徐盟龍,阮靜嫻,王棟涵,王平利,王林青,夏 璐*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.鄭州師范學(xué)院，河南 鄭州 450044)

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)引起的以母豬繁殖障礙為主要特征的病毒性傳染病，臨床表現(xiàn)為初產(chǎn)母豬不孕、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及帶病弱胎，同時還可以引起仔豬皮炎、腹瀉和呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]。MAYR等[3]在1968年首次報道該病，至今已在全世界廣泛傳播與流行，制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。PPV是一種小的、無包膜的DNA病毒，基因組長約5 kb，包含2個主要的開放閱讀框，5′端編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2和VP3)，3′端編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2和NS3)[4-6]。其中，NS1是最重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與PPV的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和細(xì)胞毒性[7]。

核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是調(diào)節(jié)機體先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要因子[8]。靜息狀態(tài)下，NF-κB的二聚體(p50和p65亞基)與抑制蛋白(inhibitory protein κB,IκB)結(jié)合成三聚體，以非活性復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞質(zhì)[9]。細(xì)胞受到刺激時，IκB激酶(IκB kinase,IKK)復(fù)合物磷酸化IκB蛋白內(nèi)的特定絲氨酸，降解IκB蛋白，從而導(dǎo)致p65磷酸化，從二聚體中釋放出來，激活參與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[10]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一種典型的模式識別受體，可以通過識別病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達[11]。例如，TLR2和TLR4可以識別革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的成分，如脂多糖和脂蛋白[12]。除此之外，病毒蛋白也被報道作為TLR的激動劑，麻疹病毒的血凝素蛋白、丙型肝炎病毒的核心蛋白和輪狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白等都可以通過TLR2誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達[13-15]。研究這些分子機制可以更好地理解宿主應(yīng)對病毒感染的防御機制。

我們前期研究結(jié)果表明，PPV體外感染細(xì)胞可以激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)IL-6的表達[16]。本試驗應(yīng)用實時熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)分別研究了PPV NS1對PK-15細(xì)胞炎性因子IL-6/TNF-α的表達和NF-κB信號通路激活的影響，為了解PPV與宿主細(xì)胞相互作用的機制奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒PK-15細(xì)胞、PPV李氏毒株和PPV NS1的重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS1均由河南省動物性食品安全重點實驗室保存[16-17]。

1.2 主要試劑胎牛血清、MEM培養(yǎng)基、opti-MEM減血清培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；RIPA裂解液購自武漢BOSTER公司；TLR2激動劑Pam3CSK4購自美國InvivoGen公司；TLR2抑制劑購自美國MCE公司；NF-κB抑制劑BAY 11-7082購自北京Beyotime公司；TRIzol、HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京Vazyme公司；HA Tag Monoclonal Antibody購自美國Invitrogen公司，IκBα(L35A5)Mouse mAb(Amino-terminal Antigen)、NF-κB p65(L8F6)Mouse mAb、Phospho-NF-κB p65(Ser536)(93H1)Rabbit mAb抗體購自美國CST公司；Beta Actin Monoclonal Antibody、TLR2 mouse mAb、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自武漢Proteintech公司。

1.3 主要儀器低溫高速離心機5430R購自德國Eppendorf公司；PCR擴增儀Veriti購自美國Applied Biosystems公司；熒光定量PCR儀CFX 96、蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)印槽Trans-Blot Turbo購自美國Bio-Rad公司；超靈敏多功能成像儀Amersham Imager 800購自美國GE公司。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞使用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，細(xì)胞長滿時傳至12孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至80%時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染液A：150 μL無血清的opti-MEM加入1 μg空載或目標(biāo)質(zhì)粒輕柔混勻，室溫靜置5 min；轉(zhuǎn)染液B：150 μL無血清的opti-MEM加入3 μL Lipofectamine 2000輕柔混勻，室溫靜置5 min。完成后將A液緩慢加入B液中混勻，室溫靜置25 min。12孔板中的PK-15細(xì)胞用高壓滅菌后的D-Hank's洗滌2次，更換為無血清的opti-MEM培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合液加入細(xì)胞孔中，轉(zhuǎn)染6 h后細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含2% FBS的培養(yǎng)基。

1.5 蛋白免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24 h后用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗PK-15細(xì)胞，將細(xì)胞收集至1.5 mL EP管中，4℃、1 000 r/min離心10 min，棄上清液。細(xì)胞沉淀使用含1% PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，作用30 min，4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。抽取10 μL細(xì)胞總蛋白加入2 μL 6 × SDS Protein Buffer，100℃變性5 min。變性后的蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜(NC膜)，5%脫脂乳封閉1 h，分別加入一抗HA(1∶5 000)、TLR2(1∶200)、p-p65(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、β-actin(1∶4 000)，4℃孵育過夜。TBST洗5次，每次10 min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h，TBST洗5次，每次10 min。最后使用ECL發(fā)光顯色液顯色，通過成像儀Amersham Imager 800曝光、拍照。

1.6 實時熒光定量PCR檢測PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24 h后，收集細(xì)胞至1.5 mL EP管中，使用TRIzol法提取總RNA，并參照HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)。RT-qPCR反應(yīng)體系：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 2 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，45個循環(huán)。設(shè)置陰性對照，確認(rèn)引物熔解曲線和擴增曲線。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct計算基因表達的相對水平。所有的引物均由河南尚亞生物技術(shù)有限公司合成。引物信息見表1。

1.7 PPV NS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后炎癥細(xì)胞因子的檢測將1，2，3 μg的重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS1分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，同時設(shè)置陰性對照和PPV感染陽性對照。24 h后提取細(xì)胞總蛋白和總RNA，通過Western blot檢測HA的表達來顯示NS1的表達，通過RT-qPCR檢測IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平。

1.8 NF-κB抑制劑處理后炎癥細(xì)胞因子的檢測使用無血清的MEM培養(yǎng)基將NF-κB抑制劑BAY 11-7082稀釋至5 μmol/L，使用D-Hank's洗滌PK-15細(xì)胞2次，每孔細(xì)胞加入200 μL 5 μmol/L 的NF-κB抑制劑BAY 11-7082，37℃預(yù)處理30 min[18]。處理結(jié)束后每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染2 μg重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS1，同時設(shè)置陰性對照和PPV感染陽性對照組。轉(zhuǎn)染24 h后提取細(xì)胞總RNA，通過RT-qPCR檢測IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平。

1.9 PPV NS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后NF-κB通路蛋白的檢測將2 μg的重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS1轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含2% FBS的培養(yǎng)基，同時設(shè)置陰性對照和PPV感染陽性對照。24 h后分別提取細(xì)胞總蛋白，通過Western blot檢測IκBα、p65和p-p65蛋白的表達水平。

1.10 TLR2激動劑和抑制劑處理后NF-κB通路蛋白和炎癥細(xì)胞因子的檢測使用無血清的MEM培養(yǎng)基將TLR2激動劑Pam3CSK4和抑制劑C29分別稀釋至1 mg/L和50 μmol/L，分別使用200 μL的TLR2激動劑或抑制劑在37℃孵育細(xì)胞2 h。孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS1，轉(zhuǎn)染6 h 后，細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含2%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中維持相應(yīng)TLR2激動劑和抑制劑的濃度。同時設(shè)置陰性對照和PPV感染陽性對照。24 h后分別提取細(xì)胞總蛋白和總RNA，通過Western blot檢測IκBα、p65和磷酸化p65蛋白的表達水平，通過RT-qPCR檢測IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平。

1.11 統(tǒng)計分析應(yīng)用 Image J 軟件對Western blot的條帶進行灰度分析；利用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖和統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗或單因素方差進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 PPV NS1激活炎癥反應(yīng)如圖所示，轉(zhuǎn)染2 μg重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS1時NS1的表達量顯著升高(P<0.01)，轉(zhuǎn)染3 μg重組質(zhì)粒時NS1的表達量與2 μg重組質(zhì)粒差異不大(圖1A)，所以后續(xù)試驗均轉(zhuǎn)染2 μg的pCAGGS-HA-NS1進行研究。并且不同質(zhì)量的pCAGGS-HA-NS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后均顯著上調(diào)了炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)，且隨著pCAGGS-HA-NS1轉(zhuǎn)染質(zhì)量的增加，炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平也相應(yīng)的增加(圖1B,C)。結(jié)果表明,PPV NS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以激活炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴性。

A.不同質(zhì)量pCAGGS-HA-NS1轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后的表達量；B.不同質(zhì)量pCAGGS-HA-NS1轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；C.不同質(zhì)量pCAGGS-HA-NS1轉(zhuǎn)錄PK-15細(xì)胞后NS1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；D.不同質(zhì)量pCAGGS-HA-NS1轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平。*表示0.01

2.2 PPV NS1通過激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)如圖2所示，與只轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-NS1的細(xì)胞相比，使用NF-κB抑制劑BAY 11-7082處理細(xì)胞后再轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-NS1，炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯受到了抑制(P<0.01)。結(jié)果表明，NF-κB激活的經(jīng)典途徑對隨后IL-6的上調(diào)至關(guān)重要。

A.NF-κB抑制劑BAY 11-7082對IL-6 mRNA表達的影響；B.NF-κB抑制劑BAY 11-7082對TNF-α mRNA表達的影響。**表示P<0.01

2.3 PPV NS1誘導(dǎo)p65的磷酸化和IκBα的降解如圖3所示，與空白細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染組相比，pCAGGS-HA-NS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，顯著下調(diào)IκBα的表達水平，顯著上調(diào)p65的磷酸化水平(0.01

A.pCAGGS-HA-NS1誘導(dǎo)IκBα的降解；B.pCAGGS-HA-NS1誘導(dǎo)p65的磷酸化。*表示0.01

2.4 PPV NS1激活NF-κB通路依賴于TLR2如圖4所示，與空白細(xì)胞組和空載體轉(zhuǎn)染組對比，pCAGGS-HA-NS1顯著上調(diào)了TLR2的表達水平。并且，TLR2激動劑顯著增強了PPV NS1促進IκBα降解和誘導(dǎo)p65磷酸化的能力，而TLR2抑制劑處理后，PPV NS1促進IκBα降解和誘導(dǎo)p65磷酸化的能力受到抑制。結(jié)果表明，TLR2參與了PPV NS1介導(dǎo)的NF-κB通路的激活。

A.pCAGGS-HA-NS1誘導(dǎo)TLR2表達；B.pCAGGS-HA-NS1通過TLR2誘導(dǎo)IκBα降解；C.pCAGGS-HA-NS1通過TLR2誘導(dǎo)p65磷酸化。*表示0.01

2.5 PPV NS1介導(dǎo)炎癥反應(yīng)依賴于TLR2如圖5所示，當(dāng)使用TLR2的激動劑處理細(xì)胞后，再轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-NS1，相比于只轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-NS1的細(xì)胞，IL-6和TNF-α mRNA的表達量更高(P<0.01)。而使用TLR2的抑制劑后再轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-NS1，相比于只轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-NS1的細(xì)胞，IL-6和TNF-α mRNA的表達水平顯著受到了抑制(P<0.01)。結(jié)果表明，TLR2參與了PPV NS1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

A.TLR2激動劑Pam3CSK4對IL-6 mRNA表達的影響；B.TLR2激動劑Pam3CSK4對TNF-α mRNA表達的影響；C.TLR2抑制劑C29對IL-6 mRNA表達的影響；D.TLR2抑制劑C29對TNF-α mRNA表達的影響。**表示P<0.01

3 討論

PPV是導(dǎo)致母豬繁殖障礙的主要原因之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失[19]。我們之前的研究表明，PPV可以在體外激活NF-κB信號通路并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[16]。NS1在PPV基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中起重要作用，但NS1在PPV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用尚不清楚，因此本研究旨在探討PPV NS1對NF-κB信號通路的影響。

IL-6和TNF-α是與宿主先天免疫反應(yīng)相關(guān)的重要促炎細(xì)胞因子，具有清除病原微生物的作用。我們前期的研究表明，PPV感染可誘導(dǎo)IL-6的表達。因此，為了確定PPV NS1是否也可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達，我們用RT-qRCR檢測了IL-6和TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。本試驗結(jié)果表明，PPV NS1重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染增強了IL-6和TNF-α的表達，且與PPV NS1重組質(zhì)粒的質(zhì)量呈劑量依賴關(guān)系。為了進一步研究NF-κB在誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子表達中的作用，本試驗使用了NF-κB抑制劑BAY 11-7082。BAY 11-7082對IL-6和TNF-α表達的抑制作用表明，NF-κB通路的激活是促炎性細(xì)胞因子表達上調(diào)的關(guān)鍵。

當(dāng)受到外界刺激時，NF-κB信號通路會迅速被激活，并且可以影響宿主細(xì)胞生命活動中的關(guān)鍵步驟，這使得NF-κB通路成為病毒入侵時一個有吸引力的目標(biāo)[20]。而NF-κB通路的激活主要依賴于IκB蛋白的降解，使p65釋放并磷酸化[21]。p65是NF-κB信號通路的主要亞單位，其磷酸化狀態(tài)影響其轉(zhuǎn)錄活性[22-23]。據(jù)報道，PPV感染可以激活NF-κB信號通路，并誘導(dǎo)下游炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄[16,24]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，人細(xì)小病毒B19的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以刺激TLRs的表達和先天免疫反應(yīng)[25]。鑒于非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在PPV感染中的重要作用，我們在本研究中研究了非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的作用機制。WB分析表明，PPV NS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，IκBα表達水平顯著下降，且p65的磷酸化顯著增加。

眾所周知，TLRs在宿主對病毒感染的先天免疫反應(yīng)中起著重要作用。TLRs可以識別病毒成分并啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括觸發(fā)NF-κB信號通路的激活。據(jù)報道，細(xì)小病毒Kilham大鼠病毒可以通過TLR信號通路激活NF-κB并進一步誘導(dǎo)IL-12β的產(chǎn)生[26]。為了確定TLR信號通路的激活是否與PPV NS1誘導(dǎo)的NF-κB激活有關(guān)，我們通過RT-qPCR和WB檢測了NS1轉(zhuǎn)染后TLR2的表達，結(jié)果表明PPV NS1可以上調(diào)TLR2的表達；而當(dāng)TLR2被激動或抑制后，TLR2、NF-κB和促炎性細(xì)胞因子的表達均受到促進或抑制。因此，我們的數(shù)據(jù)清楚地表明，PPV NS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以通過TLR2激活NF-κB信號通路，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達。

綜上，本試驗證明PPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1可以通過TLR2激活NF-κB信號通路來誘導(dǎo)IL-6和TNF-α的表達，為揭示PPV調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答的潛在機制，以及闡明PPV的發(fā)病機制提供了基礎(chǔ)。但是，PPV非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1被TLRs，特別是TLR2識別的機制中的功能區(qū)域所識別，以及促進宿主細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)，還需要進一步的研究。