何樹華, 江 虹

(長(zhǎng)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 408100)

食品中的色素分為天然色素和合成色素，天然色素在加工或儲(chǔ)存過程中易褪色，而合成色素則具有色澤鮮艷、穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。在食品加工業(yè)中，常添加各種合成色素來刺激食欲，提高消費(fèi)者的購(gòu)買欲望。然而，當(dāng)色素被超量使用時(shí)，可能導(dǎo)致人體中毒、致癌或死亡。由此各國(guó)對(duì)合成色素的使用作了嚴(yán)格規(guī)定，我國(guó)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定飲料中胭脂紅的含量不得超過0.05 g/kg，酒石黃的含量不得超過0.10 g/kg?？梢?，研究食品中共存胭脂紅和酒石黃的含量有著重要意義。目前報(bào)道合成色素檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[1 - 4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5,6]、電化學(xué)法[7 - 9]、熒光法[10,11]和紫外-可見分光光度法[12 - 16]。高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法存在成本高、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)等不足；電化學(xué)法需特殊電極材料；熒光法對(duì)所用試劑有特殊要求；紫外-可見分光光度法所用設(shè)備價(jià)廉易購(gòu)、操作簡(jiǎn)單、快速，但在食品色素的檢測(cè)中，常因食品成分復(fù)雜，有的共存色素間存在嚴(yán)重的吸收光譜重疊現(xiàn)象，以至于很難用紫外-可見分光光度法進(jìn)行共存色素的定量分析。文獻(xiàn)[14 - 16]報(bào)道的分光光度法是用求解復(fù)雜的聯(lián)立方程，文獻(xiàn)[12,13]是通過復(fù)雜的色素分離措施來實(shí)現(xiàn)分光光度法測(cè)定共存色素的問題，可見這兩種分光光度法均很麻煩。本工作首先將被分析物進(jìn)行光譜定性分析，確定樣品中可能的共存色素，再進(jìn)行定量分析，這不僅可以大大簡(jiǎn)化工作流程，還可提高該法的選擇性。該法用于實(shí)際樣品分析，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

U-3010型紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)自日本日立公司；pHS-3C型酸度計(jì)，購(gòu)自上海虹益儀器儀表有限公司；KQ-200VDE型超聲波清洗機(jī)，購(gòu)自昆山超聲儀器有限公司。

胭脂紅(Carmine，CAR，純度≥98%)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；酒石黃(Tartrazine，TAR，純度≥98%)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)自北京普析科技有限公司；堿性艷綠(Alkaline Brilliant Green，ALKG，純度99%)，購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；氨丁三醇(Tris，純度≥99.8%)，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HCl(分析純)，購(gòu)自重慶川東化工有限公司。水為自制超純水。

樣品為市售東鵬功能飲料(1#)和紅牛功能飲料(2#和3#)。

1.2 溶液制備

CAR、TAR標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液：1.00×10-3mol/L水溶液(CAR、TAR的質(zhì)量濃度分別為562.5 mg/L和534.4 mg/L)，操作溶液濃度均為1.00×10-4mol/L(用貯備液稀釋)，于冰箱4 ℃保存。Tris溶液為0.20 mol/L水溶液，HCl濃度為0.10 mol/L。Tris-HCl溶液：pH 3.0～9.8，通過酸度計(jì)測(cè)量Tris和HCl混合溶液的pH。ALKG溶液：1.00×10-3mol/L水溶液。

1.3 樣品的制備

準(zhǔn)確移取30.0 mL 1#～3#功能飲料，稱量(精確到±0.000 1 g)，于超聲儀45 ℃超聲20 min，取出，冷卻后用NH3·H2O調(diào)至近中性，60 ℃水浴加熱，加入1g已調(diào)成糊狀的聚酰胺粉末，攪拌、抽濾，用60 ℃ pH 4.0的水(檸檬酸調(diào)pH)洗3～5次(5 mL/次)，再用6∶4(體積比)的甲醇-甲酸混合物洗滌3～5次(5 mL/次)，最后用水洗至洗脫液為無色。再用7∶2∶1(體積比)的乙醇-氨水-水混合液解吸3～5次(5 mL/次)至色素完全解吸。合并解吸液，用乙酸中和至近中性，水浴70 ℃蒸發(fā)至近干，加適量水溶解并稀至5.0 mL，取定容溶液4.0 mL用水稀釋至25.0mL，得1#～3#待測(cè)液，儲(chǔ)于4 ℃冰箱中。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取適量1#～3#待測(cè)樣液于分光光度計(jì)上掃描(以水作參比)，根據(jù)吸收曲線的形狀及最大吸收波長(zhǎng)確定樣液中可能存在的色素。于10 mL比色管中，分別準(zhǔn)確加入1.00×10-4mol/L CAR和TAR標(biāo)準(zhǔn)溶液0～1.80 mL、1.00×10-3mol/L ALKG溶液2.00 mL及pH 3.80 Tris-HCl溶液1.00 mL，用水定容。10 min后，于分光光度計(jì)上掃描吸收光譜(以試劑空白作參比)，在521 nm測(cè)定CAR體系的吸光度，在426 nm測(cè)定TAR體系的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CAR、TAR及與ALKG反應(yīng)的吸收光譜特征

圖1中曲線1和2分別是胭脂紅和酒石黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收曲線，胭脂紅的最大吸收波長(zhǎng)為504 nm，酒石黃的最大吸收波長(zhǎng)為428 nm。曲線3～5分別是1.4節(jié)中制得的1#、2#和3#樣液的吸收曲線，根據(jù)吸收光譜定性分析依據(jù)，將樣液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收曲線形狀及最大吸收峰相比較，可以判斷1#～3#樣中只含CAR和TAR，不含其它色素。由此確定色素范圍，有針對(duì)性的制定CAR與TAR共存時(shí)的定量分析方案，大大簡(jiǎn)化了分析流程。

圖1 胭脂紅、酒石黃及1#～3#樣品的吸收光譜Fig.1 The absorption spectra of carmine,tartrazine,and 1#-3# samples1.CAR(6.04 mg/L);2.TAR(5.34 mg/L);3-5.1#-3# sample liquid;against water.

ALKG為三苯甲烷類堿性染料，可與酸性染料CAR、TAR以靜電引力相作用，生成離子締合物。圖2A表明，CAR和TAR與ALKG在pH 3.80條件下均可發(fā)生反應(yīng)。曲線1是CAR與ALKG反應(yīng)生成的締合物的吸收曲線，在可見光區(qū)除有2個(gè)較大的正吸收峰外，還有較小的正吸收和負(fù)吸收峰，最大正吸收峰位于521 nm(相對(duì)于ALKG藍(lán)移101 nm，ALKG的最大吸收峰位于622 nm)，次大正吸收峰位于660 nm；曲線2是TAR與ALKG反應(yīng)生成的締合物的吸收曲線，在可見光區(qū)有2個(gè)明顯的正吸收峰，最大正吸收峰位于426 nm(紫移196 nm)，次大吸收峰位于628 nm；兩體系的波移現(xiàn)象表明，CAR和TAR是可以與ALKG反應(yīng)生成新物質(zhì)二元離子締合物。

當(dāng)選擇在521 nm處測(cè)定CAR時(shí)，CAR-ALKG體系有大的吸光度，而TAR-ALKG體系的吸光度近于0，即共存TAR不干擾CAR的測(cè)定；當(dāng)選擇在426 nm處測(cè)定TAR，TAR-ALKG體系有大的吸光度，而CAR-ALKG體系的吸光度近于0，即共存CAR不干擾TAR的測(cè)定。從圖2可知，在其它吸收峰處測(cè)定CAR和TAR，兩締合物的吸收曲線重疊較大，相互間干擾大，不能分別測(cè)定共存的CAR和TAR。故選擇521 nm作為CAR的測(cè)定波長(zhǎng)，426 nm作為TAR的測(cè)定波長(zhǎng)，可實(shí)現(xiàn)共存色素CAR與TAR的分別測(cè)定。

由圖2B可知，在521 nm和426 nm處分別測(cè)定CAR與TAR，締合物均有好的線性關(guān)系和較高靈敏度，能用于定量分析共存色素CAR和TAR。吸收光譜特征見表1。

圖2 胭脂紅、酒石黃與堿性艷綠反應(yīng)的吸收光譜Fig.2 The absorption spectra of the reaction of carmine,tartrazine with alkaline brilliant greenA：1.CAR(6.04 mg/L)-ALKG(2.00×10-4 mol/L),pH 3.80,against reagent blank;2.TAR(5.34 mg/L)-ALKG(2.00×10-4 mol/L),pH 3.80,against reagent blank;3.ALKG(2.00×10-5 mol/L),pH 3.80,against water;B：1-5.TAR(1.07,3.21,5.34,7.48,9.62 mg/L),ALKG(2.00×10-4 mol/L);6-10.CAR(1.21,3.63,6.04,8.45,10.9 mg/L),ALKG(2.00×10-4 mol/L);pH 3.80,against reagent blank.

表1 胭脂紅、酒石黃的吸收光譜特征

2.2 溶液酸度

室溫下，考察了1.00 mL不同pH 的Tris-HCl(pH 3.0～9.8)溶液對(duì)1.00 mL CAR或TAR(1.00×10-4mol/L)與2.00 mL ALKG(1.00×10-3mol/L)反應(yīng)生成的離子締合物的吸光度的影響。結(jié)果表明，在pH 3.80的條件下，當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為521 nm時(shí)，可單獨(dú)測(cè)定CAR，TAR不干擾；當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為426 nm時(shí)，可單獨(dú)測(cè)定TAR，CAR不干擾(圖2A曲線1和2)，故選擇1.00 mL pH 3.80 Tris-HCl溶液作為兩體系的反應(yīng)介質(zhì)。

2.3 反應(yīng)時(shí)間

室溫下，考察了選定酸度下5 min～120 min內(nèi)不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)兩體系吸光度的影響。結(jié)果表明，CAR-ALKG體系與TAR-ALKG體系的反應(yīng)在10 min內(nèi)均可進(jìn)行完全；在10 min～60 min內(nèi)，兩體系的吸光度達(dá)最大且基本穩(wěn)定；60 min后，隨著時(shí)間的增加，兩體系吸光度均有降低趨勢(shì)。故測(cè)定時(shí)間選在10 min后的穩(wěn)定區(qū)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度移取1.00×10-4mol/L CAR、TAR標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mL，分別置于比色管中，加入2.00 mL ALKG(1.00×10-3mol/L)溶液和1.00 mL pH 3.80 Tris-HCl 溶液，用水定容至10 mL。參照1.4 項(xiàng)下的測(cè)定方法測(cè)定兩體系標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，CAR與TAR兩種體系的表觀摩爾吸光系數(shù)分別為1.26×104L/(mol·cm)、2.63×104L/(mol·cm)。CAR與TAR體系方法有很好的線性關(guān)系、較寬的線性范圍及較高靈敏度(表2)。

表2 胭脂紅及酒石黃的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)

2.4.2 方法的選擇性室溫下，考察了某些常見陰陽(yáng)離子、氨基酸、糖類及某些常見色素對(duì)測(cè)定6.04 mg/L CAR和5.34 mg/L TAR的影響，見表3。結(jié)果表明，當(dāng)相對(duì)誤差≤±5%時(shí)，常見陰、陽(yáng)離子及氨基酸、糖類的允許倍數(shù)均較大，而常見共存色素中，除日落黃、亮藍(lán)有較大允許倍數(shù)外，莧菜紅、誘惑紅及赤蘚紅允許倍數(shù)相對(duì)較小，但被測(cè)溶液的定性結(jié)果表明樣液中不含此3種紅色色素。

表3 共存物質(zhì)的影響

2.4.3 樣品測(cè)定、準(zhǔn)確度及精密度取1#～3#待測(cè)樣液各2.00 mL，加入2.00 mL ALKG溶液及1.00 mL pH 3.80 Tris-HCl溶液，用水定容至10 mL，在選定測(cè)定波長(zhǎng)及反應(yīng)時(shí)間下測(cè)定各溶液的吸光度(n=5)，并與GB 5009.35-2016法(HPLC法)結(jié)果比較，同時(shí)作加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=5)。結(jié)果見表4，可見，新方法測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)法相近，并有較高的準(zhǔn)確度和精密度，可用于共存CAR和TAR的定量分析。

表4 樣品分析結(jié)果及回收試驗(yàn)(n=5)

3 結(jié)論

在定性分析基礎(chǔ)上，針對(duì)樣品中存在的色素進(jìn)行定量分析，不僅可以大大減小分析工作量，而且還可提高光度分析方法的選擇性。以ALKG作探針的酸度控制吸收光譜法，不僅簡(jiǎn)便、快速，有較高靈敏度、較好選擇性及較寬線性范圍，而且成本低、儀器價(jià)廉易于普及；新方法檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法基本一致，準(zhǔn)確度和精密度符合定量分析要求。