李東倪，薛琳琳，鄭小雪，徐 彬，郭景茹*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江職業(yè)學院，黑龍江 哈爾濱 150111)

我國北方寒冷的氣候能夠降低動物的生產(chǎn)與繁殖性能，也會對動物的抗氧化、自身免疫等功能產(chǎn)生影響，這大大制約著我國北方地區(qū)畜牧業(yè)以及養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生了不可估量的經(jīng)濟損失[1-4]。肝臟是機體重要的消化腺，同時作為代謝穩(wěn)態(tài)的中樞器官，與各項生命活動都密切相關(guān),比如糖脂代謝、蛋白質(zhì)的合成與分解等，因此更易受到寒冷刺激的影響[5]。據(jù)報道，當機體持續(xù)處于低溫環(huán)境下，能夠誘發(fā)肝硬化、肝炎等多種肝臟疾病的發(fā)生[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是機體感受外界環(huán)境變化的細胞器，蛋白質(zhì)合成與分解主要依靠于ER[7-8]。ER同時也具有維持鈣離子穩(wěn)態(tài)、參與蛋白質(zhì)的修飾與加工等功能。當機體受到各種因素作用時，可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，從而影響蛋白的正確折疊，引起未折疊或錯誤折疊蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress，ERS)[9]。

ERS是發(fā)生在真核細胞中的一種具有保護作用的反應(yīng)機制。已有研究表明，ERS在肝臟損傷與肝臟疾病中能夠發(fā)揮重要作用，例如調(diào)控非酒精性脂肪肝、炎癥性急性肝功能衰竭等疾病中肝細胞的凋亡[10-11]。當發(fā)生ERS時，首先引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。UPR主要由3條交聯(lián)的信號通路組成：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)通路、肌醇需求酶1(IRE1)通路、轉(zhuǎn)錄活化因子6(ATF6)通路[12]。一定程度的ERS可啟動細胞保護的效應(yīng)機制，減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷并重新對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)進行維持[13]。若ER持續(xù)處在應(yīng)激狀態(tài)，UPR繼而通過上述3條信號通路激活下游的促凋亡信號分子，最終可引起內(nèi)源性凋亡[13]。肝細胞的各項生命活動都是以線粒體功能為基礎(chǔ)的，線粒體參與肝細胞內(nèi)跨膜運輸、細胞信號轉(zhuǎn)導和凋亡等過程[14]。在線粒體介導的凋亡中，膜電位的下降是內(nèi)源性凋亡的早期標志[9]。近年來的研究表明，位于線粒體內(nèi)外膜之間的細胞色素C(Cyt C)是線粒體凋亡信號傳導過程中的關(guān)鍵蛋白[15]，Cyt C被釋放到細胞質(zhì)是引起細胞凋亡的重要步驟。Cyt C結(jié)合細胞凋亡活化因子Apaf-1和Pro-Caspase-9，啟動級聯(lián)反應(yīng),激活下游的Caspase家族蛋白[16]，使凋亡進行下去，繼而激活由線粒體所介導的內(nèi)源性凋亡[17]。此外，也有研究證實Bcl-2家族也參與調(diào)控細胞的凋亡過程[18]。促凋亡蛋白廣泛分布在細胞漿內(nèi)，當促凋亡蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體時能夠激活線粒體凋亡通路；抗凋亡蛋白定位在線粒體外膜上，參與調(diào)控Cyt C的釋放[18-19]。據(jù)此，本試驗旨在探討冷暴露對小鼠肝臟ERS與內(nèi)源性凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及主要試劑5周齡C57BL/6型雄性小鼠，體質(zhì)量23～25 g，購自北京維通利華Charles River公司；GRP78、CHOP、XBP1、Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3、β-actin一抗、HRP標記山羊抗兔二抗、HRP標記山羊抗小鼠二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、組織線粒體分離試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒、顯影發(fā)光液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器酶標儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；電泳儀(Bio-Rad，美國)；ChemiDoc +化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；CEA540Ge型人工智能氣候室(濟南旭邦電子科技有限公司)；MM400型混合型球磨儀(Retsch,德國)；Micro17微型離心機(Thermo Scientific)。

1.3 試驗動物分組及處理C57BL/6型雄性小鼠在人工智能氣候室內(nèi)預(yù)飼7 d，飼養(yǎng)條件如下：溫度為(24±2)℃，濕度為40%，光照晝夜12 h交替。將試驗小鼠隨機分為室溫對照組和冷暴露組，室溫對照組小鼠刺激刺溫度為(24±2)℃，濕度為40%。冷暴露組的刺激條件如下:溫度為(4±1)℃，濕度為40%，每天冷暴露 3 h，連續(xù)刺激3周。

1.4 樣品采集小鼠腹腔注射戊巴比妥進行麻醉，頸椎脫臼處死，分離肝臟組織并采集樣品，樣品用于制備肝臟組織HE染色切片、Masson染色切片、透射電鏡切片和檢測肝臟組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)源性凋亡相關(guān)途徑蛋白表達變化。

1.5 肝臟組織病理學檢測肝臟樣品經(jīng)過4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明化處理、石蠟浸蠟與包埋制作成連續(xù)切片；切片經(jīng)過二甲苯與乙醇處理后，制成HE與Masson染色切片，最后常規(guī)脫水、透明、封片。(1)HE染色：經(jīng)上述方法處理后，置于蘇木素染液中染色5 min，用水沖洗后置于乙醇中分化10 min，經(jīng)氨水返藍后，置于伊紅染液中染色2～3 min，染色后的切片經(jīng)不同梯度酒精脫水、透明、中性樹脂封片，然后通過光學顯微鏡觀察肝臟組織病理學形態(tài)變化。(2)Masson染色：切片脫蠟、水洗，蘇木精液染色6 min，乙醇分化；切片經(jīng)麗春紅染色5 min后取出，經(jīng)磷鉬酸水溶液分化3 min，苯胺藍染色2 min，冰醋酸分化1 min，染色后的切片經(jīng)酒精脫水、封片，然后顯微鏡下觀察肝臟纖維組織變性情況。

1.6 肝臟組織透射電鏡觀察肝臟樣品經(jīng)戊二醛固定、磷酸漂洗液漂洗、乙醇脫水、包埋固化處理后制作成切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，然后通過透射電鏡觀察肝臟細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.7 Western blot檢測肝臟組織相關(guān)蛋白的表達取新鮮肝臟組織樣品并剪碎后放入1.5 mL離心管中，提取組織線粒體蛋白，根據(jù)分離試劑盒說明書加入含PMSF的線粒體分離試劑A(線粒體分離試劑A與PMSF的比例為10∶1)；樣品經(jīng)混合球磨儀勻漿至完全裂解后，4℃、600×g離心5 min；提取管中上清液，4℃、1 000×g離心10 min；保留沉淀部分，沉淀即為分離得到的線粒體；管中加入蛋白上樣緩沖液，煮沸蛋白使其變性，隨后將蛋白樣品加入到10%、12%聚丙烯胺凝膠中進行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，5%蛋白免疫印跡封閉液室溫封閉1 h，洗膜后加入按比例稀釋的一抗，置于4℃下孵育過夜；次日，洗膜后加入按比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h，按說明配制ECL顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)(Image Lab)對蛋白條帶進行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計分析本試驗使用Graphpad Prism 7.0軟件(Graphpad software，San Diego，CA，USA)計算各組的試驗數(shù)據(jù)，以P<0.05為具有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟組織病理學變化HE染色結(jié)果顯示，室溫對照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞形態(tài)正常，排列整齊，未見明顯腫脹變性；冷暴露組小鼠肝臟發(fā)生輕微水樣變性，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見炎性細胞浸潤(圖1)。Masson染色結(jié)果顯示，室溫對照組小鼠肝臟細胞間質(zhì)未見明顯藍染；冷暴露組小鼠肝組織可見輕微的膠原纖維沉積(圖1)。

圖1 室溫對照組和冷暴露組小鼠肝臟組織學形態(tài)(10×40)

2.2 小鼠肝臟細胞透射電鏡觀察結(jié)果分析透射電鏡結(jié)果見圖2，紅色箭頭表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，黑色箭頭表示線粒體)，冷暴露組小鼠肝臟細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞，線粒體發(fā)生輕微損傷。

圖2 透射電鏡觀察室溫對照組和冷暴露組小鼠肝細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體形態(tài)

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達水平Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，冷暴露組小鼠肝臟組織內(nèi)GRP78、XBP1、CHOP蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)(圖3)。

A.對照組和冷暴露組小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達量的Western blot檢測結(jié)果；B～D.分別為GRP78、XBP1、CHOP與內(nèi)參β-actin比值分析結(jié)果。*P<0.05表示有顯著性差異

2.4 線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達水平通過Western blot檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyt C的表達水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，冷暴露組小鼠肝臟組織內(nèi)Cyt C蛋白表達水平顯著增加(P<0.01)；Bax/Bcl-2、Cleaved-Caspase-3/Pro-Caspase-3表達水平顯著升高(P<0.01)(圖4)。

A.對照組和冷暴露組小鼠肝臟線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達量的Western blot檢測結(jié)果；B～D.分別為Cyt C、Bax/Bcl-2、活化的Caspase-3/Caspase-3前體的表達變化。**P<0.01表示有極顯著性差異

3 討論

在畜牧業(yè)發(fā)展過程中，寒冷會引起機體免疫功能下降，影響機體生產(chǎn)、繁殖性能，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，是阻礙我國北方地區(qū)畜牧經(jīng)濟健康平穩(wěn)發(fā)展的直接因素之一[1]。肝臟作為機體的重要器官，與動物機體各項生命活動都密切相關(guān)，比如蛋白質(zhì)的合成與分解。除此之外，肝臟也具有吞噬和免疫功能，可以抵御外界有害物質(zhì)侵入機體[6]。冷暴露也容易影響肝臟的正常功能，加速肝糖原分解、導致糖異生[2]。在本試驗中，我們通過病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)冷暴露組小鼠細胞發(fā)生了形態(tài)學變化，肝臟受到損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體也受到破壞。有研究指出，肝臟中存在豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當肝臟長期處于外界不良刺激下，會導致肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂，極易發(fā)生ERS；若肝臟長期處于ERS，又可進一步發(fā)生ERS介導的細胞凋亡途徑[19-20]。

GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，當ERS發(fā)生時，與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子ATF6發(fā)生解離，ATF6隨后通過囊泡的方式移動至高爾基體，并被2個位點蛋白酶分割，從而激活轉(zhuǎn)錄因子X盒結(jié)合蛋白1(X box-binding protein 1，XBP1)以及下游促凋亡信號分子C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)，以達到促進蛋白質(zhì)進行正確折疊的目的[8]。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，冷暴露組小鼠肝臟組織中ERS關(guān)鍵蛋白GRP78、XBP1、CHOP表達顯著上調(diào)，說明冷暴露下機體肝臟組織發(fā)生了ERS。

當ER持續(xù)處于應(yīng)激狀態(tài)時，發(fā)生ERS的關(guān)鍵蛋白CHOP過量表達能夠促進機體細胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡[5]。此外，常青等[21]的研究表明，位于線粒體膜間隙的Cyt C在正常情況下不能透過線粒體外膜進入胞質(zhì)。當細胞處于應(yīng)激狀態(tài)時，能夠改變線粒體膜完整性，引起膜電位降低，隨后Cyt C進入細胞質(zhì)[22]，在細胞質(zhì)中與細胞凋亡活化因子Apaf-1以及Pro-Caspase-9結(jié)合，激活Pro-Caspase-9產(chǎn)生有活性的Caspase-9，再活化下游Caspase-3等蛋白，從而激活線粒體介導的內(nèi)源性凋亡途徑[23-24]。Bcl-2家族也參與線粒體凋亡的調(diào)控過程[25]，當該家族中的促凋亡蛋白移動到線粒體時，線粒體通透性發(fā)生改變、膜電位降低，Cyt C進入胞質(zhì)，從而激活線粒體凋亡途徑[26-27]。凋亡蛋白表達情況與凋亡程度密切相關(guān)。為進一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否激活了肝細胞的凋亡途徑，我們檢測了肝臟組織線粒體蛋白表達情況，結(jié)果顯示Bax與Bcl-2的比值顯著升高，提示冷暴露進一步導致肝細胞發(fā)生凋亡；活化的Caspase-3與Caspase-3前體比值顯著升高，Cyt C蛋白的表達水平也顯著提升，提示機體肝臟組織發(fā)生了內(nèi)源性線粒體介導的凋亡。

綜上，冷暴露能夠誘導小鼠肝臟發(fā)生ERS，導致線粒體凋亡的發(fā)生。因此線粒體介導的凋亡途徑在ERS中發(fā)揮重要作用，這提示我們未來可以嘗試以線粒體為著手點，減輕肝臟ERS，預(yù)防肝臟損傷。