)的重要原料。蛋白質(zhì)的水解程度與水解方式，決定了蛋白水解物的化學(xué)組成、生理活性和物化特性等。相比傳統(tǒng)酸堿水解制備方法，蛋白水解酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)酶法水解，具有條件溫和、易于控制、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)勢[1]。但蛋白水解酶具有水解位點選擇性和底物分子大小偏好性，單一種類蛋白水解酶對特定底物的水解作用往往具有限制性[2-3]。

MEINLSCHMIDT等[4]以多種商品蛋白酶水解大豆分離蛋白，發(fā)現(xiàn)其中堿性蛋白酶(alcalase)水解度最高，可達(dá)13%，此時水解產(chǎn)物中仍有相當(dāng)比例的10～25 kDa大小組分。SCHLEGEL等[5]以9種蛋白酶水解羽扇豆分離蛋白，也發(fā)現(xiàn)使用堿性蛋白酶水解度最高，可達(dá)9.05%，但水解產(chǎn)物中仍有相當(dāng)比例的10～20 kDa大小組分。GRUPPI等[6]用2種商品酶Debitrase HYW20TM和ProlyveTM分別水解乳清蛋白、酪蛋白和乳蛋白，水解前后分子質(zhì)量在10 kDa以上的成分比例由70%～95%降至2%～25%，分子質(zhì)量在1～10 kDa的成分比例由4%～35%升至35%～55%。ALAHMAD等[7]使用無花果蛋白酶水解鳙魚蛋白，水解度分別為13.36%、17.09%和20.15%的條件下，分子質(zhì)量在1～10 kDa的成分比例由水解前的2.67%分別增至8.55%、7.69%和6.86%。ZHANG等[8]用堿性蛋白酶(alcalase)水解紫蘇粕蛋白，蛋白電泳結(jié)果顯示反應(yīng)體系中主要成分由反應(yīng)前的52 kDa和32 kDa兩種為主轉(zhuǎn)變?yōu)樗夂蟮?0 kDa以下為主，另有少量37 kDa和30 kDa成分。另外，胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酶(chymotrypsin)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、酸性蛋白酶(acidic protease)和蛋白酶K(proteinase K)等均有被應(yīng)用于寡肽制備的報道[9]，從另一方面說明了蛋白水解酶對特定底物水解作用的局限性。

單一蛋白水解酶對底物水解作用的局限性表現(xiàn)為生成特定比例的寡肽產(chǎn)物，此時使用寡肽水解酶進(jìn)行輔助酶解，理論上可以調(diào)節(jié)酶解的水解度，同時改變產(chǎn)物化學(xué)組成、生理活性和物化特性。因此，寡肽水解酶的獲得對于蛋白水解與蛋白質(zhì)加工具有重要意義和關(guān)鍵價值。為此，本文對來源于黑曲霉的一種未知功能的蛋白水解酶進(jìn)行分子克隆、表達(dá)與功能鑒定，進(jìn)一步就其蛋白水解偏好性進(jìn)行分析，為其應(yīng)用于蛋白質(zhì)加工和寡肽制備等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

黑曲霉(Aspergillusniger)CICIM F0215，為本實驗室前期分離、鑒定并保藏。大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109和畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，為本實驗室保藏，分別用于本研究的重組質(zhì)粒構(gòu)建和酶表達(dá)宿主。質(zhì)粒pPIC9k(Invitrogen)，用于本研究的酶編碼基因克隆與表達(dá)的載體。黑曲霉和大腸桿菌分別采用馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基和LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[10]；畢赤酵母及其重組菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法等參照畢赤酵母操作手冊(Invitrogen)進(jìn)行。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶和LATaqDNA多聚酶，大連寶生物工程有限公司；T4 DNA連接酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒、TRIzol總RNA提取試劑、cDNA合成試劑盒和小量DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒，Thermo Fisher公司；大豆分離蛋白，上海源葉；小麥蛋白、花生分離蛋白、豌豆分離蛋白和芝麻蛋白，江蘇銳陽；BODIPY FL Ester，Invitrogen；苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、抑肽素(pepstatin)、E-64和EDTA-2 Na，Sigma公司。其他生化試劑為分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.3 基因克隆和表達(dá)

黑曲霉總RNA提取及cDNA制備，按照試劑盒使用說明進(jìn)行?；驍U增、連接、轉(zhuǎn)化與鑒定等，按照常規(guī)實驗方法進(jìn)行[10]?；驍U增所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物序列為：5′-GTACTGTCTCTCCATAAACGCGACGG-3′，下游引物為：5′-TGCTCTAGATTACAGAGCGAGAAGTAGGCCGATACC-3′(下劃線部分為限制性酶切位點)。

重組酶的發(fā)酵制備，按照畢赤酵母操作手冊(Invitrogen)所述方法進(jìn)行，以甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵并監(jiān)測發(fā)酵液酶活力變化，至酶活力不再上升時終止發(fā)酵。離心收集發(fā)酵液上清液，制得粗酶液，再經(jīng)鹽析、脫鹽、凝膠過濾色譜等進(jìn)行分離純化。酶蛋白純度分析采用SDS-PAGE法，使用5%的濃縮膠和12%的分離膠，蛋白質(zhì)濃度測定采用BCA(bicinchoninic acid)法[10]。

1.4 酶活力測定與酶學(xué)特征分析

1.4.1 蛋白水解酶酶活力檢測方法

蛋白水解酶酶活力檢測，依照本研究前期建立的均相檢測法進(jìn)行，使用BODIPY NHS Ester標(biāo)記的大豆分離蛋白作為底物[11]?；静襟E為：熒光底物(10 μg/mL)與適度稀釋的酶液分別預(yù)熱至40 ℃后各取100 μL加入微孔板，40 ℃下反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長500 nm、發(fā)射波長530 nm條件下檢測熒光。以底物和酶液作為對照。所測酶活力用相對熒光強度(relative fluorescence intensity，RFI)表示，計算如公式(1)所示：

RFI=FC-(FA+FB)

(1)

式中：FC,樣品熒光值；FA,底物熒光值；FB,酶液熒光值。

1.4.2 溫度和pH對酶活力的影響

溫度和pH對酶活力的影響，按照實驗室常規(guī)方法進(jìn)行[12]。將酶液與底物分別置于25～60 ℃下或pH 3.0～10.0下進(jìn)行酶活力測定。以酶活力最高者為100%，計算相對酶活力，確定酶的最適作用溫度和最適作用pH。

1.4.3 抑制劑對酶的特異性抑制

按1/10或1/100的添加比例，將抑制劑溶液(10 mmol/L PMSF乙醇溶液、100 μmol/L抑肽素二甲亞砜溶液、100 μmol/L E-64去離子水溶液或10 mmol/L EDTA-2 Na去離子水溶液)與適度稀釋的酶液混合，其中PMSF、抑肽素、E-64和蛋白水解酶在4 ℃孵育20 min后檢測殘余酶活力，EDTA-2 Na在4 ℃孵育6 h后檢測殘余酶活力。以不添加抑制劑的酶活力為Uc(對照)，添加抑制劑后檢測的酶活力為Us，抑制劑對蛋白酶的抑制率(I)計算如公式(2)所示：

(2)

1.5 酶底物偏好性分析

采用酶法分別對小麥蛋白、花生分離蛋白、豌豆分離蛋白和芝麻蛋白進(jìn)行水解，制備獲得不同水解度的水解物[13]。以此為底物，按照上述酶活力測定分析重組酶對其水解作用，底物質(zhì)量濃度為10 g/L，反應(yīng)條件為40 ℃和pH 7.0。

1.6 生物信息學(xué)分析方法

黑曲霉基因組信息，參照A.nigerCBS 513.88基因組序列(美國國立生物技術(shù)信息中心)；序列比對分析使用在線分析程序BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行；信號肽分析使用在線分析程序SignalP 6.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP)進(jìn)行分析；氨基酸序列比對分析使用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和BioEdit Sequence Alignment Editor軟件進(jìn)行分析，并使用MEGA 11軟件以Neighbour-joining法構(gòu)建遺傳發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉蛋白水解酶系中存在一個未知功能的全新蛋白水解酶

黑曲霉具有極為豐富的蛋白水解酶體系，以A.nigerCBS 513.88基因組序列為參照序列，進(jìn)行了黑曲霉蛋白水解酶系的分析，發(fā)現(xiàn)其中的XM_001396314開放讀框為一疑似天冬氨酸蛋白酶，將此讀框的編碼基因命名為ypsA，編碼產(chǎn)物命名為YpsA。此讀框由492個氨基酸殘基組成，其N-端含有一個由18個氨基酸殘基組成的典型Sec信號肽。其一級結(jié)構(gòu)與氨基酸序列相似性分析結(jié)果顯示，YpsA與MEROPS數(shù)據(jù)庫中不同來源的天冬氨酸蛋白酶具有較高的一級結(jié)構(gòu)相似性和一定的氨基酸序列相似性(圖1、圖2)，并且與來自于A1A家族的幾種酶相對聚集，遺傳距離相對接近，與Q12303存在最高相似性(33.05%)；而涉及不同家族來源的天冬氨酸蛋白酶的自展值大多較低(<50%)，這與其氨基酸序列相似性較低(<22%)吻合。故此，初步分析結(jié)果揭示YpsA為A1A家族的新成員。

圖1 YpsA在天冬氨酸蛋白水解酶家族中的遺傳距離Fig.1 Genetic distances of YpsA in the aspartic peptidase family注：線段的長度表示用MEGA 11計算的遺傳距離；分支節(jié)點上的數(shù)字代表的是bootstrap百分比，小于50%的bootstrap值未顯示；除YpsA外，各蛋白水解酶以其在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中的登錄號表示，括號中標(biāo)注為各蛋白水解酶在MEROPS數(shù)據(jù) 庫(https://www.ebi.ac.uk/merops/)中的家族分類號

圖2 天冬氨酸蛋白水解酶不同家族成員的氨基酸序列比對與結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Multiple sequence alignment and primary structure analysis of different aspartic peptidases注：“*”指示保守的氨基酸序列；“:”指示保守的替換；“.”指示半保守的替換；序列中的“-”代表空格；信號肽以陰影進(jìn)行標(biāo)注；活性位點以實線方框標(biāo)出；N-端保守的色氨酸和酪氨酸殘基用虛線方框標(biāo)出

進(jìn)一步分析YpsA一級結(jié)構(gòu)組成序列特征(圖2)，發(fā)現(xiàn)已報道的5種A1A家族成員均具有該家族典型的4個基序，分別是組成第1個ψ環(huán)的Asp-Thr-Gly與Gly-H-H-Gly(H為疏水性氨基酸)，以及組成第2個ψ環(huán)的Asp-Thr-Gly與H-H-Gly-Asp/Gln/Asn[14-15]。YpsA在序列對應(yīng)位置也具有全部4個基序，其中第2和第4個基序分別為Gly-Ile-Ala-Gly和Leu-Leu-Gly-Asp。天冬氨酸蛋白酶在多肽鏈N-端具有高度保守的酪氨酸殘基位點和相對保守的色氨酸殘基位點[14]，通過比對可知，這2個位點在YpsA中分別為Trp86和Tyr218。除此之外，進(jìn)行比對的6種天冬氨酸蛋白酶的氨基酸序列，還在其他多個位點具有保守的、保守替換的或是半保守替換的氨基酸殘基，顯示其具有較高的一級結(jié)構(gòu)相似性，可初步確認(rèn)YpsA的催化活性中心組成為Asp79和Asp274[15]。

2.2 ypsA基因克隆、異源表達(dá)及生化特征

基于以上分析，黑曲霉YpsA極有可能是一未知功能的天冬氨酸蛋白酶。為此，進(jìn)一步通過cDNA克隆技術(shù)對其進(jìn)行克隆與表達(dá)。通過提取A.nigerCICIM F0215的總RNA并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以此cDNA為模板設(shè)計核苷酸引物，對其成熟肽編碼序列進(jìn)行擴增并克隆入表達(dá)載體pPIC9K中，獲得了重組質(zhì)粒pPIC-ypsA。經(jīng)核苷酸序列測定與分析后發(fā)現(xiàn)，所克隆的ypsA核苷酸序列與A.nigerCBS 513.88中相應(yīng)序列完全一致。

進(jìn)一步將線性化后的重組質(zhì)粒pPIC-ypsA電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，并通過G418抗性平板篩選獲得轉(zhuǎn)化子Pp-YpsA。按照畢赤酵母操作手冊中的方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵與酶液制備，經(jīng)96 h發(fā)酵后，發(fā)酵液中重組酶的酶活力達(dá)到1 034 386 RFU/mL，進(jìn)一步純化獲得重組YpsA用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)等分析。

在不同溫度和不同pH下，分析了重組YpsA的最適作用pH和溫度，結(jié)果如圖3所示。YpsA在40 ℃和pH 7.0的條件下表現(xiàn)出最高酶活力，并且YpsA能夠在相對較寬的溫度(30～50 ℃)和pH(pH 4.5～9.5)下呈現(xiàn)高活性(相對酶活力>50%)。YpsA的基礎(chǔ)酶學(xué)性質(zhì)與來自釀酒酵母的天冬氨酸蛋白酶Yapsin1和YAP3有明顯差異，后者的最適作用pH分別為4.5～5.5和4.0～4.5，并且較窄pH范圍內(nèi)(分別為pH 4.3～6.0和pH 3.8～5.3)保持50%以上的相對酶活力[16-17]。YpsA與白色念珠菌(Candidaalbicans)中10種天冬氨酸蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)也存在較大差異，后者的多數(shù)天冬氨酸蛋白酶最適作用pH介于3.0～5.0，僅其中的Sap7最適作用pH為6.5，且在pH 4.8～7.3保持50%以上的相對酶活力[18]。此外，現(xiàn)有研究多認(rèn)為天冬氨酸蛋白酶是酸性蛋白酶的代表，而本研究鑒定獲得的來自于黑曲霉的天冬氨酸蛋白酶YpsA，具有中性最適作用pH并具有較為寬泛的高活性pH范圍?？梢?，中性天冬氨酸蛋白酶在自然界中是存在的，并且可能發(fā)揮重要的生理作用。因此，隨著研究的深入，天冬氨酸蛋白酶作為酸性蛋白酶代表的認(rèn)知可以獲得進(jìn)一步完善。此外，中性天冬氨酸蛋白酶這一特征，也有可能使其更便于在特定蛋白質(zhì)生物加工過程的應(yīng)用。

a-溫度對酶活力的影響；b-pH對酶活力的影響圖3 溫度和pH對YpsA活性的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on the activity of YpsA

按照現(xiàn)行蛋白水解酶的分類原則，蛋白水解酶可根據(jù)其活性中心位點類別進(jìn)行區(qū)分，除天冬氨酸蛋白酶家族外，還包括絲氨酸蛋白水解酶、半胱氨酸蛋白水解酶、金屬蛋白水解酶等家族。不同家族蛋白水解酶的催化活性可被不同種類的抑制劑特異性抑制，因而可使用抑制劑對蛋白水解酶進(jìn)行家族分類[19]。為此，本研究進(jìn)一步分析和檢測了不同蛋白酶抑制劑對YpsA活性的抑制作用，結(jié)果顯示，抑肽素對YpsA具有強烈抑制作用，而PMSF、E-64和EDTA對YpsA活性幾乎沒有抑制作用(圖4)。已知抑肽素是一種緊密結(jié)合的可逆抑制劑，其結(jié)構(gòu)類似催化反應(yīng)過程中的四面體中間體，對蛋白水解酶A1和A2家族有特異性抑制作用[20]。依據(jù)本實驗結(jié)果，并結(jié)合上述結(jié)構(gòu)特征分析，可以確定黑曲霉來源的YpsA是一種天冬氨酸蛋白酶。

圖4 蛋白酶抑制劑對YpsA活性的影響Fig.4 Effects of different protease inhibitors on the activity of YpsA

2.3 重組酶YpsA水解不同底物特征

已有研究揭示，天冬氨酸蛋白酶具有酸性pH條件下的高活性和穩(wěn)定性，其被應(yīng)用于多個重要的工業(yè)領(lǐng)域，特別是在食品行業(yè)，如在乳制品行業(yè)的奶酪加工中用作牛奶凝固劑，在果汁或釀酒工業(yè)中用于澄清，在部分食品中用作增味劑等，而特定酶的適合應(yīng)用場景取決于其催化特征[15]。在上述研究中發(fā)現(xiàn)，YpsA的最適作用pH為中性，有效作用pH寬度也與現(xiàn)有報道的大多數(shù)天冬氨酸蛋白酶有較大差異。因此，YpsA應(yīng)該具有獨特的蛋白水解特征。為此，分別使用5種植物來源的蛋白、多肽、寡肽作為底物，進(jìn)一步對YpsA的水解特征進(jìn)行了分析，結(jié)果匯總于圖5?？梢钥闯?，YpsA對低分子質(zhì)量的寡肽(0.45～1.45 kDa)具有相對高的活性，而對所測試的大豆蛋白、小麥蛋白、豌豆蛋白、花生蛋白和芝麻蛋白及其多肽制備物(1.45～12.5 kDa)的水解活性皆較低?？梢?，YpsA對由5～15個氨基酸殘基組成的低分子質(zhì)量寡肽具有水解偏好性，是一種新型天冬氨酸寡肽酶。

圖5 YpsA作用于不同底物的活力特征Fig.5 Relative activities of YpsA on different substrates

3 結(jié)論

通過分子克隆、功能鑒定與分析，確認(rèn)了黑曲霉YpsA為一新型中性天冬氨酸寡肽酶，具有相對更寬泛的最適作用pH范圍，在蛋白質(zhì)生物加工和寡肽制備中可能具有特殊的應(yīng)用價值。