王利振，盛文龍，李 寧，王榮春，劉可春

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生物研究所，濟南 250103)

0 引言

日常生活中經(jīng)常會發(fā)生各種各樣的意外，導致皮膚組織損傷、血管破裂、血液流出。這種情況下，需要及時對傷口進行止血，以保障受損的皮膚能夠快速進行自我修復，否則極易引發(fā)傷口感染，誘發(fā)過度的炎癥反應，嚴重者可導致截肢。因此，人們迫切需要開發(fā)高效、無毒的止血材料，能夠快速封鎖傷口并止血，同時有效防止細菌感染，促進傷口愈合。

殼聚糖(CS)是自然界中唯一一種正電性多糖，具有良好的止血效果。在血液中，CS結(jié)構(gòu)中的—NH2可以通過靜電作用與血小板結(jié)合，促進血小板粘附，加快血紅細胞凝結(jié)，促進血凝塊的形成[1-3]，而且，殼聚糖中正電性的—NH2可以與細胞表面負電性的生物大分子作用，堆積于細胞表面，從而改變細胞膜的通透性，影響細胞代謝，進一步起到抑制細菌增值的作用[4-6]。因此，殼聚糖被廣泛應用于制備各種止血和創(chuàng)面修復材料中。目前，已經(jīng)上市的CS類止血或創(chuàng)面修復材料有TraumaStat，Celox和HemCon，其中Celox的止血產(chǎn)品應用最廣[7]。單一的CS成分應用于止血或創(chuàng)面修復材料中存在一定的局限性，例如，CS為線型大分子結(jié)構(gòu)，普遍存在水溶性差的缺點[8]，此外，CS還存在吸水效率差、止血性能不佳、抗菌性能一般等缺點，極大地限制了其應用[9]。為了改善殼聚糖的止血及創(chuàng)面修復性能，提高其應用性，人們采取各種策略對殼聚糖的結(jié)構(gòu)進行了改造。例如，通過取代反應在殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入季銨鹽結(jié)構(gòu)，以達到增加正電性官能團的數(shù)量、提高抗菌性能、改善水溶性的目的[10-11]。在殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入巰基，所得的巰基殼聚糖與血紅細胞具有較好的反應性，能夠有效促進血凝塊的形成[12]。在殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入疏水性的烷基和多酚類化合物也可以提高殼聚糖的性能，疏水烷基可以使殼聚糖具有更好的細胞膜嵌入性，有利于血紅細胞的凝結(jié)和抗菌性能的提高[13-14]。多酚類化合物可以增強殼聚糖與潮濕組織的粘附性，從而起到封閉傷口的效果，促進血紅細胞凝結(jié)，加快止血速度[15-17]。結(jié)構(gòu)改造的方法雖然可以提高殼聚糖的性能，但是卻極易引入毒性小分子化合物，且改造后的殼聚糖降解速率下降，存在潛在的生物安全性。

通過物理共混的方式，添加其他具有止血、抗菌、促創(chuàng)面修復性能的高分子材料，可以實現(xiàn)多種材料優(yōu)異性能的高度整合，獲得結(jié)構(gòu)層次豐富、性能優(yōu)異的復合型材料[18]。而且物理共混不會改變材料的結(jié)構(gòu)，不引入毒性小分子化合物，生物安全性高，有利于實際應用。γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過酰胺鍵連接而成的高分子聚合物，能溶于水，可降解為無毒的短肽和氨基酸[19]。γ-聚谷氨酸具有很好的粘附性、保濕性和成膜性，其結(jié)構(gòu)中的羧基可以與血液中的Fe3+結(jié)合，激活凝血因子，具有一定的止血功能[20-22]。通過γ-聚谷氨酸與Ga2+進行交聯(lián)反應，制備聚谷氨酸鈣(PGAG)，再與CS混合凝膠化制備復合型聚谷氨酸鈣—殼聚糖止血材料(PGAG-CS)，一方面可以實現(xiàn)兩種材料不同止血機制的協(xié)同作用，提高止血性能；另一方面還可以改善單一CS水溶性差、吸水效率差的缺點，促進創(chuàng)面修復。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

真空冷凍干燥機(FD18S，山東博科)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800，日本日立)，傅里葉紅外光譜儀(Bruker AV-400)，電子天平(JA2003A，上海精天電子儀器北京有限公司)，紫外可見分光光度計(UV-2600i，日本島津)，全波長酶標儀(SPA-0093，Dynex公司)，生化培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Series 8000 WJ)，臺式離心機(KL04A，湖南凱達科學儀器有限公司)。

1.2 實驗材料

殼聚糖(脫乙酰度95%，粘度100～200 mpa·s)，γ-聚谷氨酸(分子量70萬)，氯化鈣，乙酸，氯化鈉，Celox止血粉，兔抗凝全血，DMEM培養(yǎng)基，青霉素—鏈霉素(雙抗)，胎牛血清，二乙基二硫代氨基甲酸鋅，高密度聚乙烯，噻唑藍(MTT)，麻醉劑戊巴比妥鈉。

1.3 實驗動物

SD大鼠，平均體重300 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(魯)20190003，山東省科學院生物研究所使用許可證編號：SYXK(魯)20200015。

2 實驗方法

2.1 樣品的制備

取γ-聚谷氨酸10 g和無水氯化鈣8.4 g，加入到200 mL蒸餾水中，混合液升溫至40 ℃，攪拌過夜，反應液降至室溫，倒入1 000 mL無水乙醇中，析出大量白色固體，過濾，濾餅用無水乙醇洗滌，真空干燥，得PGAG。

取CS固體10 g，緩慢加入到500 mL質(zhì)量分數(shù)為0.5%的乙酸水溶液中，得粘稠狀凝膠溶液，加入不同質(zhì)量的PGAG，繼續(xù)攪拌2 h，冷凍干燥，得PGAG-CS復合材料。

2.2 紅外光譜和掃描電鏡分析

樣品的紅外光譜譜圖測試采用溴化鉀壓片法，在JEOL型掃描電子顯微鏡上進行微觀結(jié)構(gòu)測試。

2.3 吸水率測試

精確稱量樣品0.2 g，用100 mL生理鹽水浸泡15 min，取出后瀝去多余水分，精確稱量其質(zhì)量，計算樣品的吸水率，每個樣品平行測定3次，取平均值。

2.4 凝血指數(shù)測試

將凍干的樣品材料切成0.5×0.5×0.5 cm3的正方體小塊，放入培養(yǎng)皿中，37 ℃恒溫孵育5 min。吸取100 μL含有枸櫞酸鈉抗凝劑的兔抗凝全血滴加到樣品中，再向樣品中快速滴加0.02 mL濃度為0.2 mol/L的氯化鈣溶液，靜置5 min，加入25 mL去離子水，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器上，在37 ℃、50 r/min的條件下，搖勻5 min；離心，取上清液，在紫外可見分光光度計上，于545 nm處測定上清液的光密度(OD)值?？瞻讓φ战M操作如下：取100 μL的兔抗凝全血，加入到25 mL去離子水中，搖勻后在545 nm波長下測定OD值。每個樣品平行測定3次，取平均值。凝血指數(shù)(BCI)的計算公式如下[23]：

2.5 溶血率測試

紅細胞懸浮液的制備：取含有枸櫞酸鈉抗凝劑的兔抗凝全血1 mL，加入到10 mL生理鹽水中，搖勻，2 000 r/min離心5 min，吸出上清液，取沉淀的紅細胞，重復上述步驟2次后將所得紅細胞(記為質(zhì)量分數(shù)100%)加入到24倍體積的生理鹽水中，得質(zhì)量分數(shù)為4%的紅細胞懸浮液。

實驗組將PGAG-CS用生理鹽水配制成不同質(zhì)量分數(shù)的懸浮液(2、4、6、8和10 mg/mL)。取每個質(zhì)量分數(shù)的樣品500 μL，加入到離心管中，加入質(zhì)量分數(shù)為4%的紅細胞懸浮液500 μL，37 ℃恒溫孵育3 h，2 000 r/min離心15 min，取上清液100 μL加入到96孔板中，在545 nm處，使用全波長酶標儀測定OD值。同時設置陽性對照組和陰性對照組，測定其OD值。陽性對照組是將10 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1% 的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)溶液，與200 μL質(zhì)量分數(shù)為100%的紅細胞懸浮液混合均勻；陰性對照組是將500 μL的生理鹽水與500 μL質(zhì)量分數(shù)為4%的紅細胞懸浮液混合均勻。每個樣品平行測定3次，取平均值。溶血率的計算公式如下[24]：

2.6 細胞毒性測試

選取CS與PGAG質(zhì)量比為10∶1的樣品，測試其細胞毒性。

實驗組：無菌條件下，將0.5 g樣品加入到15 mL的DMEM培養(yǎng)基中(含1%的雙抗和10%的血清)混勻，37 ℃孵育24 h，5000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，濾液作為質(zhì)量分數(shù)為100%的浸提液。取上述浸提液，加入到不同質(zhì)量分數(shù)的DMEM培養(yǎng)基中，配制成質(zhì)量分數(shù)為75%、50%、25%的浸提液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

陽性對照組：取二乙基二硫代氨基甲酸鋅0.5 g，按照上述步驟制備質(zhì)量分數(shù)為100%的浸提液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；陰性對照組：取高密度聚乙烯0.5 g，按照上述步驟制備質(zhì)量分數(shù)為100%的浸提液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹25]。

L-929細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，含5%的CO2。將對數(shù)生長期的細胞接種至96孔板中，每孔加入培養(yǎng)基100 μL，細胞密度約為105個細胞/孔，細胞培養(yǎng)24 h后，吸出原培養(yǎng)基，分別加入100 μL實驗組所得的浸提液(質(zhì)量分數(shù)100%、75%、50%、25%)、陽性對照組浸提液和陰性對照組浸提液?？瞻讓φ战M中加入100 μL新鮮DMEM培養(yǎng)基(每個樣品濃度設置6個平行復孔)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT(噻唑藍)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出原培養(yǎng)基，加入100 μL二甲基亞砜，避光振蕩15 min，置于酶標儀上，于570 nm處測定每孔的OD值，計算細胞存活率。

2.7 大鼠股動脈止血實驗

將禁食12 h的SD大鼠用0.5 mL麻醉劑(戊巴比妥鈉)麻醉，固定在手術(shù)臺上，用剪刀剪去大腿根部的絨毛，在腹股溝處找到股動脈，用手術(shù)刀切斷后，迅速敷上PGAG-CS材料，按壓30～60 s后松開，觀察股動脈切口的出血狀況。

2.8 促創(chuàng)面愈合實驗

將禁食12 h的SD大鼠用0.5 mL麻醉劑麻醉，剪去大鼠背部的絨毛，左右兩側(cè)同處開一個圓形切口，直徑1 cm。左側(cè)為空白組，右側(cè)使用PGAG-CS材料，用藥后正常飼養(yǎng)，中途不消毒、不換藥，觀察第3、7、14 d傷口的愈合情況。

3 結(jié)果與討論

3.1 PGAG-CS材料的結(jié)構(gòu)分析

PGAG-CS、PGAG和CS的紅外光譜(FTIR)圖如圖1所示。在CS的紅外光譜圖中，1 650 cm-1處是C=O的伸縮振動峰，1 598 cm-1處是N—H的彎曲振動峰，1 087 cm-1處是C—O的伸縮振動峰，895 cm-1處是CS特有的糖環(huán)特征吸收峰。在PGAG的紅外光譜圖中，1 635 cm-1處是C=O的伸縮振動峰，1 586 cm-1處是N—H的彎曲振動峰，1 418 cm-1處是COO的對稱伸縮振動峰。在PGAG-CS復合材料的紅外光譜譜圖中，1 601 cm-1處是C=O的伸縮振動峰，1 535 cm-1處為N—H的彎曲振動峰，與CS和PGAG相比，這兩處峰的位置發(fā)生了明顯偏移，這可能是PGAG中的羧基與CS中的氨基發(fā)生靜電作用的結(jié)果。另外，在PGAG-CS復合材料的紅外光譜譜圖中，我們還可以看到COO—的對稱伸縮振動峰(1 403 cm-1)、C—O的伸縮振動峰(1 064 cm-1)和CS特有的糖環(huán)特征吸收峰(897 cm-1)。

圖1 PGAG-CS、PGAG和CS的紅外光譜譜圖Fig.1 FTIR Spectra of PGAG-CS、PGAG and CS

圖2為不同質(zhì)量比的PGAG-CS復合材料(CS:PGAG=8∶1；10∶1；12∶1；14∶1；16∶1)的掃描電鏡圖(SEM)，由圖2可知，復合材料均為層狀堆積結(jié)構(gòu)，具有較多的孔隙和較大的比表面積，水分子可以大量進入到孔隙中。因此，理論上材料可以快速吸收血液中的水分，使傷口處血液中的血小板和凝血因子在材料表面快速集結(jié)，濃度瞬間提高，從而加快凝血速度。當CS和PGAG的質(zhì)量比為10∶1時，層狀結(jié)構(gòu)最為明顯，孔隙率最高。降低CS的含量(CS:PGAG=8∶1)，層狀結(jié)構(gòu)堆積效果變差，孔隙率明顯降低，這可能是由于PGAG分子的粘附性導致的。提高CS的含量(CS:PGAG=12∶1；14∶1；16∶1)，層狀堆積效果也會變差，這可能是由于PGAG含量降低后，與CS分子的相互作用程度降低導致的。

圖2 PGAG-CS復合材料的掃描電鏡圖Fig.2 SEM Pictures of PGAG-CS Composite Materials

3.2 吸水率測試

測試不同質(zhì)量比例的PGAG-CS復合材料的吸水率，結(jié)果如圖3所示。隨著材料中PGAG含量的逐漸降低，材料的吸水率逐漸升高，這是因為CS凝膠化后吸水效率變高，隨著材料中CS含量的升高，吸水率相應變高。與市售的止血粉Celox相比(以殼聚糖為原料制備)，PGAG-CS復合材料具有更高的吸水效率，理論上具有更好的止血效果。

圖3 PGAG-CS復合材料的吸水率測試結(jié)果Fig.3 Water Absorption Ratio of PGAG-CS Composite Materials

3.3 凝血指數(shù)測試

凝血指數(shù)(BCI)代表材料的體外凝血性能，BCI值越低，凝血效果越好，反之則凝血效果越差。我們測試了PGAG-CS復合材料在體外的BCI值，結(jié)果如圖4所示。當材料中的CS與PGAG的質(zhì)量比為10∶1時，BCI值最低(18.97%)，遠低于市售的Celox止血粉產(chǎn)品(34.74%)。當升高或降低CS的含量時，BCI值均升高，說明材料的凝血效果變差，這可能與材料的層狀堆積結(jié)構(gòu)逐漸變差有關(guān)，比表面積的降低和孔隙的減少降低了血紅細胞在材料表面的凝結(jié)效率。

圖4 PGAG-CS復合材料的凝血指數(shù)測試結(jié)果Fig.4 Blood Clotting Index of PGAG-CS Composite Materials

3.4 溶血率測試

圖5表示不同濃度的PGAG-CS復合材料引起血紅細胞的溶血情況，很明顯，隨著材料質(zhì)量濃度的逐漸升高(2 mg/mL→10 mg/mL)，材料的溶血率逐漸升高，但是只有當CS和PGAG的質(zhì)量比為16∶1時，樣品的溶血率超過5%(6.01%，質(zhì)量濃度10 mg/mL)，其他樣品在高質(zhì)量濃度時的溶血率均低于5%。與對照品Celox相比(溶血率4.35%，質(zhì)量濃度10 mg/mL)，PGAG-CS復合材料的溶血率略高(質(zhì)量濃度10 mg/mL，當CS:PGAG為8∶1、10∶1、12∶1、14∶1時，溶血率分別為4.92%、4.63%、4.23%和4.66%)。圖6為各個樣品與血紅細胞結(jié)合后的溶血情況照片，每張照片從左到右依次為：陽性對照、陰性對照，樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL。陽性對照組(tritonX-100)可以導致完全溶血，溶液為紅色，陰性對照組(生理鹽水)為澄清透明，無溶血現(xiàn)象發(fā)生，PGAG-CS材料與對照品Celox的溶液都接近澄清透明，幾乎無溶血現(xiàn)象。

圖5 PGAG-CS復合材料的溶血率測試結(jié)果Fig.5 The Hemolysis Ratio of PGAG-CS Composite Materials

圖6 PGAG-CS復合材料的溶血率測試照片F(xiàn)ig.6 Photos of the Hemolysis Ratio of PGAG-CS Composite Materials

3.5 細胞毒性測試

綜合分析，當CS與PGAG的質(zhì)量比為10∶1時，材料具有最低的凝血指數(shù)、高的吸水效率和低的溶血率，因此我們選擇質(zhì)量比為10∶1的樣品進行后續(xù)的細胞毒性測試。我們將CS與PGAG質(zhì)量比為10∶1的材料溶解在DMEM培養(yǎng)基中制作浸提液，計為質(zhì)量分數(shù)100%，并依次用DMEM培養(yǎng)基稀釋得到質(zhì)量分數(shù)為75%、50%和25%的浸提液，并以此浸提液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)L929細胞，采用MTT法測定細胞的存活情況，同時以二乙基二硫代氨基甲酸鋅(ZDEC)作為陽性對照組，高密度聚乙烯(PE)作為陰性對照組，結(jié)果如圖7所示。當浸提液的質(zhì)量分數(shù)為100%時，細胞的存活率為87.15%，隨著浸提液質(zhì)量分數(shù)的降低，細胞的存活率逐漸升高；當浸提液的質(zhì)量分數(shù)降低至25%時，細胞存活率為108.61%。陽性對照組ZDEC作用下的細胞存活率為8.90%，陰性對照組PE作用下的細胞存活率為107.15%。當市售Celox止血粉浸提液質(zhì)量分數(shù)為100%時，L929細胞的存活率為79.01%，低于PGAG-CS復合材料。

圖7 PGAG-CS復合材料的細胞毒性實驗結(jié)果Fig.7 Cytotoxicity of the PGAG-CS Composite Materials on L929 Cells

3.6 大鼠股動脈止血實驗

如圖8所示，以PGAG-CS復合材料按壓大鼠股動脈30 s后，材料粘附在傷口處，可達到快速止血的效果，等待3 min以上，無二次出血狀況發(fā)生。在同一只大鼠身上，切斷右側(cè)腹股溝處的股動脈，迅速敷上市售的Celox止血粉，按壓30 s后，有少量血液滲出，繼續(xù)按壓30 s后，血液滲出量變大，3 min后，出血量明顯增多。上述實驗結(jié)果表明，PGAG-CS的止血效果明顯優(yōu)于市售的Celox止血粉。

圖8 PGAG-CS復合材料的大鼠股動脈止血實驗Fig.8 Hemostatic Investigation of PGAG-CS on the Femoral Arterial Hemorrhage of Rats

3.7 促創(chuàng)面愈合實驗

如圖9所示，PGAG-CS材料與創(chuàng)面接觸后具有一定的粘附性，第3 d時，創(chuàng)面處有少量PGAG-CS材料殘余；第7 d時，使用PGAG-CS材料的傷口直徑明顯小于左側(cè)空白；第14 d時，使用PGAG-CS材料的傷口接近愈合，而左側(cè)空白仍然有較大面積的傷口。以上結(jié)果表明，PGAG-CS材料除具有不錯的止血性能外，還對創(chuàng)面愈合具有一定的促進效果。

圖9 PGAG-CS對大鼠創(chuàng)面愈合過程的影響Fig.9 Wound-Healing Investigation of PGAG-CS on Rats

4 結(jié)論

以CS和PGAG為原料制備新型的復合止血材料，材料呈層狀堆積結(jié)構(gòu)，具有較多的孔隙和較大的比表面積，有利于血小板和凝血因子在材料表面集結(jié)。材料的吸水率均在800%以上，BCI值低于市售止血粉Celox，說明其吸水迅速，與血紅細胞的結(jié)合能力較好，可有效促進血紅細胞凝結(jié)。另外，PGAG-CS復合材料具有較低的溶血率(<5%)，不會使血液中的血紅細胞破裂，引起溶血現(xiàn)象。當材料中CS與PGAG的質(zhì)量比為10∶1時，材料的體外綜合性能最好，細胞毒性實驗結(jié)果表明材料的細胞毒性低于市售產(chǎn)品Celox。大鼠股動脈止血實驗表明：止血材料可以在30 s內(nèi)止血，且無二次出血現(xiàn)象，對創(chuàng)面愈合也有一定的促進作用。