覃 海，陳 偉*，畢 歡，袁 巍，周 萍

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025； 2.貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

劍白香豬是我國(guó)的二級(jí)稀有保護(hù)動(dòng)物，原產(chǎn)于貴州省劍河縣，劍白香豬體型特點(diǎn)總體上比較矮小、體長(zhǎng)較短、腹部下凹，在毛色上頭部和尾部是黑色、中部為白色。劍白香豬皮薄肉嫩且風(fēng)味獨(dú)特，但其毛色沉積的機(jī)制如何，至今未見有報(bào)道。毛色是動(dòng)物重要的品種特征之一，可以為養(yǎng)豬生產(chǎn)及豬的育種提供很多便利，它能為確認(rèn)品種純度、雜交組合、親緣關(guān)系以及評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量提供參考[1]。隨著肉質(zhì)好、生產(chǎn)率高、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)良性狀豬的雜種優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用，生活中會(huì)出現(xiàn)“一豬多色”的情況。在雜交過程中，為使商品豬具有理想的毛色，在選擇后備種豬時(shí)，毛色也成為需要認(rèn)真考慮的性狀。因而，揭示豬毛色遺傳機(jī)制及其影響毛色相關(guān)基因的遺傳規(guī)律，對(duì)于劍白香豬的開發(fā)和育種具有重要意義[2]。

哺乳動(dòng)物的毛發(fā)顏色有所不同，是因?yàn)樗鼈凅w內(nèi)含有的色素含量及比例不同，主要代表是黑色素及其衍生物[3]。黑色素主要為兩種類型，一種為真黑色素呈棕黑色或深色；另一種為褐黑色素呈紅黃色。黑色素是由黑色素細(xì)胞合成，主要位于皮膚真皮層中的基底層。黑色素的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，從黑色素細(xì)胞的分化、增殖、遷移和成熟，以及合成黑色素的過程中，都伴隨著很多功能基因的參與，通過這些基因的互作進(jìn)而形成了黑色素合成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)[4]。黑色素生成后，由黑素小體通過黑色素細(xì)胞的突觸轉(zhuǎn)運(yùn)到周圍的角質(zhì)細(xì)胞及毛囊。最后，毛發(fā)的顏色會(huì)因真黑色素和褐黑色素的比例與含量不同而存在差異[5]。如長(zhǎng)白豬、杜洛克豬、劍白香豬、東北花豬和萊蕪黑豬等，毛色各異，差別很大。哺乳動(dòng)物的毛色是由多個(gè)基因決定的，這些基因影響著黑色素的生成或黑色素細(xì)胞的生成、增殖和遷移，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，已逐漸發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中的毛色主效基因，如MC1R、TYR家族(TYR、TYRP1、DCT)、KIT、MLANA、MITF和EDNRB等基因可以通過調(diào)節(jié)黑色素的沉積而決定動(dòng)物毛發(fā)的顏色。因此，不同的毛色可以理解為基因調(diào)控的結(jié)果。

本研究采用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)劍白香豬的黑色被毛皮膚和白色被毛皮膚的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分析，通過香豬不同毛色皮膚組織的轉(zhuǎn)錄組比較，篩選可能與劍白香豬被毛顏色形成相關(guān)的基因，以期為進(jìn)一步探究這些基因調(diào)控劍白香豬毛色性狀的遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集采集貴州劍白香豬的頭部和尾部黑色被毛皮膚和中部背上白色被毛皮膚，用DEPC水處理后放入無RNA酶的凍存管中，液氮中冷凍帶回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)入-80℃的超低溫冰箱儲(chǔ)存，備用。

1.2 RNA的提取與檢測(cè)利用TRIzol法提取劍白香豬皮膚組織樣本的總RNA，Nanodrop檢測(cè)RNA的純度，Qubit 2.0對(duì)RNA濃度定量，Aglient 2100檢測(cè)RNA的完整性，對(duì)檢測(cè)合格的樣品進(jìn)行測(cè)序。

1.3 RNA文庫的構(gòu)建利用Epicentre Ribo-ZeroTM試劑盒去除RNA樣品中的tRNA和rRNA等一些不編碼的RNA，加入片段緩沖液使rRNA-depleted RNA被隨機(jī)打斷，通過Oligo磁珠法將rRNA-depleted RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并純化。將純化的雙鏈cDNA末端做修復(fù)和加A處理，再連接測(cè)序接頭，最后降解U鏈，通過PCR富集得到cDNA文庫。

1.4 文庫測(cè)序和質(zhì)量控制由百邁克公司用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。過濾Raw Data數(shù)據(jù)后，得到Clean Data。將Clean Data與指定參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，從而得到Mapped Data。在對(duì)插入片段長(zhǎng)度檢驗(yàn)和隨機(jī)性檢驗(yàn)等測(cè)序文庫質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。原始數(shù)據(jù)(raw reads)通過質(zhì)量控制獲得優(yōu)化的數(shù)據(jù)(clean reads)。

1.5 劍白香豬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SNP位點(diǎn)的發(fā)掘使用GATK軟件識(shí)別測(cè)序樣品與參考基因組間的單堿基錯(cuò)配，識(shí)別出SNP位點(diǎn)。用SNPEff軟件對(duì)識(shí)別出的SNP進(jìn)行注釋。

1.6 差異表達(dá)使用edgeR[6]軟件分別對(duì)劍白香豬黑色被毛皮膚和白色被毛皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，并利用DESeq[7]軟件分析基因的差異表達(dá)情況。

1.7 差異表達(dá)基因的功能注釋和富集分析利用goseq1.22.0軟件(http://bioconductor．org /packages/goseq/) 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋[8]。

KEGG是有關(guān)通路的主要公共數(shù)據(jù)庫。利用 KOBAS[9]軟件找出與整個(gè)基因組背景相比錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05的通路，即為差異表達(dá)基因顯著富集通路。

1.8 熒光定量PCR試驗(yàn)PCR反應(yīng)體系(25.0 μL)：10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) (ABI,美國(guó)) 13.0 μL，補(bǔ)水至25.0 μL。反應(yīng)條件：95℃ 10 min預(yù)變性；95℃ 10 s變性，58℃ 30 s退火，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，在擎科生物技術(shù)有限公司合成，所用引物序列見表1。以5S做內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 免疫組化染色對(duì)前期制備的劍白香豬的石蠟切片進(jìn)行組織化學(xué)染色，一抗選用兔抗MITF單克隆抗體和鼠抗TYR單克隆抗體(北京安諾倫生物科技有限公司)，二抗選用酶標(biāo)山羊抗兔lgG聚合物和酶標(biāo)山羊抗小鼠lgG聚合物(北京安諾倫生物科技有限公司)。陰性對(duì)照用1×PBS替代進(jìn)行孵育；空白對(duì)照既不滴加單克隆抗體進(jìn)行孵育，也是用1×PBS替代進(jìn)行孵育。染色結(jié)束后再顯微鏡下觀察MITF和TYR的蛋白定位。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)由表2可知，Clean Data中Pair-end Reads總數(shù)為66 011 819，總堿基數(shù)目為19 630 484 846，每個(gè)樣品均獲得了16 645 506 106個(gè)以上的堿基，6個(gè)樣品平均GC含量為51.95%，N為0.00%，Q30均在94.37%以上。利用HISAT2作為比對(duì)工具，發(fā)現(xiàn)平均92.50%的Mapped Reads數(shù)據(jù)可比對(duì)到豬參考基因組上，其中平均 81.11% 的數(shù)據(jù)可比對(duì)至豬參考基因組唯一位置，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。

表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)表

2.2 SNP 分析對(duì)各樣品Reads與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，由表3可知L13、L14、L15樣品上共得到6 070 559個(gè)SNP位點(diǎn)，5 121 227個(gè)基因區(qū)SNP位點(diǎn)，949 332個(gè)基因間SNP位點(diǎn)；其中轉(zhuǎn)換型SNP總數(shù)占SNP位點(diǎn)總數(shù)的73.01%，顛換型SNP總數(shù)占SNP位點(diǎn)總數(shù)的26.98%。L12、L16、L17樣品上共得到5 144 981個(gè)SNP位點(diǎn)，4 284 209個(gè)基因區(qū)SNP位點(diǎn)，860 772個(gè)基因間SNP位點(diǎn)；其中轉(zhuǎn)換型SNP總數(shù)占SNP位點(diǎn)總數(shù)的72.40%，顛換型SNP總數(shù)占SNP位點(diǎn)總數(shù)的27.60%，由此可見，堿基的轉(zhuǎn)換型顯著高于顛換型。6種單核苷酸變異中，C/T和A/G發(fā)生的頻率最高(圖1)。從圖2和圖3可看出SNP主要分布于intron和intergenicr區(qū)， 而non synonymous coding在白色皮膚組織和黑色皮膚組織中分別有43 699和45 594個(gè)SNP。對(duì)各樣品的SNP用SNPEff軟件注釋之后分析發(fā)現(xiàn)，在劍白香豬白色被毛皮膚組織測(cè)序結(jié)果中，有2個(gè)與黑色素合成相關(guān)的差異基因存在錯(cuò)義突變的SNP，SLC45A2有2個(gè)錯(cuò)義突變的SNP位點(diǎn)：Exon1-g.229 G>A，由甘氨酸突變?yōu)榫彼?、Exon1-g.13499 A>G，由絲氨酸突變?yōu)楦拾彼?；TYRP1有1個(gè)錯(cuò)義突變的SNP位點(diǎn)：Exon7-g.17261 A>G，由組氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

表3 SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表

圖1 SNP突變類型分布圖

圖2 L13、L14、L15 SNP注釋分類圖

圖3 L12、L16、L17 SNP注釋分類圖

2.3 差異表達(dá)篩選及聚類分析通過計(jì)算各樣本所有基因的表達(dá)值FPKM，共發(fā)現(xiàn)10 463個(gè)基因表達(dá)(FPKM≥1)，其中10 294個(gè)基因 FPKM 位于1～100之間。從箱線圖(圖4)中可以看出單個(gè)樣品基因表達(dá)分布的離散程度，還可以比較不同樣品的整體基因表達(dá)水平。

圖4 各樣品FPKM箱線圖

利用edgeR軟件篩選差異表達(dá)基因，篩選的條件為差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)。將差異倍數(shù)大于等于2 且P<0.05 作為篩標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定出1 230個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中相較于白色被毛皮膚，在黑色被毛皮膚中顯著上調(diào)基因有738個(gè)，下調(diào)基因有492個(gè)。通過火山圖(圖5)可直觀地顯示2組樣本間基因差異表達(dá)的分布情況。通過注釋后發(fā)現(xiàn)顯著性差異表達(dá)基因中包含一些與黑色素合成過程相關(guān)的基因，例如MLANA、PMEL、DCT、TYRP1、TYR和SLC45A2參與黑色素合成調(diào)控。根據(jù)顯著性差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)同一顏色皮膚組織的生物學(xué)重復(fù)聚集在一起，同一皮膚組織出現(xiàn)分離(圖6)，表明本研究所用樣本組間生物學(xué)重復(fù)性較好。

圖中的虛線為篩選差異基因的閾值，每一個(gè)點(diǎn)都代表一個(gè)基因；綠色.下調(diào)差異表達(dá)基因;紅色.上調(diào)差異表達(dá)基因;黑色.非差異表達(dá)基因

不同顏色代表了基因在樣品中的表達(dá)量水平log10(FPKM+0.000 001)

2.4 差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析對(duì)所有差異表達(dá)基因GO富集，圖7可以看出有13個(gè)基因顯著富集于生物刺激反應(yīng)(response to biotic stimulus)、細(xì)胞外的細(xì)胞器(extracellular organelle)、小分子結(jié)合(small molecule binding)和精子部分(sperm part)。利用GO數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物過程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function) 3方面的注釋，分析表明共有1 070個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集于9個(gè)GO term(表4)，生物過程包含6個(gè)功能亞分類，分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、蛋白降解(proteolysis)、生物調(diào)節(jié)(regulation of biological quality)、細(xì)胞連接復(fù)合體(extracellular matrix organization)、蛋白自磷酸化(protein autophosphorylation)、單生物代謝過程(single-organism metabolic process)等過程；細(xì)胞組成功能過程及顯著的只含有2個(gè)功能亞分類即細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)和細(xì)胞核(nucleus)；分子功能過程只包含了1個(gè)功能亞分類即ATP結(jié)合(ATP binding)。

紅色和藍(lán)色分別表示高表達(dá)與低表達(dá)的term；小括號(hào)里面是該term包含的顯著性差異的基因數(shù)量

表4 差異表達(dá)基因topGO富集結(jié)果

以q值<0.05作為顯著性富集的閾值對(duì)顯著性差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示共有 70個(gè)差異表達(dá)基因富集到30條通路中，2條通路顯著富集(q值<0.05)：酪氨酸代謝 (tyrosine metabolism)和黑色素合成(melanogenesis)通路(表5)。結(jié)果顯示黑色素合成與酪氨酸代謝通路與劍白香豬毛色性狀的形成有著緊密的關(guān)系。

表5 差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG通路列表

2.5 熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序隨機(jī)選擇了TYR、TYRP1、DCT、MLANA、PMEL、SLC7A11、SLC24A5、SLC45A2、SLC7A5基因通過qRT-PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)結(jié)果表明有8個(gè)基因在黑色被毛皮膚與白色被毛皮膚組織間表達(dá)變化模式和與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的趨勢(shì)一致(圖8)，表明本研究中基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確可靠的。

A.全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序各基因的FPKM值;B.qRT-PCR檢測(cè)各基因的mRNA表達(dá)量

2.6 MITF蛋白在香豬皮膚組織中的表達(dá)分析通過免疫組織化學(xué)染色方法觀察香豬不同顏色被毛皮膚組織中MITF蛋白的表達(dá)定位情況，圖9結(jié)果顯示MITF蛋白在黑色被毛皮膚和白色被毛皮膚中均有陽性表達(dá)，且陰性對(duì)照組未見陽性反應(yīng)；觀察發(fā)現(xiàn)，主要在毛囊外根鞘部位以及表皮的顆粒層、棘細(xì)胞層和基層有陽性表達(dá)。白色被毛皮膚和黑色被毛皮膚相比，陽性反應(yīng)著色較淺，說明MITF蛋白在香豬黑色被毛皮膚中的表達(dá)量高于白色被毛皮膚。

A、B、a、b.黑色被毛皮膚組織，A、a為橫切，B、b為縱切，A、B為陽性結(jié)果，a、b為陰性對(duì)照；C、D、c、d.為白色被毛皮膚組織，C、c為橫切，D、d為縱切，C、D為陽性結(jié)果，c、d為陰性對(duì)照

2.7 TYR蛋白在香豬皮膚中的表達(dá)分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖10)，在劍白香豬黑色被毛皮膚組織毛囊的纖維層、外根鞘、真皮層、表皮的顆粒層、棘細(xì)胞層、基底層以及毛囊周圍都有TYR蛋白的陽性表達(dá)，白色被毛皮膚只在毛囊的外根鞘部位以及表皮的顆粒層、棘細(xì)胞層和基層有TYR蛋白的陽性表達(dá)，陰性對(duì)照組未見陽性反應(yīng)。白色被毛皮膚與黑色被毛皮膚相比，陽性反應(yīng)著色較淺，說明TYR蛋白在香豬黑色被毛皮膚中的表達(dá)量高于白色被毛皮膚。

A、B、a、b.為黑色被毛皮膚組織，A、a為橫切，B、b為縱切，A、B為陽性結(jié)果，a、b為陰性對(duì)照；C、D、c、d為黑色被毛皮膚組織，C、c為橫切，D、d為縱切，C、D為陽性結(jié)果，c、d為陰性對(duì)照

3 討論

哺乳動(dòng)物的膚色和毛色主要由2種黑色素：真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)決定[10]。MADELAINE等[11]提出只有在黑色素的作用下才能產(chǎn)生復(fù)雜的毛色。神經(jīng)嵴細(xì)胞通過遷移分化為成熟的黑色素細(xì)胞并產(chǎn)生黑色素，而黑色素則轉(zhuǎn)移到皮膚角質(zhì)細(xì)胞和毛發(fā)上，進(jìn)而產(chǎn)生不同的毛色和膚色，因此，皮膚和毛囊組織是研究毛色性狀的理想材料。本研究采用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，獲得劍白香豬黑色被毛皮膚和白色被毛皮膚轉(zhuǎn)錄組信息，通過差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有試驗(yàn)樣本測(cè)序質(zhì)量值Q30堿基百分比均高于94.37%，SNP分析發(fā)現(xiàn)SLC45A2和TYRP1基因在白色被毛皮膚中存在錯(cuò)義突變的SNP，SLC45A2有2個(gè)錯(cuò)義突變的SNP位點(diǎn)：Exon1-g.229 G>A，由甘氨酸突變?yōu)榫彼帷xon1-g.13499 A>G，由絲氨酸突變?yōu)楦拾彼幔籘YRP1有1個(gè)錯(cuò)義突變的SNP位點(diǎn)：Exon7-g.17261 A>G，由組氨酸突變?yōu)榫彼?。?jīng)qRT-PCR對(duì)TYR、TYRP1、DCT、SLC45A2、MLANA等部分差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)變化情況與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，說明測(cè)序質(zhì)量較好。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多與黑色素合成的主效基因無顯著性差異，如MITF、MC1R、KIT等基因，在測(cè)序結(jié)果中挑選1個(gè)顯著性差異基因TYR和1個(gè)非顯著性差異基因MITF，對(duì)劍白香豬皮膚組織中MITF和TYR基因進(jìn)行組織化學(xué)染色方法檢測(cè)其蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MITF和TYR蛋白在香豬黑色被毛皮膚中的表達(dá)量均高于白色被毛皮膚，在一定程度上說明了黑色素合成的主效基因在劍白香豬的黑色素合成中也同樣扮演著重要角色。對(duì)劍白香豬差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)黑色素合成通路與酪氨酸代謝通路在豬毛色形成過程中發(fā)揮了重要作用，除此之外還有很多差異表達(dá)基因與色素沉積相關(guān)。

在合成黑色素過程中，多個(gè)基因協(xié)同作用，共同調(diào)控黑色素的分布和沉積[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，很多和黑色素合成相關(guān)的顯著性差異表達(dá)基因，如：酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是黑素細(xì)胞中唯一表達(dá)的酶，能催化黑素生成并限制其生成速率[13]。TYR主要作用于黑色素合成開始的前兩個(gè)階段，作用于酪氨酸，合成多巴和多巴醌；由于是代謝的限速步驟，因此決定了黑色素合成的種類和數(shù)量[14]。酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrosinase-related protein1,TYRP1)是第1個(gè)成功克隆的色素基因[15]。酪氨酸酶在黑色素合成的初始反應(yīng)中起重要作用，酪氨酸酶相關(guān)蛋白1 (TYRP1)能調(diào)控遠(yuǎn)端步驟所產(chǎn)生黑色素[16-17]。SARANGARAJAN等[18]對(duì)TYRP1 的研究表明，TYRP1 是黑素細(xì)胞的特異性產(chǎn)物，參與真黑色素的合成。鄭會(huì)芹[19]在山羊TYRP1基因中發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)：g.1263 A>C，與其深色表型有關(guān)。GRATTEN等[20]研究索艾綿羊TYRP1基因發(fā)現(xiàn)，exon 4上的1個(gè)錯(cuò)義突變c.869 T>C與其淺色表型極顯著相關(guān)，而且不同毛色個(gè)體中TYRP1基因表達(dá)量不同。多巴色素異構(gòu)酶(dopachrometautomerase,DCT)具有TYR和TYRP1相似的蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)，是酪氨酸酶相關(guān)蛋白家族的成員，被稱為酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TYRP2)，是黑色素合成過程中的限速酶[21]，能催化多巴色素轉(zhuǎn)化為 5，6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)，從而促進(jìn)黑色素生成[3]。TYR、TYRP1、DCT同屬酪氨酸酶蛋白家族，是黑色素合成過程的3種催化酶，TYRP1蛋白與TYRP2蛋白在調(diào)節(jié)TYR活性功能上具有拮抗作用，以此調(diào)控黑色素合成[22]。陽離子交換體(solute carrier family 24 member 5，SLC24A5)屬于溶質(zhì)載體家族，最初發(fā)現(xiàn)與斑馬魚的表型調(diào)控有關(guān)[23]。余陸偉等[24]證實(shí)，斑馬魚的金色表型是由于SLC24A5突變，導(dǎo)致黑色素細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞黑色素小體體積變小和密度下降，黑色素沉積延遲和減少；水溶載體45家族成員2(solute carrier family 45，SLC45A2) 是由530個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，包含12個(gè)跨膜區(qū)，分布于黑素體膜[25]。SLC45A2又被稱為膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(membrane- associated transporter protein，MATP)，可以調(diào)節(jié)黑色素合成[26-27]。SLC45A2蛋白參與酪氨酸酶TYR、TYRP1、TYRP2在細(xì)胞內(nèi)精確地加工和運(yùn)輸[28]。SLC45A2基因突變可導(dǎo)致青鏘魚[29]、鼠[30]和雞[31]等多種動(dòng)物的色素沉著發(fā)生變化，從而影響動(dòng)物的膚色、毛色等。王海東等[32]通過qRT-PCR檢測(cè)SLC45A2轉(zhuǎn)錄水平、Western blot驗(yàn)證及免疫組織化學(xué)，證實(shí)了SLC45A2通過調(diào)控色素的生成，進(jìn)而影響毛色的形成。SLC7A11基因?qū)儆谌苜|(zhì)載體家族，編碼胱氨酸或谷氨酸[33-34]。半胱氨酸是合成抗氧化劑GSH的原料[35]，SLC7A11基因?qū)⒓?xì)胞外的半胱氨酸運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑GSH得到提高[36]。而褐黑素的合成需要GSH的參與，如果SLC7A5基因表達(dá)量增加，那細(xì)胞中的GSH會(huì)大量合成，從而使毛色或膚色變黑[37]。CéLINE等[38]，發(fā)現(xiàn)siRNA介導(dǎo)的SLC7A5基因敲除可降低B16F10細(xì)胞的色素沉著。黑色素主要在黑素細(xì)胞的黑素小體(MLANA)中合成，MLANA通過維持GPR143的穩(wěn)定性來參與黑色素小體的生成，對(duì)黑色素細(xì)胞蛋白PMEL的表達(dá)、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和加工至關(guān)重要[39]。前黑素小體蛋白 (premelanosome protein，PMEL)由Sliver基因編碼[40]，只在皮膚黑色素細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和眼色素層黑素細(xì)胞中表達(dá)[41]。PMEL對(duì)黑素小體的發(fā)育具有重要作用，黑素小體可以合成黑色素，還參與黑色素的轉(zhuǎn)運(yùn)[42]。SCHMUTZ等[43]發(fā)現(xiàn)，PMEL的1個(gè)堿基缺失和PMEL與MCIR之間的相互作用會(huì)影響高原牛的毛色。已經(jīng)報(bào)道了小鼠[44]、馬[45]、牛[46]、貓[47]、雞[48]等家畜的PMEL突變可以形成顏色表型。

本研究中篩選到的調(diào)控劍白香豬黑色素合成過程相關(guān)的差異表達(dá)基因如TYR、TYRP1、DCT、MLANA、PMEL、SLC7A11、SLC24A5、SLC45A2和SLC7A5等，同時(shí)SNP分析發(fā)現(xiàn)SLC45A2和TYRP1基因在白色被毛皮膚中存在錯(cuò)義突變的SNP，這些差異基因及SLC45A2和TYRP1基因的突變可能導(dǎo)致了劍白香豬毛色的形成，為后續(xù)研究豬毛色性狀的遺傳機(jī)制提供了線索。對(duì)劍白香豬差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)黑色素合成通路與酪氨酸代謝通路顯著富集，篩選到參與黑色素合成通路上的基因TYR、TYRP1、DCT、WNT16、WNT3、CREB3L2、ADCY2、TCF7L2等12個(gè)差異表達(dá)基因，酪氨酸代謝通路參與基因有TYRP1、TYR、DCT、AOX1，可見這2條通路在豬毛色形成過程中發(fā)揮了重要作用，進(jìn)一步表明 TYRP1、TYR、DCT 等基因在黑色素合成過程中的重要性。