王志華 李敘 魏小東

(解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院心胸外科，江蘇 無(wú)錫 214000)

肺癌(LC)是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一〔1〕。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，2025年后，我國(guó)每年將有超過(guò)百萬(wàn)的新增LC病例，抗癌形勢(shì)嚴(yán)峻〔2〕。LC中約85%為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，主要細(xì)分為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌〔3〕。大多數(shù)NSCLC患者早期臨床癥狀不明顯，而確診時(shí)已處于晚期，且因?qū)ζ浞肿硬±韺W(xué)的認(rèn)識(shí)有限，缺乏可靠的早期檢測(cè)生物標(biāo)志物，預(yù)后較差〔4〕。血管生成幾乎是全部實(shí)體惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，并且腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移與其血管形成密切相關(guān)〔5〕。腫瘤微環(huán)境中存在著多種血管生成因子可調(diào)控腫瘤血管生成，故研究抗腫瘤血管形成的方法有望成為治療腫瘤的新策略，而迄今為止，許多血管生成因子已被證實(shí)由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，其中，CXC趨化因子配體(CXCL)8作為一種重要的多功能細(xì)胞因子，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移〔6,7〕。研究表明，CXCL8表達(dá)增加，能夠加速腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和侵襲〔8〕；其過(guò)度表達(dá)對(duì)肺腺癌的發(fā)生及發(fā)展都會(huì)產(chǎn)生重要影響〔9〕。然而，關(guān)于CXCL8與NSCLC血管生成關(guān)系的研究并不多見(jiàn)。本研究探討CXCL8表達(dá)與NSCLC患者血管生成及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 選擇2012年1月至2015年6月在解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療NSCLC患者為研究對(duì)象，收集其病理標(biāo)本及病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第七版)對(duì)NSCLC進(jìn)行分期〔10〕；(2)患者術(shù)前未進(jìn)行抗腫瘤治療；(3)病例隨訪資料完整，未出現(xiàn)失訪。共有87例NSCLC患者入組，其中男51例，女36例，平均年齡(66.47±16.38)歲；TNM分期：Ⅰ期31例(35.63%)，Ⅱ期26例(29.89%)，Ⅲ期30例(34.48%)；腫瘤高分化24例(27.59%)，中分化41例(47.13%)，其他22例(25.29%)為低分化。截至2020年12月31日，33例患者存活，其他54例均因腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而死亡。

1.2免疫組化法檢測(cè)CXCL8〔11〕將癌旁和癌癥組織的蠟塊制成石蠟切片，厚度為4 μm，65℃條件下加熱2 h后制備涂膠白片；對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟脫苯處理，之后采用乙二胺四乙酸(EDTA)修復(fù)抗原；之后用過(guò)氧化氫溶液浸泡15 min，以使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3 min/次，但不能直接沖刷組織；山羊血清封閉，滴加一抗后，于4℃條件孵育過(guò)夜；用PBS再次洗滌，滴加生物素化二抗孵育，所有切片在室溫下用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液處理約5 min，再次用PBS洗滌后，用蘇木素進(jìn)行復(fù)染；最后脫水處理，封片，顯微鏡閱片并拍照。

1.3CXCL8表達(dá)〔12〕每張切片以細(xì)胞染色強(qiáng)度及染色比例作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，并由至少2名病理學(xué)領(lǐng)域?qū)＜疫M(jìn)行評(píng)分，評(píng)判結(jié)果一致則接受，否則重新判片。(1)染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色為0分，弱染色(淡黃色)為1分，中等染色(棕黃色)為2分，強(qiáng)染色(棕褐色)為3分。(2)癌癥細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞<10%為0分，10%～25%為1分，>25%且≤50%為2分，>50%且≤75%為3分，>75%為4分。最后以染色強(qiáng)度評(píng)分和比例評(píng)分的乘積進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，分?jǐn)?shù)介于0～12分，0～4分則判定為低表達(dá)(+)，5～8分判定為中表達(dá)()，9～12分則為高表達(dá)()。

1.4微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)〔13〕采用CD34對(duì)腫瘤組織微血管進(jìn)行標(biāo)記。首先，在低倍視野下找到3個(gè)生成最明顯的區(qū)域；然后高倍視野下分別計(jì)數(shù)，取其平均值作為MVD計(jì)數(shù)結(jié)果。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：(1)血管內(nèi)皮細(xì)胞：陽(yáng)性染色(棕黃色)為1個(gè)微血管；(2)內(nèi)皮細(xì)胞簇：明顯區(qū)別于鄰近組織，之間無(wú)連接，為1個(gè)微血管；(3)排除肌層較厚、血管腔內(nèi)超過(guò)8個(gè)紅細(xì)胞的血管。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析及Spearman相關(guān)性分析，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析CXCL8表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1CXCL8表達(dá) 在癌癥組織和癌旁組織中均可見(jiàn)CXCL8表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞核內(nèi)有少量表達(dá)，呈棕褐色。見(jiàn)圖1。87例標(biāo)本中，癌癥組織中共53例(60.92%)CXCL8陽(yáng)性表達(dá)；而癌旁組織中有38例(43.68%)陽(yáng)性表達(dá)，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=5.183，P=0.023)。

圖1 肺癌組織和癌旁組織CXCL8表達(dá)免疫組化(×20)

2.2CXCL8表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系 在癌癥組織中，CXCL8陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移及TNM分期明顯相關(guān)(P<0.05)，而患者性別、年齡和腫瘤直徑對(duì)其表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CXCL8陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC患者病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.3MVD計(jì)數(shù)與病理參數(shù)的關(guān)系 CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，腫瘤新生血管主要位于腫瘤間質(zhì)中；腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期對(duì)MVD計(jì)數(shù)具有顯著影響(P<0.05)，表現(xiàn)為腫瘤越大、分化越高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期越高，MVD計(jì)數(shù)越多；而患者性別和年齡對(duì)MVD計(jì)數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

表2 MVD計(jì)數(shù)與病理參數(shù)的關(guān)系

圖2 CD34蛋白標(biāo)記的MVD(HE染色，×200)

2.4CXCL8表達(dá)與MVD關(guān)系 癌癥組織中CXCL8陽(yáng)性表達(dá)患者的MVD計(jì)數(shù)〔(39.97±12.51)個(gè)〕顯著高于陰性表達(dá)患者〔(31.95±9.48)個(gè)；P<0.05〕；相關(guān)性分析顯示，CXCL8表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.563，P<0.001)。

2.5患者生存分析 Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)一步評(píng)估CXCL8表達(dá)與NSCLC患者生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果表明CXCL8陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率低于陰性表達(dá)患者，即CXCL8陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后較差。見(jiàn)圖3。

圖3 CXCL8表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

2.6COX回歸分析 以NSCLC患者是否存活為因變量，自變量包括CXCL8表達(dá)(陽(yáng)性=1，陰性=0)、性別(男=1，女=0)、年齡(60～79歲=1，30～59歲=0)、腫瘤直徑(≥3 cm =1，<3 cm =0)、腫瘤分化程度(高、中分化=1，低分化=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是=1，否=0)及TNM分期(Ⅲ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0)，進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果CXCL8陽(yáng)性表達(dá)、腫瘤高、中分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

表3 COX回歸分析

3 討 論

盡管放療、化療及手術(shù)治療等多種手段用于NSCLC，然而，肺癌的5年生存率僅為60%～80%，總體預(yù)后較差，因?yàn)槎鄶?shù)LC患者在確診時(shí)已是局部晚期或病灶轉(zhuǎn)移〔14〕。因此，尋找新的治療靶標(biāo)對(duì)于LC預(yù)后改善及其生存率提高均意義重大。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移受到一系列生物學(xué)行為的影響，包括癌癥細(xì)胞的遷移、微血管形成及與腫瘤微環(huán)境間的相互作用等；趨化因子被認(rèn)為是這些生物學(xué)過(guò)程中的主要調(diào)節(jié)因子，是一類(lèi)分泌到血液循環(huán)中的蛋白質(zhì)，通過(guò)與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合發(fā)揮作用，介導(dǎo)與細(xì)胞歸巢和遷移相關(guān)的許多生理和病理過(guò)程，腫瘤細(xì)胞上趨化因子受體的過(guò)度表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔15〕。

CXC趨化因子分為ELR(+)和ELR(-)兩個(gè)亞組，發(fā)揮著不同的功能作用；人類(lèi)有7種ELR(+)趨化因子，而CXCL8是其中最突出的成員。CXCL8與細(xì)胞表面糖胺聚糖(GAG)結(jié)合并通過(guò)激活兩個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)CXCR1和CXCR2來(lái)調(diào)節(jié)其功能〔16〕。其對(duì)多種已知的免疫細(xì)胞具有趨化性，在血管生成、傷口愈合和炎癥等方面起重要作用〔17〕。研究可知，CXCL8的異常表達(dá)與慢性阻塞性肺疾病、人類(lèi)阻塞性胰腺炎、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、囊性纖維化和許多癌癥等病理狀態(tài)有關(guān)〔18〕。CXCL8是最常見(jiàn)的促炎因子，而炎癥反應(yīng)失控會(huì)加速腫瘤發(fā)生；腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移是影響該類(lèi)患者預(yù)后及術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，而CXCL8與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切〔19〕，可見(jiàn)CXCL8在多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

關(guān)于NSCLC中CXCL8的表達(dá)目前仍存在一定爭(zhēng)議。楊正斌等〔20〕通過(guò)免疫組化法檢測(cè)到CXCL8在LC患者癌癥組織及癌旁組織中的表達(dá)并無(wú)顯著差別；Cury等〔21〕則發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中CXCL8高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)；鄔志勇等〔22〕研究認(rèn)為CXCL8對(duì)腫瘤的作用可能具有雙面性，可能還存在一定的抗腫瘤作用，至于在患者體內(nèi)哪個(gè)為主導(dǎo)，有待進(jìn)一步研究予以確認(rèn)。本研究結(jié)果說(shuō)明，CXCL8在癌癥組織中高表達(dá)，這與Cury等〔21〕研究結(jié)論相符。本研究結(jié)果提示，CXCL8的表達(dá)與NSCLC進(jìn)展有關(guān)，這可能與其促腫瘤血管生成脫不開(kāi)關(guān)系。

血管生成是指由現(xiàn)有血管中生成新的血管，是由多種促血管生成和抗血管生成因子的復(fù)雜相互作用決定的；血管生成是腫瘤生長(zhǎng)超過(guò)1～2 mm直徑的先決條件，當(dāng)腫瘤細(xì)胞不能再通過(guò)簡(jiǎn)單的擴(kuò)散提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)時(shí)，為了增大腫瘤的體積，腫瘤經(jīng)歷了血管生成開(kāi)關(guān)，促血管生成因子的作用導(dǎo)致血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤血管形狀不規(guī)則，分支不規(guī)則，基底膜斷裂，使其通透腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移，故腫瘤的發(fā)展離不開(kāi)血管生成〔23〕。在這種情況下，MVD作為新生血管的直接表達(dá)及腫瘤血管的浸潤(rùn)被認(rèn)為是許多腫瘤，特別是肺癌的危險(xiǎn)進(jìn)展的標(biāo)志〔24〕。本研究結(jié)果提示，NSCLC形成新的血管后，可能促進(jìn)其腫瘤增大及分化，進(jìn)一步發(fā)生惡化，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后。

本研究結(jié)果提示，CXCL8與腫瘤血管微血管形成有關(guān)?？赡苁荖SCLC組織通過(guò)分泌通過(guò)CXCL8，加速其與受體CXCR1和CXCR2結(jié)合，直接誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而加速微血管生成并使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，疾病更加惡化，影響患者預(yù)后〔25〕。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果提示，CXCL8陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后較差；COX回歸分析也證實(shí)，除腫瘤高、中分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等因素外，CXCL8陽(yáng)性表達(dá)也是NSCLC預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，驗(yàn)證了以上結(jié)論。

綜上，CXCL8在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC患者M(jìn)VD計(jì)數(shù)、病理參數(shù)及預(yù)后密切相關(guān)，可能通過(guò)促進(jìn)微血管的生成而影響NSCLC進(jìn)程，提示臨床可通過(guò)檢測(cè)CXCL8表達(dá)用于NSCLC診療。但是，癌癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，CXCL8表達(dá)對(duì)NSCLC預(yù)后的實(shí)際影響，仍需更加深入的研究予以證實(shí)。