潘瑞金 姜謐 金麗英 黃濤

(1吉林大學(xué)第一醫(yī)院心臟外科，吉林 長(zhǎng)春 132000；2沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室)

骨骼肌在血糖利用方面作用極其重要，人體約70%的糖原儲(chǔ)存由骨骼肌完成，85%以上的糖分是供給骨骼肌轉(zhuǎn)化成能量和體力的〔1〕。同時(shí)人體所有的活動(dòng)幾乎都是由骨骼肌收縮來(lái)完成的，其強(qiáng)弱直接影響人體的行動(dòng)能力。因此，臨床上糖尿病、肌少癥、肥胖等疾病都與骨骼肌功能缺陷有關(guān)，特別是與年齡、疾病相關(guān)的肌肉損傷或損失有關(guān)〔2〕。巴戟天(Morindae Radix，Morinda officinalis How.)為雙子葉植物藥茜草科植物巴戟天的根〔3〕。《本經(jīng)》有載巴戟天主大風(fēng)邪氣，陰痿不起，強(qiáng)筋骨，安五臟，補(bǔ)中增志益氣。巴戟天主要含有蒽醌類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、糖類(lèi)及黃酮類(lèi)等成分〔4〕。其中巴戟天多糖(MP)具有抗氧化、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗骨質(zhì)酥松等藥理作用〔5〕。本研究將巴戟天水提物(MA)和MP作用于小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12肌管，旨在探討MA及MP調(diào)節(jié)骨骼肌分化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 紫外分光光度計(jì)(WD-9403F)，Bio-Rad成像系統(tǒng)(GelDoc XR+IMAGELAB)，Glomax multi檢測(cè)系統(tǒng)(E8944)，萊卡熒光顯微鏡(DM2500)。

1.1.2試藥 巴戟天購(gòu)自長(zhǎng)春中藥大學(xué)附屬醫(yī)院，C2C12細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection (ATCC)，胎牛血清(FBS)，馬血清(HS)及DMEM購(gòu)于GIBCO公司，MP、D-葡萄糖購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，肌球蛋白重鏈(MyHC)、成肌分化抗原(MyoD)、肌細(xì)胞生成素(Myogennin)抗體購(gòu)自Santa Cruz 生物技術(shù)有限公司，線粒體轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)抗體購(gòu)自Cell Signaling生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞葡萄糖攝取測(cè)試劑盒購(gòu)自Cayman Chemical公司。細(xì)胞線粒體提取試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher 科技公司。

1.2方法

1.2.1MA制備 稱取實(shí)驗(yàn)所需的20 g巴戟天，加入500 ml蒸餾水并浸泡30 min，大火加熱煮沸小火微沸提取兩次每次1.5 h，真空抽濾，合并兩次濾液，濃縮直至膏狀，冷凍干燥48 h，在研磨至粉狀，4℃冷藏備用。

1.2.2MA中多糖的含量測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用硫酸苯酚法，精確稱取MA粉末10 ml，溶解并定容至100 ml容量瓶中。1 ml供試液與1 ml 5%苯酚溶液混勻后加入5 ml濃硫酸，反應(yīng)5 min，水浴加熱15 min，冷卻30 min后，紫外分光光度法，490 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度。并對(duì)儀器精密度、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性及樣品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行方法學(xué)考察，D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算MA中多糖的含量。

1.2.3細(xì)胞的培養(yǎng)及分化 C2C12細(xì)胞采用含有10%FBS的DMEM，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%左右，用含有2% HS的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)肌管分化，每天更換培養(yǎng)基，連續(xù)誘導(dǎo)5 d至肌管形成后，不同濃度的MA和MP及陽(yáng)性藥二甲雙胍給藥24 h，細(xì)胞收獲后備用。將細(xì)胞分成6組，N組正常培養(yǎng)，MA0.5組為MA 0.5 mg/ml給藥組，MA1.0為MA 1.0 mg/ml給藥組，MP1.0組為MP 1.0 mg/ml給藥組，MP2.0組為MP 2.0 mg/ml給藥組，M組為二甲雙胍給藥組。

1.2.4細(xì)胞活性檢測(cè) 將C2C12細(xì)胞接種于96孔板中(103個(gè)/孔)，用不同濃度的MA和MP及陽(yáng)性藥二甲雙胍給藥24 h后，移除培養(yǎng)基，按EZ-cytox細(xì)胞活性試劑盒方法，測(cè)量OD值，計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.5Western印跡 C2C12 肌管給藥24 h后，細(xì)胞收獲，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離凝膠，80 V電泳分離蛋白，4℃ 120 V轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉3 h。分別一抗、二抗孵育后，于Bio-Rad成像系統(tǒng)下加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液顯影，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.2.6C2C12肌管糖攝取量檢測(cè) C2C12肌管給藥24 h后，采用細(xì)胞葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒方法饑餓培養(yǎng)6 h后，培養(yǎng)基中加入熒光葡萄糖類(lèi)似物(2-NBDG)100 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，485/650 nm(激發(fā)光/發(fā)射光)濾鏡下熒光檢測(cè)C2C12肌管2-NBDG的攝取量。

1.2.7C2C12肌管線粒體提取 C2C12肌管給藥24 h后，采用細(xì)胞線粒體提取試劑盒方法，收獲的細(xì)胞1×磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，加入800 μl試劑A，中速渦旋裂解5 s，加入10 μl試劑B，以高速度渦旋5 s，冰上冷卻5 min，期間每分鐘渦旋1次，5 s/次，加入800 μl混合有1%的蛋白酶抑制劑的試劑C，混合均勻，4℃，750 r/min離心10 min，取上清14 000 r/min離心15 min，再將沉淀加入500 μl試劑C，4℃，14 000 r/min離心5 min，管內(nèi)沉淀即為線粒體。線粒體蛋白提取后，BAC法測(cè)定線粒體蛋白含量。

1.2.8C2C12免疫熒光染色 將C2C12接種于Thermanox塑料蓋片上并誘導(dǎo)肌管分化，C2C12肌管給藥24 h后，用4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Triton X-100孵育20 min，1×PBS沖洗后，用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育30 min，MyHC抗體4℃孵育過(guò)夜。隨后用熒光染料AlexaFluor 488室溫孵育1 h，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min。最后，200倍鏡下熒光顯微鏡觀察MyHC的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，并用GraphPad分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MA中MP的含量測(cè)定 以D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，所得線性方程為y=10.175x+0.005，R=0.999 6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在0.02～0.10 mg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。平行制備MA溶液6份，測(cè)定MA溶液中多糖平均含量為5.23%，RSD值為1.56%，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2MA與MP對(duì)C2C12細(xì)胞活性的影響 MA 0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mg/ml處理C2C12細(xì)胞活性分別為(99.89±1.67)%、(103.91±2.32)%、(107.58±2.21)%、(113.74±3.43)%、(117.45±2.27)%、(90.80±2.14)%；MP 0.00、0.01、0.05、0.10、0.20、0.40處理C2C12細(xì)胞活性分別為：(100.11±1.48)%、(103.25±2.95)%、(107.57±2.78)%、(112.18±3.65)%、(117.29±1.01)%、(87.02±4.46)%。0.10、0.50、1.00 mg/ml的MA可以顯著增強(qiáng)C2C12細(xì)胞活性(P<0.05)；2.0 mg/ml的MA可以顯著抑制C2C12細(xì)胞活性(P<0.05)。0.05、0.10、0.20 mg/ml 的MP可以顯著增強(qiáng)C2C12細(xì)胞活性(P<0.05)；0.40 mg/ml的MA可以顯著抑制C2C12細(xì)胞活性(P<0.05)。通過(guò)C2C12細(xì)胞活性測(cè)試結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇0.50、1.00 mg/ml為后續(xù)實(shí)驗(yàn)MA給藥濃度，0.10、0.20 mg/ml為MP后續(xù)實(shí)驗(yàn)給藥濃度。

2.3MA與MP對(duì)C2C12肌管糖攝取的調(diào)節(jié)作用 MA 1.0組、MP 2.0組、M組C2C12肌管的葡萄糖攝取能力及GLUT4蛋白表達(dá)與N組相比存在顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 各組肌管葡萄糖攝取能力及GLUT4、MyHC、MyoD、Myogenin蛋白表達(dá)比較

圖2 各組GLUT4、MyHC、MyoD、Myogenin蛋白表達(dá)比較

2.4MA與MP對(duì)C2C12肌管分化的調(diào)節(jié)作用 MA1.0組、MP1.0組、MP2.0組C2C12肌管中MyHC蛋白表達(dá)水平與N組相比存在顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。同時(shí)對(duì)C2C12肌管中MyHC的表達(dá)進(jìn)行熒光染色，結(jié)果如圖3所示，MA與MP能夠有效增加肌管分化長(zhǎng)度和MyHC表達(dá)的熒光亮度。MA1.0組、MP2.0組的C2C12肌管中MyoD、Myogenin蛋白表達(dá)水平與N組相比存在顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖3 C2C12肌管MyHC蛋白免疫熒光染色(×200)

2.5MQ與MP對(duì)C2C12肌管線粒體功能的調(diào)節(jié)作用 與N組相比，其余各組C2C12肌管線粒體蛋白含量顯著增加，MA1.0組與MP2.0組中C2C12肌管線粒體蛋白的TFAM表達(dá)水平較N組差異顯著(均P<0.05)。見(jiàn)表1、圖4。

圖4 TFAM蛋白表達(dá)

3 討 論

巴戟天為補(bǔ)腎要?jiǎng)?，能治五勞七傷，?qiáng)陰益精。氣味辛溫，又能祛風(fēng)除濕，故可用于腰膝疼痛，風(fēng)氣腳氣水腫等癥。《千金要方》中將巴戟天配伍淮牛膝，主要以巴戟天補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋骨，以淮牛膝補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，以酒助藥力。用于肝腎不足，腎陽(yáng)虛衰，陽(yáng)痿，腰膝酸軟，下肢無(wú)力。多糖是中藥中廣泛存在的成分，有研究證明巴戟天能夠降低高血糖小鼠的血糖并提高高血糖小鼠的抗氧化能力〔6〕。研究表明，MP能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，具有抗骨質(zhì)疏松的作用〔7〕。

肌管是一種高度代謝活性的細(xì)胞類(lèi)型，線粒體生物發(fā)生可以響應(yīng)代謝轉(zhuǎn)移，如肌管的發(fā)生和分化所需能量的增加及肌管中的糖代謝能力增強(qiáng)〔8〕。線粒體生物發(fā)生是由一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，TFAM就是研究線粒體發(fā)生調(diào)控機(jī)制的重要靶點(diǎn)之一。TFAM通過(guò)與線粒體DNA (mtDNA) 輕鏈和重鏈的啟動(dòng)子區(qū)域特異性的結(jié)合，從而激活mtDNA的轉(zhuǎn)錄〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，1.0 mg/ml MA與0.2 mg/ml MP可以通過(guò)調(diào)節(jié)TFAM蛋白表達(dá)有效提高線粒體生物發(fā)生。線粒體生物發(fā)生為C2C12肌管的分化提供能量，成肌細(xì)胞向肌管分化是由成肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族調(diào)控的，如MyoD、MRF4、Myf5和Myogenin〔10〕。MyHC是肌原纖維粗絲的骨架成分之一。Lin等〔11〕以MyoD、Myogenin及MyHC表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)C2C12肌管分化狀態(tài)。本研究結(jié)果證明，1.0 mg/ml MA與0.2 mg/ml MP可以通過(guò)調(diào)節(jié)MyoD、Myogenin及MyHC的表達(dá)加強(qiáng)C2C12肌管分化水平。葡萄糖的利用能力是骨骼肌功能的重要評(píng)價(jià)。GLUT4 是細(xì)胞膜上的一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，與葡萄糖攝取能力呈正相關(guān)。研究表明GLUT4基因表達(dá)障礙可以引起糖耐量減退和胰島素抵抗〔12〕。本研究結(jié)果表明，1.0 mg/ml MA與0.2 mg/ml MP可以通過(guò)調(diào)節(jié)GLUT4蛋白表達(dá)有效增強(qiáng)C2C12肌管葡萄糖攝取能力。

綜上，巴戟天和MP可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生促進(jìn)C2C12 肌管分化及葡萄糖攝取。因此巴戟天及MP可能會(huì)通過(guò)改善骨骼肌功能缺陷應(yīng)用于糖尿病、肌少癥、肥胖等疾病，本研究將為巴戟天及MP的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)及科研依據(jù)。