孫曉煜，何玉英，楊亞文，何玉琴*，包瑩瑩，劉莉莉，陶樂(lè)凱，蔡永強(qiáng)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)人民銀行蘭州中心支行內(nèi)審處，甘肅 蘭州 730070;3.新疆伊犁師范大學(xué) 生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 伊犁 835000)

Kiss-1基因編碼產(chǎn)物稱(chēng)為Kisspeptins，它們的同源受體為GPR54，兩者組成Kiss-1/GPR54系統(tǒng)[1]。有研究表明，該系統(tǒng)主要通過(guò)下丘腦表達(dá)的 Kisspeptin與其受體GPR54結(jié)合后刺激下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放，進(jìn)而促進(jìn)垂體釋放促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)，作用于卵巢，構(gòu)成下丘腦-垂體-性腺軸參與季節(jié)性繁殖動(dòng)物的周期性調(diào)控[2]。卵巢、輸卵管和子宮在發(fā)情周期中會(huì)發(fā)生一系列生理變化，這為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟、精子儲(chǔ)存和獲能以及受精卵的附著和胚胎的發(fā)育提供了有利的條件，因此三者是雌性動(dòng)物重要的生殖器官。近年來(lái)有許多研究表明，Kiss-1/GPR54在人[3]、豬[4]、鼠[5]的卵巢、輸卵管和子宮中均有表達(dá)，證明Kiss-1/GPR54與雌性動(dòng)物卵巢、輸卵管和子宮的繁殖效應(yīng)有一定的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)給休情期母綿羊注射 Kisspeptins，可以促進(jìn)其排卵[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，若敲除小鼠的GPR54基因，會(huì)導(dǎo)致外生殖器官均出現(xiàn)異常[7]。上述研究表明Kiss-1/GPR54對(duì)哺乳動(dòng)物繁殖活動(dòng)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

甘加藏羊生活在海拔約為3 600 m的高原地區(qū)，其肉質(zhì)鮮美，富含諸多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且毛皮可以用來(lái)制作地毯等生活物品，是當(dāng)?shù)刂匾男竽临Y源。但由于其是典型的季節(jié)性發(fā)情哺乳動(dòng)物，繁殖率較低，每年只產(chǎn)1胎，不利于當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)Kiss-1/GPR54 系統(tǒng)表達(dá)和功能的研究大多集中在動(dòng)物HPO軸，而針對(duì)Kiss-1/GPR54基因及其蛋白的表達(dá)和分布是否與藏羊發(fā)情周期生殖器官功能活動(dòng)有關(guān)的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究首次應(yīng)用RT-qPCR、Western blot和IHC方法從基因、蛋白和細(xì)胞形態(tài)水平對(duì)甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期卵巢、輸卵管和子宮中Kiss-1/GPR54的表達(dá)及分布進(jìn)行研究，為研究Kiss-1/GPR54系統(tǒng)對(duì)藏羊的季節(jié)性發(fā)情的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品采集于甘南藏族自治州甘加鄉(xiāng)藏羊養(yǎng)殖場(chǎng)選取30只健康未孕的雌性甘加型藏綿羊。在藏羊非發(fā)情季節(jié)(3-6月份)為乏情期，設(shè)為試驗(yàn)對(duì)照組；在藏羊發(fā)情季節(jié)(7-9月份)為發(fā)情周期，參照四期分法，根據(jù)公羊爬跨試情以及陰道脫落細(xì)胞圖片觀(guān)察，將藏羊發(fā)情周期分為發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期、發(fā)情前期。在相應(yīng)各時(shí)期頸動(dòng)脈放血法處死試驗(yàn)羊，迅速取出卵巢、輸卵管和子宮等組織。將所取組織平均分為2份，1份置于液氮速凍后移至-80℃ 冰箱以備后續(xù)定量RT-qPCR和Western blot試驗(yàn)，另1份置于體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛中固定，以備后續(xù)免疫組織化學(xué)技術(shù)試驗(yàn)。

1.2 甘加藏羊生殖器官中Kiss-1、GPR54 mRNA表達(dá)檢測(cè)

1.2.1總RNA的提取與實(shí)時(shí)熒光PCR 從冷凍的卵巢、輸卵管和子宮組織中，按照TranZol試劑總RNA提取試劑盒(北京，TransGen)說(shuō)明書(shū)，分別提取總RNA。超微量核酸蛋白測(cè)定儀來(lái)測(cè)定RNA的純度和濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定RNA的完整性，最后用cDNA反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，保存于-20℃冰箱，備用。

根據(jù)NCBI查找綿羊的Kiss-1、GPR54和β-actin基因序列，運(yùn)用 Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物 (表 1)，由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 RT-qPCR引物信息

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，反應(yīng)總體系為20.0 μL，其中模板為1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×TransStart TiP Green qPCR SuperMix 10.0 μL，ddH2O 8.0 μL，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)50次。

1.2.2數(shù)據(jù)處理和分析 以相應(yīng)的β-actin內(nèi)參基因?qū)φ?，利?-ΔΔCt方法計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)。SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，t檢驗(yàn)比較其差異顯著性。

1.3 甘加藏羊生殖器官中Kiss-1、GPR54蛋白表達(dá)的檢測(cè)取1 g冷凍組織，加入1 mL蛋白裂解液，進(jìn)行研磨，離心取上層清液，分別經(jīng)過(guò)12% SDS-PAGE和15% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂羊奶室溫封閉2 h；分別加入Kisspeptin抗體、GPR54抗體以及β-actin多克隆抗體(1∶4 500稀釋)，4℃封閉過(guò)夜；用PBST洗滌3次，每次20 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶4 500稀釋)，37℃溫育2 h；用PBST洗膜3次，每次20 min，配制發(fā)光液，使用全自動(dòng)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。

1.4 甘加藏羊卵巢、輸卵管和子宮中 Kisspeptin、GPR54 的免疫組織化學(xué)染色分別將卵巢、輸卵管和子宮組織進(jìn)行包埋，制備成5 μm的石蠟切片脫蠟處理后，應(yīng)用過(guò)氧化物標(biāo)記的鏈霉卵白素(streptavidin/peroxidase，SP)法進(jìn)行染色。依次用0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)，H2O2阻斷、血清封閉、Kisspeptin和GPR54(博奧森,北京)一抗1∶350稀釋?zhuān)幮詫?duì)照用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗，4℃孵育過(guò)夜，然后依次滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG 溶液和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，分別在37℃下孵育15 min。最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，通過(guò)復(fù)染和脫水透明后用中性樹(shù)脂封片。利用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察并拍照，Kisspeptin和GPR54陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕色。

2 結(jié)果

2.1 甘加藏羊發(fā)情周期生殖器官中Kiss-1和GPR54 mRNA的表達(dá)分析甘加藏羊發(fā)情周期卵巢、輸卵管、子宮中均有Kiss-1和GPR54 mRNA的表達(dá)。卵巢和輸卵管中Kiss-1和GPR54的表達(dá)量在發(fā)情期達(dá)到峰值，顯著高于其他3個(gè)時(shí)期和乏情期(P<0.05)；子宮中Kiss-1在間情期表達(dá)量顯著高于其他發(fā)情時(shí)期(P<0.05)；GPR54在發(fā)情期的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)情時(shí)期(P<0.05)。乏情期Kiss-1、GPR54 mRNA的表達(dá)顯著低于發(fā)情周期各時(shí)期(P<0.05)(圖1)。

A.Kiss-1;B.GPR54。相同形狀不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)；相同小字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 甘加藏羊發(fā)情周期生殖器官中Kisspeptin和GPR54蛋白表達(dá)水平分析甘加藏羊發(fā)情周期卵巢、輸卵管和子宮中均有Kisspeptin和GPR54蛋白的表達(dá)。卵巢中Kisspeptin表達(dá)量從發(fā)情前期至發(fā)情期呈上升趨勢(shì)，發(fā)情期達(dá)到最高，發(fā)情期后逐漸降低，乏情期最低，各個(gè)時(shí)期差異顯著(P<0.05)；GPR54在發(fā)情期的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P<0.05)；輸卵管中Kisspeptin和GPR54的蛋白表達(dá)量，在發(fā)情前期達(dá)到最高，不同時(shí)期差異顯著(P<0.05)；子宮中Kisspeptin表達(dá)量在間情期最高，顯著高于發(fā)情前期、發(fā)情后期、間情期以及乏情期(P<0.05)；在發(fā)情期與發(fā)情后期GPR54的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，其他時(shí)期差異不顯著(P>0.05)。乏情期Kisspeptin、GPR54的蛋白表達(dá)顯著低于發(fā)情周期各時(shí)期(P<0.05)(圖2,3)。

圖2 甘加藏羊發(fā)情周期各時(shí)期卵巢、輸卵管和子宮中Kisspeptin和GPR54 Western blot條帶圖

A.Kisspeptin;B.GPR54

2.3 甘加藏羊發(fā)情周期生殖器官中Kisspeptin和GPR54蛋白免疫組化染色分析免疫組化結(jié)果顯示，Kisspeptin和GPR54免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物為黃色或棕色，所有對(duì)照組試驗(yàn)的標(biāo)本均呈陰性，證明所用(一抗)抗體具有Kisspeptin和GPR54免疫反應(yīng)的特異性。甘加藏羊發(fā)情周期各時(shí)期卵巢、輸卵管和子宮組織中均有 Kisspeptin(圖4)和GPR54(圖5)蛋白表達(dá)，且陽(yáng)性著色強(qiáng)弱差異明顯。在卵巢組織中，Kisspeptin和GPR54主要分布在卵泡顆粒層和卵泡內(nèi)膜(圖4 A、B，圖5 A、B)以及黃體細(xì)胞中(圖4 C，圖5 C)，其中在顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中免疫陽(yáng)性產(chǎn)物著色深；在輸卵管分泌細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和黏膜上皮中均有表達(dá)(圖4 E～G，圖5 E～G)，纖毛細(xì)胞中免疫陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)強(qiáng)，著色深。在子宮上皮細(xì)胞和基細(xì)胞中呈高表達(dá)(圖4 I～K，圖5 I～K)。

3 討論

卵巢能夠分泌多種生殖激素調(diào)節(jié)雌性哺乳動(dòng)物的周期性排卵，為動(dòng)物受孕繁衍后代，是雌性動(dòng)物重要的生殖器官[8]。已經(jīng)有研究證明，Kisspeptin和GPR54在卵巢中表達(dá)分布與其功能活動(dòng)有著重要聯(lián)系[9]。MERHI等[10]發(fā)現(xiàn)敲除Kiss-1和GPR54基因的小鼠，卵巢的質(zhì)量和體積比正常小鼠小，并且卵泡數(shù)目減少。當(dāng)GAYTN等[11]向大鼠卵巢中注射Kisspeptin時(shí)，卵泡和黃體數(shù)目增加，表明Kisspeptin對(duì)卵巢的生長(zhǎng)以及卵泡和黃體的生成有一定的促進(jìn)作用。DHILLO等[12]給人注射Kiss-peptin發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)LH的分泌。LH是HPOA軸調(diào)控動(dòng)物季節(jié)性動(dòng)情節(jié)律的關(guān)鍵激素。有研究證明LH增加可以通過(guò)顆粒細(xì)胞上的LH受體直接刺激Kisspeptin的合成[13]，因此可以推測(cè)，Kisspeptin可能參與調(diào)控卵巢中卵泡成熟等重要生殖活動(dòng)。并且研究發(fā)現(xiàn)Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)能調(diào)節(jié)卵巢分泌雌激素，雌激素能通過(guò)反饋?zhàn)饔?，調(diào)節(jié)血液中的Kisspeptin的含量。當(dāng)切除卵巢時(shí)，不能阻止Kisspeptin促進(jìn)LH的分泌，但是增加雌激素的含量后，Kisspeptin的含量顯著升高[14]。這表明了卵巢中的雌激素對(duì)于Kiss-1/GPR54系統(tǒng)正反饋調(diào)節(jié)，對(duì)排卵有著非常重要的影響。并且TERAO等[15]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Kisspeptin在卵巢中具備局部功能作用。本研究也證明了，Kiss-1/GPR54 mRNA及其蛋白的表達(dá)量在發(fā)情期最高，提示卵巢中的Kisspeptin和GPR54通過(guò)雌激素的反饋?zhàn)饔?，參與調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞的發(fā)育、卵泡的成熟以及排卵等重要活動(dòng)。

A～D.卵巢；D、H、I.陰性；E～H.輸卵管；I～L.子宮。SG.顆粒細(xì)胞；TF.卵泡膜；LC.黃體細(xì)胞；UG.輸卵管腺；LP.固有膜；E.分泌細(xì)胞；EM.黏膜上皮；C.纖毛細(xì)胞；G.子宮腺；S.基細(xì)胞；LE.上皮細(xì)胞。下同

圖5 甘加藏羊發(fā)情周期各時(shí)期卵巢、輸卵管和子宮組織中GPR54的分布和表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin和GPR54主要分布于卵巢組織中的顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞，證明在這2種細(xì)胞中，Kisspeptin和GPR54可能發(fā)揮著重要作用。Kisspeptin與顆粒細(xì)胞中的GPR54結(jié)合后發(fā)揮作用，致使顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)控細(xì)胞上的受體，參與卵泡的生長(zhǎng)，隨著卵泡的不斷發(fā)育，顆粒細(xì)胞會(huì)釋放雌激素，促進(jìn)卵泡進(jìn)一步生長(zhǎng)以及排卵[16]。同時(shí)孕酮的含量也會(huì)增加，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的黃體化[17]，進(jìn)而調(diào)控生物體的發(fā)情周期，提示Kisspeptin和GPR54參與卵泡的發(fā)育和黃體的成熟。

輸卵管對(duì)卵子的儲(chǔ)存、成熟、受精以及早期胚胎發(fā)育的功能是生殖活成功的一部分[18]。鄭杰等[19]在山羊的輸卵管中檢測(cè)到Kiss-1/GPR54 mRNA的表達(dá)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在輸卵管組織中的纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞中均有Kisspeptin和GPR54的陽(yáng)性表達(dá)。并且Kiss-1/GPR54 mRNA在發(fā)情期達(dá)到最高，間情期最低，而Kisspeptin和GPR54的蛋白表達(dá)量在發(fā)情前期最高。基因和蛋白表達(dá)出現(xiàn)差異的原因，可能是基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到許多因素影響，例如環(huán)境或者基因內(nèi)源機(jī)制。以上提示Kisspeptin和GPR54在輸卵管組織中主要在發(fā)情前期和發(fā)情期的纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞中參與調(diào)控藏羊的生殖活動(dòng)。有研究證明，纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞的數(shù)量是由類(lèi)固醇激素來(lái)調(diào)節(jié)[20]，并且卵巢中的雌激素和孕酮是調(diào)節(jié)輸卵管功能的關(guān)鍵因子。有研究表明，Kiss-1/GPR54可以調(diào)節(jié)雌激素的含量，并且雌激素的負(fù)反饋?zhàn)饔靡彩墙柚鶮iss-1/GPR54系統(tǒng)信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[21]。

子宮具備構(gòu)成胎盤(pán)、參與胎兒生長(zhǎng)發(fā)育、影響生殖機(jī)能等重要的生理作用[22]，并且這些生理功能主要取決于由卵巢激素調(diào)節(jié)的子宮內(nèi)膜的周期性變化[23]。本試驗(yàn)免疫組化結(jié)果表明Kiss-1/GPR54主要分布在子宮上皮細(xì)胞和基細(xì)胞中，提示Kiss-1/GPR54主要在這2種細(xì)胞中發(fā)揮作用。LEON等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除小鼠的Kiss-1/GPR54基因，雌性成年鼠的子宮減小，同時(shí)子宮腺的數(shù)目會(huì)減少，當(dāng)恢復(fù)雌激素水平時(shí)，小鼠的子宮發(fā)育大體恢復(fù)正常，但是子宮腺仍表示為缺失，這個(gè)結(jié)果提示，子宮內(nèi)膜和腺體的發(fā)育可能依賴(lài)于Kiss-1/GPR54系統(tǒng)的調(diào)控。HERBISEN等[25]發(fā)現(xiàn)大部分的Kiss-1細(xì)胞表達(dá)ERα，而ERα的反饋?zhàn)饔弥饕蒏isspeptin和GPR54系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。ROBINSON等[26]發(fā)現(xiàn)奶牛子宮內(nèi)膜中的ERα mRNA在間情期表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期。本研究發(fā)現(xiàn)Kiss-1 mRNA及其蛋白表達(dá)量在間情期達(dá)到最大值，由此推測(cè)Kisspeptin可能誘導(dǎo)ERα的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)雌激素的分泌，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的周期性變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)生殖活動(dòng)。

本研究結(jié)果表明，Kiss-1/GPR54 mRNA及其蛋白在整個(gè)發(fā)情周期中卵巢、輸卵管以及子宮中均有表達(dá)和分布，且相對(duì)表達(dá)量呈動(dòng)態(tài)變化，并且存在一定的差異，證明Kiss-1/GPR54系統(tǒng)參與生殖系統(tǒng)發(fā)情周期調(diào)控，研究結(jié)果為進(jìn)一步探究Kiss-1/GPR54系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)繁殖活動(dòng)的調(diào)節(jié)提供了一定的科學(xué)參考依據(jù)。