石俊 關(guān)振群 王訓(xùn)霞 張為新

(1青島市海慈醫(yī)療集團青島市中醫(yī)醫(yī)院口腔科，山東 青島 266000；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院口腔科)

神經(jīng)組織是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)的重要成分，主要由神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。神經(jīng)細(xì)胞可進(jìn)行信息接收、整合，并進(jìn)行信息傳導(dǎo)，但是神經(jīng)細(xì)胞在發(fā)生損傷后很難再生，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再次修復(fù)成為臨床研究的難題〔1〕。因此，尋找一種增殖能力強、安全、易采集，且可分化為神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞非常關(guān)鍵，以實現(xiàn)臨床神經(jīng)修復(fù)治療〔2〕。有學(xué)者嘗試將胚胎干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞，但研究中發(fā)現(xiàn)，此類細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞在移植后極易出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如畸胎瘤等，且樣本獲取難度大，對患者機體造成損傷明顯〔3〕。有學(xué)者指出，牙齦成纖維細(xì)胞具有很高的分化潛能，可進(jìn)行多向分化，與胚胎干細(xì)胞及骨髓干細(xì)胞相比獲取途徑簡單〔4〕。本研究選取阻生齒拔除患者牙齦組織，對其進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)，通過觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測神經(jīng)遞質(zhì)分析牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的可行性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取青島市海慈醫(yī)療集團青島市中醫(yī)醫(yī)院2018年5月至2019年12月收治的阻生齒拔除患者，取其周圍正常牙齦組織作為研究樣本，其中男6例，女4例，年齡19～32歲，平均(24.5±1.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組患者均經(jīng)阻生齒拔除治療；(2)患者無口腔炎癥；(3)患者對于本次研究內(nèi)容知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者曾患有嚴(yán)重的口腔疾病，如口腔腫瘤；(2)患者存在精神障礙或溝通障礙；(3)患者存在影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的相關(guān)疾病。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1原代培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞 對獲取組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，選擇組織貼壁法，低糖DMEM培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入15%胎牛血清，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗所得組織，取含高濃度雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液，浸泡組織20 min，取組織置于培養(yǎng)皿中，將組織上的殘留血管、上皮組織去除，制成組織小塊，移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃環(huán)境中，二氧化碳濃度為5%，4 h后輕翻培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液每3 d進(jìn)行1次更換，每次更換注意沒過組織，使用顯微鏡觀察是否存在細(xì)胞移出情況。

1.2.2傳代培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞 對培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行密切觀察，確定其長至80%融合時進(jìn)行分解，分解取胰蛋白酶，濃度為0.25%，繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，比例為1∶3，對人牙齦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行收集，置于-20℃環(huán)境中存儲，并將其記為對照組。

1.2.3鑒定人牙齦成纖維細(xì)胞 制備人牙齦成纖維細(xì)胞爬片，選擇對數(shù)生長期第4代的細(xì)胞，使用濃度為0.25%的胰酶進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，靜置30 min，加入完全培養(yǎng)液至培養(yǎng)皿中，劑量完全覆蓋玻片。將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長至60%時去除培養(yǎng)液，使用PBS進(jìn)行3次沖洗，使用丙酮進(jìn)行24 h固定。免疫細(xì)胞化學(xué)染色，將固定好的爬片使用PBS進(jìn)行數(shù)次沖洗，按照免疫組化法檢測試劑盒進(jìn)行操作，顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并對染色結(jié)果進(jìn)行拍照。

1.2.4牙齦成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng) 誘導(dǎo)時選擇第4代對數(shù)生長期的細(xì)胞，取低糖DMEM培養(yǎng)液，加入15%的胎牛血清，將1 mmol/L的β-巰基乙醇(ME)及20 μmol/L維甲酸加入培養(yǎng)液中，使用濃度為2%的DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)，時間為12 d，每48 h進(jìn)行1次換液，每次換液后在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，對神經(jīng)樣細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行收集，置于-20℃冰箱中待檢，該組記為誘導(dǎo)組。

1.2.5鑒定神經(jīng)樣細(xì)胞 免疫熒光化學(xué)法鑒定：取誘導(dǎo)12 d的細(xì)胞制成爬片，使用丙酮進(jìn)行24 h固定，使用PBS進(jìn)行洗滌，2 min/次，洗滌3次，孵育切片后，依次加入一抗、二抗，孵育期間注意避光，完成染色后使用甘油封片，并在顯微鏡下進(jìn)行染色觀察，拍片。免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定：在對人牙齦纖維細(xì)胞進(jìn)行12 d誘導(dǎo)后，制備細(xì)胞爬片，方法與上文中一致，分別加入鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、鼠抗人vimentin單克隆抗體及鼠抗人人微管相關(guān)蛋白(MAP)-2單克隆抗體，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，記錄染色結(jié)果。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗對神經(jīng)樣細(xì)胞分泌功能進(jìn)行測定：對誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞培養(yǎng)液及人牙齦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行測定，離心處理對照組細(xì)胞培養(yǎng)液(人牙齦成纖維細(xì)胞)及誘導(dǎo)組(神經(jīng)樣細(xì)胞)培養(yǎng)液，進(jìn)行20 min離心處理，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，按要求加樣。取兩組待測樣品，分別設(shè)置12個樣本孔，對待測樣本進(jìn)行稀釋處理，在樣本孔中加入酶標(biāo)試劑，封板孵育，完成孵育后進(jìn)行顯色處理，測定吸光度，計算每組吸光度數(shù)值平均值，整理數(shù)據(jù)，對神經(jīng)遞質(zhì)濃度含量進(jìn)行計算。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1培養(yǎng)及鑒定人牙齦成纖維細(xì)胞

2.1.1人牙齦成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果分析 在進(jìn)行原代培養(yǎng)5～7 d時可觀察到細(xì)胞爬出，細(xì)胞有突起，胞體呈紡錘形或梭形，存在明顯的細(xì)胞輪廓，核呈卵圓形，細(xì)胞體及細(xì)胞核均較大，有明顯核仁，著色淺。游離細(xì)胞數(shù)量隨時間延長逐漸增多，生長方向為同一方向，呈簇樣生長，見圖1。

2.1.2傳代培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞 在確定培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長達(dá)到要求時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)期間細(xì)胞生長良好，細(xì)胞器豐富，增殖旺盛，在培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，見圖1。

圖1 原代及傳代培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞

2.1.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定人牙齦成纖維細(xì)胞 人牙齦成纖維細(xì)胞經(jīng)染色顯示為vimentin表達(dá)陽性，細(xì)胞核為被染為藍(lán)色，細(xì)胞胞質(zhì)被染為棕黃色。人牙齦成纖維細(xì)胞呈GFAP表達(dá)陰性，細(xì)胞核被染為藍(lán)色，而細(xì)胞胞質(zhì)未染色。人牙齦成纖維細(xì)胞呈MAP-2表達(dá)陰性，細(xì)胞核被染為藍(lán)色，細(xì)胞胞質(zhì)未被染色，見圖2。

A、B：vimentin陽性；C、D：GFAP陰性，細(xì)胞呈梭形；E、F：MAP-2陰性圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定人牙齦成纖維細(xì)胞(×400)

2.2誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞

2.2.1在誘導(dǎo)后第5天便可觀察到成纖維細(xì)胞胞體發(fā)生轉(zhuǎn)變，部分細(xì)胞由原來的梭形轉(zhuǎn)變?yōu)樾切位蛉切?，?xì)胞由原本的2個突起增長為3個及以上，細(xì)胞核變圓，突起細(xì)長，出現(xiàn)軸突樣和樹突樣結(jié)構(gòu)，且互相連接，呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且隨誘導(dǎo)時間延長，其呈現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞改變越明顯，在誘導(dǎo)第12天，幾乎無梭形細(xì)胞存在，細(xì)胞形態(tài)均改變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞形態(tài)，見圖3。

A、B：胞體呈三角形或多邊形，多突起，連成網(wǎng)；C、D：胞體呈三角形，細(xì)胞多突起；E、F：胞體呈多邊形，細(xì)胞突起尖細(xì)長；G、H：胞體呈多邊形，多突起圖3 成纖維細(xì)胞胞體形態(tài)逐漸成為神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)(×400)

2.2.2對誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，還可對細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，神經(jīng)樣細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后7 d會出現(xiàn)凋亡情況。

2.3鑒定神經(jīng)樣細(xì)胞

2.3.1采用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)樣細(xì)胞 經(jīng)染色顯示，神經(jīng)樣細(xì)胞為vimentin表達(dá)陽性，細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞質(zhì)染為棕黃色；經(jīng)染色顯示神經(jīng)樣細(xì)胞GFAP表達(dá)陽性，細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞質(zhì)被染為棕黃色；經(jīng)染色顯示神經(jīng)樣細(xì)胞MAP-2表達(dá)陽性，細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞質(zhì)被染為棕黃色，見圖4。

2.3.2采用免疫熒光化學(xué)法鑒定神經(jīng)樣細(xì)胞 經(jīng)染色顯示，神經(jīng)陽性細(xì)胞為GFAP表達(dá)陽性，且細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞質(zhì)為綠色熒光染色；經(jīng)染色顯示，神經(jīng)陽性細(xì)胞為MAP-2表達(dá)陽性，細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞質(zhì)為紅色熒光，見圖5。

圖5 免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞GFAP、MAP-2表達(dá)陽性(×200)

2.3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測神經(jīng)細(xì)胞分泌的神經(jīng)遞質(zhì) 誘導(dǎo)組乙酰膽堿及多巴胺濃度〔(75.6±3.8)、(56.2±3.8)pg/ml)〕均明顯高于對照組〔(12.6±1.7)、(8.9±1.1)pg/ml；均P<0.05〕。

3 討 論

多種疾病可導(dǎo)致神經(jīng)損傷發(fā)生，而神經(jīng)細(xì)胞往往不可再生，因此尋找一種良好治療方案對于改善神經(jīng)損傷有著非常重要的意義。細(xì)胞移植可有效補充患者神經(jīng)細(xì)胞，改善患者預(yù)后，但是如何誘導(dǎo)可移植的神經(jīng)細(xì)胞一直以來都是臨床研究的難題〔5〕。干細(xì)胞由成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞組成，其功能不同又可分為多種干細(xì)胞，在皮膚、骨髓、神經(jīng)、脂肪等多種組織中均存在成體干細(xì)胞〔6〕。有研究指出，對牙髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)可分化為牙髓干細(xì)胞，隨技術(shù)不斷成熟，已在口腔牙齦的固有層中發(fā)現(xiàn)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞〔7〕。有研究指出，采用綠色熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)記后的體外培養(yǎng)人牙齦間質(zhì)干細(xì)胞植入到牙周，發(fā)現(xiàn)其可有效修復(fù)牙周膜及牙骨質(zhì)〔8〕。成體干細(xì)胞具有多向分化潛能，可塑性很強，在達(dá)到一定條件時可與不同胚層及相同胚層起源的成體干細(xì)胞進(jìn)行互相轉(zhuǎn)換〔9〕。有報道指出，牙齦成纖維細(xì)胞具有分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞等潛能〔10〕。結(jié)合以往研究可以看出，牙齦成纖維細(xì)胞具有多向分化潛能，且在樣本取樣方面具有一定優(yōu)勢〔11〕。

神經(jīng)細(xì)胞在人體中發(fā)揮重要作用，主要負(fù)責(zé)信息傳導(dǎo)，從而構(gòu)成了意識、思想、感覺及復(fù)雜運動等，但是在發(fā)生神經(jīng)損傷后其自愈能力差，增加其修復(fù)難度〔12〕。通過對人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)可分化為多種細(xì)胞類型。神經(jīng)細(xì)胞主要由軸突、樹突、胞體3部分組成，每個神經(jīng)細(xì)胞含有一個軸突，多個樹突。本研究發(fā)現(xiàn)，在完成誘導(dǎo)后形成的神經(jīng)樣細(xì)胞胞體由原來的梭形變?yōu)槿切位蚨噙呅?，?xì)胞伸出突起，且突起之間相互連接形成網(wǎng)狀，其結(jié)構(gòu)與神經(jīng)細(xì)胞的軸突、樹突樣結(jié)構(gòu)一致。牙齦成纖維細(xì)胞表面存在特異性標(biāo)志物，且呈現(xiàn)vimentin蛋白陽性，可看出在正常生理條件下的牙齦成纖維細(xì)胞中存在vimentin蛋白，而進(jìn)行進(jìn)一步分析時發(fā)現(xiàn)，牙齦成纖維細(xì)胞中不含神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物GFAP及神經(jīng)元特異性表面標(biāo)志物MAP-2，經(jīng)免疫組化法檢測顯示為陰性。進(jìn)一步證實本研究所獲取的牙齦成纖維細(xì)胞為結(jié)締組織細(xì)胞，而并非神經(jīng)組織來源。在完成誘導(dǎo)后再次對誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果提示誘導(dǎo)后獲得的神經(jīng)樣細(xì)胞除呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)外，還可進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)，但是其中仍保留有牙齦成纖維細(xì)胞的免疫特征。因細(xì)胞移植的關(guān)鍵在于細(xì)胞功能，在對其誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)及蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析后，本研究對其細(xì)胞功能進(jìn)行了進(jìn)一步分析。有報道指出，帕金森綜合征、阿爾茨海默病等神經(jīng)元退變類疾病的發(fā)病與多巴胺能神經(jīng)元及膽堿能神經(jīng)元的變性有關(guān)〔13〕。有研究指出，可對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其分化為神經(jīng)細(xì)胞，并且誘導(dǎo)后的細(xì)胞可產(chǎn)生乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)〔14〕。有學(xué)者提出，在去甲腎上腺素的交感神經(jīng)元中可同時存在去甲腎上腺素及乙酰膽堿〔15〕。近幾年，多種生物化學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用，越來越多的研究證實，在一個神經(jīng)元中可共存由兩種或以上幾種神經(jīng)遞質(zhì)。本研究結(jié)果說明，將牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)樣細(xì)胞不僅具有神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)，還同樣具有神經(jīng)細(xì)胞分泌功能，可分泌相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)，行駛神經(jīng)細(xì)胞的功能。本研究初步證實，可由牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)樣細(xì)胞，但是對于其是否滿足臨床移植需求還需進(jìn)行進(jìn)一步研究證實。

綜上，對牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理可獲得神經(jīng)樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后細(xì)胞不僅具有神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)，同樣具有神經(jīng)細(xì)胞的分泌功能，分泌大量的乙酰膽堿及多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)。