李 鵬，孫延舉，雷夢瑤，孫國鵬，銀 梅，蘇為為，王選年，劉興友，王利平*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)，是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組大小1.7～2.0 kb，無包膜，病毒粒子約為20 nm的二十面體[1]。已知有4種PCV(PCV1～4)可感染豬[2]，其中PCV1為非致病性病毒，PCV2則可引起多種疾病發(fā)生，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎和腎病綜合征、繁殖障礙等疾病[3-4]。2016年，美國首次報(bào)道檢出PCV3，此后世界各地豬場分別檢出PCV3病原，并發(fā)現(xiàn)其與豬的多種臨床疾病有關(guān)，包括流產(chǎn)和產(chǎn)木乃伊胎、多系統(tǒng)炎癥、皮炎和腎病綜合征、腹瀉和呼吸道疾病、先天性震顫等[5-6]。且通過對病變組織原位雜交(ISH)試驗(yàn)顯示，PCV3與發(fā)病仔豬的心肌炎、血管炎和腦炎有關(guān)[7]。由于豬群在感染PCV3和PCV2后具有相似的臨床體征，因此研發(fā)PCV3高敏感性和特異性檢測方法具有重要的臨床意義。

PCR-ELISA是一種包含基因擴(kuò)增、核酸雜交和酶聯(lián)免疫分析的檢測方法[8]。與常規(guī)PCR相比，不僅大幅度提升了靈敏度，還可用于大規(guī)模樣品的半定量分析[9]。本研究針對PCV3基因高度保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，分別標(biāo)記生物素和地高辛標(biāo)，利用鏈霉親和素與生物素之間特異性結(jié)合的原理，使PCR產(chǎn)物牢牢的結(jié)合在酶標(biāo)板上，然后進(jìn)行ELISA檢測。PCR-ELISA將PCR與ELISA高靈敏性的特性有效的結(jié)合，消除了PCR凝膠電泳靈敏度低和ELISA樣品制備復(fù)雜等過程，降低了試驗(yàn)難度，有效提高了檢測的特異性和靈敏性，為PCV3的預(yù)防與控制提供了一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒株豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)陽性病料均由動物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 主要試劑病毒核酸提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、pMD19-T載體、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、QuickCutTMBamHⅠ、QuickCutTMHind Ⅲ和Premix Taq酶均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒采購自O(shè)MEGA公司；鏈霉親和素、羊抗DIG-HRP采購自Merck公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)從GenBank數(shù)據(jù)庫下載具有代表性的國內(nèi)外PCV3全基因組序列，并使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對，確定高度保守區(qū)域。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，同時(shí)標(biāo)記生物素與地高辛，上游引物PCV3-BIOF序列：5′-BIO-TGCTAC-GAGTGTCCTGAAGA-3′，下游引物PCV3-DIGR序列：5′-DIG-CTGCTGCTTGAAGATCCGAT-3′。引物由上海生工合成，同時(shí)合成1對未標(biāo)記引物。

1.4 PCR退火溫度篩選以提取的PCV3基因組DNA為模板，使用引物PCV3-BIOF和PCV3-DIGR進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Premix Taq 25 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。反應(yīng)程序：95℃ 4 min；95℃ 30 s，50～60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。以條帶最亮的溫度作為最佳退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備使用未標(biāo)記引物按照1.4進(jìn)行PCR反應(yīng)，目的基因片段回收純化后連接至pMD19-T載體，再轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，使用菌液PCR和雙酶切(BamHⅠ和Hind Ⅲ)鑒定后測序分析，然后測定PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度并轉(zhuǎn)換成相應(yīng)拷貝數(shù)，以此作為PCR-ELSIA檢測的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 PCR-ELISA檢測將鏈霉親和素使用PBS緩沖液稀釋后，50 μL/孔加入酶標(biāo)板，于4℃包被過夜。棄去包被液后使用PBST 300 μL/孔重復(fù)洗板6次，拍干后每孔加入200 μL 5%脫脂奶于37℃封閉2 h。洗板6次拍干，加入帶有標(biāo)記物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，50 μL/孔37℃孵育1 h。洗板6次拍干，加入使用封閉液稀釋的羊抗DIG-HRP，50 μL/孔，于37℃反應(yīng)1 h。洗板6次拍干，每孔加入50 μL TMB單組份顯色液，避光顯色10 min，50 μL/孔加入H2SO4終止液，最后用酶標(biāo)儀讀取D450 nm值。

1.7 PCR-ELISA檢測方法的優(yōu)化對PCR-ELISA的各個主要反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。篩選鏈霉親和素包被質(zhì)量濃度(20.000 0，10.000 0，5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 mg/L)和包被條件(4℃過夜，37℃ 2 h，37℃ 1 h，37℃ 30 min和37℃ 15 min)，以5%脫脂奶作為封閉液篩選封閉條件(37℃ 2 h，37℃ 1 h，37℃ 45 min，37℃ 30 min和37℃ 15 min)，加入PCR產(chǎn)物的反應(yīng)時(shí)間(60，45，30，15，5 min)進(jìn)行優(yōu)化，再對羊抗DIG-HRP的稀釋度(1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000 和1∶16 000)及反應(yīng)時(shí)間(60，45，30，15，5 min)進(jìn)行篩選。根據(jù)以上篩選出的條件，優(yōu)化PCR-ELISA的顯色時(shí)間(15，10，7，5，3，1 min)及PCR反應(yīng)時(shí)的循環(huán)次數(shù)(35，30，25，20，15，10次)，確定PCR-ELISA的最佳反應(yīng)條件。

1.9 特異性試驗(yàn)使用優(yōu)化反應(yīng)條件后的PCR-ELISA檢測方法分別檢測PRRSV、CSFV、PPV、PCV2和PCV3樣品，確定PCR-ELISA方法的特異性。

1.10 敏感性試驗(yàn)將鑒定成功的PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10倍梯度稀釋，以此為模板進(jìn)行檢測，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)，以各梯度D450 nm均值確定PCR-ELISA檢測方法的敏感性。

1.11 重復(fù)性試驗(yàn)選取4份不同質(zhì)量濃度的PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以及1份PCV3陰性樣品，使用同批次的5塊酶標(biāo)板同時(shí)對其進(jìn)行檢測，再使用不同批次制備的酶標(biāo)板檢測該P(yáng)CV3陽性和陰性樣品，進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。通過計(jì)算不同批次酶標(biāo)板上各樣品的D450 nm值的變異系數(shù)(CV)，測定PCR-ELISA的穩(wěn)定性。

1.12 臨床樣品的檢測臨床收集132份豬的組織和血清樣品，使用建立的PCR-ELISA方法進(jìn)行PCV3檢測，同時(shí)使用常規(guī)PCR作對比，統(tǒng)計(jì)并分析臨床樣品的PCV3陽性率。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增及退火溫度篩選結(jié)果以提取的PCV3全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，出現(xiàn)392 bp左右的目的條帶，同預(yù)期相符。退火溫度篩選(50，51，53，55，57，60℃)結(jié)果見圖1，當(dāng)退火溫度為55℃時(shí)，有較好的PCR擴(kuò)增效果。

M.DL2000 DNA Marker；1.50℃；2.51℃；3.53℃；4.55℃；5.57℃；6.60℃；7.陰性對照

2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備結(jié)果使用未標(biāo)記引物按2.1確定的PCR反應(yīng)條件，以PCV3 DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得的目的產(chǎn)物經(jīng)回收純化、連接載體、轉(zhuǎn)化、克隆后得到重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切確定插入的片段大小在392 bp左右(圖2)。測序結(jié)果顯示同PCV3參考毒株的基因同源性為100%，表明成功構(gòu)建PCV3目的基因克隆質(zhì)粒。測得其質(zhì)量濃度為188.7 mg/L，換算成拷貝數(shù)為5.58×1010copies/μL。

M.DL2000 DNA Marker；1.重組質(zhì)粒PCR鑒定；2.陰性對照；3.重組質(zhì)粒雙酶切鑒定；4.陰性對照

2.3 PCR-ELISA檢測方法優(yōu)化結(jié)果對PCR-ELISA檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，PCR循環(huán)次數(shù)為30次，鏈霉親和素最佳包被質(zhì)量濃度為2.5 mg/L，包被條件為37℃ 30 min，5%脫脂奶于37℃封閉60 min，目的基因的固定條件為37℃ 60 min，羊抗DIG-HRP按1∶2 000稀釋后于37℃反應(yīng)30 min，TMB顯色10 min。

圖3 30份陰性樣品D450 nm的正態(tài)分布圖

2.5 PCR-ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果利用建立的PCR-ELISA檢測方法對PRRSV、CSFV、PPV、PCV2和PCV3樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，僅PCV3樣品為陽性(D450 nm=0.807)，與其他病原體無交叉反應(yīng)(圖4)；表明該方法具有良好的特異性。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 PCR-ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果將構(gòu)建的PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10倍梯度稀釋，以得到的5.58×109～5.58×101copies/μL質(zhì)粒為模板，使用建立的PCR-ELISA方法進(jìn)行檢測，同時(shí)以常規(guī)PCR做對比。結(jié)果顯示，常規(guī)PCR可檢測到5.58×104copies/μL的樣品，PCR-ELISA可檢測到5.58×102copies/μL(圖5,6)；表明該方法具有良好敏感性，其靈敏度是常規(guī)PCR的100倍。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.分別是PCV3質(zhì)粒稀釋濃度5.58×109～5.58×101 copies/μL；10.陰性對照

圖6 PCR-ELISA敏感性試驗(yàn)

2.8 臨床樣品檢測應(yīng)用建立的PCR-ELISA檢測方法檢測臨床收集的132 份豬的病料組織和血清樣品，同時(shí)使用常規(guī)PCR檢測以做比對。結(jié)果顯示，常規(guī)PCR測定臨床樣品中PCV3陽性率為4.55%(6/132)，PCR-ELISA檢測樣品陽性率為9.10%(12/132)，且常規(guī)PCR檢測陽性樣，在PCR-ELISA檢測時(shí)均為陽性(表2)；表明所建立的PCV3 PCR-ELISA方法可用于臨床樣品的檢測。

表1 PCR-ELISA重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表2 臨床樣品PCR-ELISA方法和常規(guī)PCR方法檢測結(jié)果 份

3 討論

自2016 年美國首次報(bào)道PCV3后，至今仍無有效的疫苗和藥物用于防控[10]。另外，PCV3宿主范圍不斷擴(kuò)大，已從犬[11]和驢[12]樣品中檢測到PCV3。加之無癥狀感染和混合感染，使PCV3的臨床診斷和預(yù)防控制難度增加，對各國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重不良影響[13]。建立一種靈敏、特異、高效的檢測方法用于PCV3的早防早控，對減少經(jīng)濟(jì)損失意義重大。

PCR-ELISA技術(shù)通過結(jié)合固定化技術(shù)、引物標(biāo)記、PCR擴(kuò)增和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，極大增強(qiáng)了目的基因的信號強(qiáng)度，同時(shí)使用酶標(biāo)儀讀取和量化結(jié)果，做到對目的基因的半定量檢測[14]。與常規(guī)PCR方法相比，PCR-ELISA在大幅度提升靈敏度基礎(chǔ)上省去了凝膠電泳步驟，避免了EB等核酸染料的污染[15]。且該方法使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室儀器即可完成樣品的批量檢測，適合在養(yǎng)殖場推廣使用。本研究分別在引物的5′端標(biāo)記生物素和地高辛，PCR擴(kuò)增后目的產(chǎn)物帶有的標(biāo)記物可直接與載體固定，省去了傳統(tǒng)PCR-ELISA技術(shù)的探針設(shè)計(jì)和變性雜交步驟，縮短了檢測時(shí)間，降低了檢測成本。在此基礎(chǔ)上，通過對鏈霉親和素的包被條件、酶標(biāo)板封閉條件、目的基因和載體的固定條件、酶標(biāo)抗體反應(yīng)條件、顯色時(shí)間、PCR循環(huán)次數(shù)等操作步驟進(jìn)行篩選優(yōu)化，建立了檢測PCV3的PCR-ELISA方法。

對所建立的PCR-ELISA方法進(jìn)行敏感性評價(jià)，結(jié)果顯示，檢測限為5.58×102copies/μL，而常規(guī)PCR的檢測限為5.58×104copies/μL，表明其具有良好的敏感性，是常規(guī)PCR的100倍，這與楊利峰等[16]和耿昕穎等[17]的研究結(jié)論一致。使用建立的PCR-ELISA方法，對132 份豬病料組織和血清樣品進(jìn)行PCV3 PCR-ELISA檢測，結(jié)果顯示，陽性率為9.10%，這同趙勝杰等[18]和JIA等[19]報(bào)道的PCV3在河南省的流行率5.17%～10.10%相近。在檢出的12份PCV3陽性樣品中，有7份樣品同時(shí)為PCV2陽性，說明PCV3常和PCV2發(fā)生混合感染[20]，但其感染機(jī)制仍有待研究。

綜上所述，本研究建立并優(yōu)化了一種用于PCV3的PCR-ELISA檢測方法，該方法具有較高的靈敏性和重復(fù)性，適用于PCV3的早期診斷、日常監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。