蔣鳳嬌,程伊洛，汪 最，張文婷，盧 琴，郭云清，羅青平，邵華斌，張騰飛*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的一種急性全身性疾病，多發(fā)于2～3周齡內(nèi)的雛雞，成年雞亦可被感染，可垂直傳播和水平傳播，病死率極高[1]，難以根治，嚴(yán)重影響著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在我國，種雞凈化是防制雞白痢的關(guān)鍵手段，而凈化的核心在于準(zhǔn)確檢出感染的個(gè)體[2]，我國《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020)》中明確指出沙門菌是種雞場(chǎng)需要凈化的種源性疫病[3]。

現(xiàn)有的雞白痢檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定，以及以免疫學(xué)和分子生物學(xué)等為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，如平板凝集、PCR等方法[4-5]。其中，最常用的是全血或血清平板凝集試驗(yàn)，該方法簡單方便，但靈敏度偏低，不穩(wěn)定，容易引起非特異性反應(yīng)[6]。因此，亟待開發(fā)一種特異性強(qiáng)、靈敏性高的雞白痢抗體檢測(cè)方法。

沙門菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，主要包括菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原以及莢膜(Vi)抗原[7]。沙門菌血清型分類的主要依據(jù)是細(xì)菌表面O抗原的差異[8]。根據(jù)O抗原的不同，至少可將沙門菌分為A群、B群、C群、D群等37個(gè)血清群[9]，其中D群沙門菌主要包括了雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌等。感染家禽的主要為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌等。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)位于革蘭陰性菌的細(xì)胞壁外膜，主要由O抗原、核心多糖和類脂A三部分組成。LPS的O抗原是抗原決定因子，具有高度特異性，可用于區(qū)分不同血清型的細(xì)菌[10]。OIE認(rèn)為用LPS作為包被抗原的間接ELISA是測(cè)定雞群中雞白痢、雞傷寒沙門菌感染最特異的方法[11]。目前,國內(nèi)并沒有獲批的檢測(cè)雞白痢抗體的商品化ELISA檢測(cè)試劑盒。因此，本研究以雞白痢沙門菌的LPS作為包被抗原，建立D群沙門菌抗體間接ELISA檢測(cè)方法，旨在為雞白痢沙門菌等D群沙門菌感染的抗體檢測(cè)提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌種及血清雞白痢沙門菌TC3株為本實(shí)驗(yàn)室鑒定篩選并保存[12]。雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、都柏林沙門菌、鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、鴨沙門菌、大腸桿菌等菌株的陽性血清和陰性血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備。雞白痢陽性對(duì)照血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。467份臨床血清采集自湖北某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑及儀器DNaseⅠ、RNase A、Proteinase K、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、快速銀染試劑盒、Bradford蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雞白痢雞傷寒多價(jià)染色平板凝集試驗(yàn)抗原購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；D群沙門菌(group D)抗體檢測(cè)試劑盒購自荷蘭BioChek公司；HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ELISA顯色液、終止液、明膠、胎牛血清、封閉用馬血清和封閉用兔血清購自索萊寶公司；BSA購自Sigma公司；脫脂牛奶購自BD公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純級(jí)。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自美國Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 包被抗原的制備采用改良的熱酚水法提取[13]。將雞白痢沙門菌TC3株增菌并收集菌體，反復(fù)凍融3次后超聲破碎。加入等體積95%苯酚溶液，68℃水浴加熱并劇烈攪拌30 min。冷卻后離心，收集上層水相，下層酚相按上述方法重復(fù)抽提2次，合并水相并轉(zhuǎn)移到透析袋中，蒸餾水透析48 h，直至無苯酚氣味殘留。加入終質(zhì)量濃度為50 mg/L的DNaseⅠ和RNase A，37℃作用4 h后，加入終質(zhì)量濃度為100 mg/L的Proteinase K，65℃作用2 h，沸水浴10 min。再次苯酚抽提，去除核酸酶和蛋白酶。乙醇沉淀后，干燥，經(jīng)SDS-PAGE及銀染鑒定正確后，-20℃保存。

1.4 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的建立

1.4.2最佳封閉條件的確定 按照1.4.1得到的最佳包被條件包被抗原，分別用1%BSA、1%明膠、5%脫脂乳、10%胎牛血清、10%馬血清、10%兔血清于37℃封閉2 h，其余步驟按照1.4.1的間接ELISA試驗(yàn)步驟進(jìn)行，篩選出最佳封閉劑后，用該封閉劑分別封閉60，90，120，150 min，測(cè)定各孔的D630 nm值，比較P/N，確定最佳封閉時(shí)間。

1.4.3血清最佳作用時(shí)間的選擇 按照1.4.1和1.4.2得到的最佳包被條件包被抗原，最佳封閉條件進(jìn)行封閉，血清分別于37℃孵育30，45，60，90，120，150 min，其余步驟按照1.4.1的間接ELISA試驗(yàn)步驟進(jìn)行，測(cè)定各孔的D630 nm值，比較P/N，確定血清最佳作用時(shí)間。

1.4.4酶標(biāo)二抗最適工作質(zhì)量濃度和時(shí)間的選擇 按照1.4.1～1.4.3得到的最佳包被條件包被抗原，最佳封閉條件進(jìn)行封閉，血清最佳作用時(shí)間進(jìn)行孵育，依次將酶標(biāo)二抗稀釋1 000～10 000倍，分別作用20，30，45，60，75，90 min，測(cè)定各孔的D630 nm值，比較P/N，確定酶標(biāo)二抗最適工作質(zhì)量濃度和作用時(shí)間。

1.4.5底物最適顯色條件 按照1.4.1～1.4.4得到的最佳包被條件、最佳封閉條件，最適一抗、二抗作用濃度及時(shí)間，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，分別顯色5，8，10，12，15，17 min，測(cè)定各孔的D630 nm值，比較P/N，確定最適顯色時(shí)間。

1.4.6間接ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 用建立的間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)已知的弱陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，并將陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化稀釋至合適濃度，參考D630 nm值，按S/P公式建立合適的樣品判定標(biāo)準(zhǔn)[14]，并用平板凝集試驗(yàn)和D群沙門菌抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。S/P=(待檢樣本平均值-陰性對(duì)照平均值)/(陽性對(duì)照平均值-陰性對(duì)照平均值)。

1.5 方法的驗(yàn)證

1.5.1特異性試驗(yàn) 用建立的間接ELISA檢測(cè)方法，分別對(duì)雞白痢沙門菌(2株標(biāo)準(zhǔn)型、3株變異型、10株臨床分離型)、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、都柏林沙門菌、鴨沙門菌、豬霍亂沙門菌、甲型副傷寒沙門菌和大腸桿菌等菌株的陽性血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，并以雞白痢陽性血清作陽性對(duì)照，以SPF雞血清作陰性對(duì)照，測(cè)D630 nm值，根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證特異性。

曾經(jīng)的芳華人影俱銷，寶玉得了一場(chǎng)不大不小的病，總是持續(xù)高燒不退，先是被疑似非典，以后又差點(diǎn)當(dāng)成禽流感。寶釵寸步不離湯水伺候得妥帖。病愈后的寶玉，涕淚交加，懺悔起和黛玉的陳倉暗渡。寶釵并不見怪，反而道：“也是天緣注定吧。林妹妹總要找個(gè)歸宿才好……”一席話說得寶玉自愧不如，寶釵又勸：“你這樣放不下，反而傷了身子，她也覺著不好……”寶玉不解，寶釵道：“我看，你索性寫本書，對(duì)過去權(quán)作告別交代……也好讓林妹妹輕輕松松嫁人……”寶釵這樣心無罅隙，自己再推脫，就是心里不坦蕩了。

1.5.2敏感性試驗(yàn) 將雞白痢陽性血清依次按1∶100～1∶51 200倍比稀釋，用建立好的間接ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。同時(shí)將血清倍比稀釋并用雞白痢雞傷寒多價(jià)染色平板凝集試驗(yàn)抗原進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3重復(fù)性試驗(yàn) 使用不同批次提取的LPS作為包被抗原，對(duì)隨機(jī)選取的3份雞白痢陽性血清和3份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)使用同一批次提取的LPS作為包被抗原包被不同的酶標(biāo)板，對(duì)上述6份血清進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)D630 nm值，計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.5.4符合率試驗(yàn) 分別用建立的間接ELISA檢測(cè)方法和group D抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)283份臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合率比較。

1.6 臨床初步應(yīng)用分別用建立的間接ELISA檢測(cè)方法和平板凝集對(duì)湖北某種雞場(chǎng)的184份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析收集試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS軟件進(jìn)行分析。符合率試驗(yàn)中，通過單因素方差分析進(jìn)行組間比較。檢出率試驗(yàn)中，通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行2組之間的比較。檢驗(yàn)過程中，P<0.05有統(tǒng)計(jì)意義，其中P<0.05，代表差異顯著；P<0.01，代表差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 LPS的提取收集的菌體濕重為6.5 g，提純的LPS為95.1 mg(產(chǎn)率1.463%)。稱取20 mg LPS溶于2 mL超純水中，測(cè)得蛋白含量為0.099 5 g/L。采用苯酚-硫酸法測(cè)得多糖含量為8.940 g/L。對(duì)提取的LPS進(jìn)行SDS-PAGE及銀染，LPS呈現(xiàn)階梯結(jié)構(gòu)(圖1)，證明LPS提取成功且結(jié)構(gòu)完整。

M.蛋白Marker；1,2.純化的LPS

2.2 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的建立反應(yīng)條件優(yōu)化的結(jié)果：抗原包被質(zhì)量濃度為2.233 mg/L，最適封閉條件為5%脫脂乳封閉60 min，血清最佳稀釋度為1∶200，血清最佳作用時(shí)間為60 min,酶標(biāo)二抗最適工作質(zhì)量濃度為1∶8 000，作用時(shí)間為60 min，顯色時(shí)間為15 min。陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)S/P值≥0.5時(shí)，判斷抗體陽性；當(dāng)S/P值<0.5時(shí)，判斷抗體陰性。以優(yōu)化的反應(yīng)條件為參數(shù)，建立雞白痢抗體間接ELISA檢測(cè)方法。

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1特異性試驗(yàn) 根據(jù)間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。結(jié)果顯示，D群沙門菌(包括雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、都柏林沙門菌)對(duì)應(yīng)的陽性血清抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽性，鼠傷寒沙門菌(B群)、豬霍亂沙門菌(C1群)、鴨沙門菌(E1群)、大腸桿菌(O1)抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，但是甲型副傷寒沙門菌(A群)抗體檢測(cè)結(jié)果為弱陽性(表1)。

表1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2敏感性試驗(yàn) 將倍比稀釋的雞白痢陽性血清用建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明當(dāng)血清1∶3 200倍稀釋后仍為陽性(圖2)。平板凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，血清最高稀釋8倍后為陽性，16倍稀釋后為陰性。結(jié)果表明，建立的間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)敏感性是平板凝集的400倍，具有較高的檢測(cè)敏感性。

圖2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 將同一批次和不同批次提取的LPS分別包被酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示建立的間接ELISA批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)(表2)和批間重復(fù)變異系數(shù)(表3)均小于10%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表2 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

表3 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4符合率試驗(yàn) 用建立的間接ELISA檢測(cè)方法和group D抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)283份臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合率比較。結(jié)果顯示,陽性樣本符合率為94.67%，陰性樣本符合率為98.11%，總符合率為98.59%，Kappa系數(shù)為0.963，符合率高(表4)。

表4 不同檢測(cè)方法的符合性試驗(yàn)結(jié)果 份

2.4 臨床初步應(yīng)用分別用平板凝集和建立的間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)湖北某地方種雞場(chǎng)的184份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，平板凝集檢測(cè)出陽性8份，陰性176份，陽性率為4.35%，間接ELISA檢測(cè)出陽性24份，陰性160份，陽性率為13.04%，顯著高于平板凝集的檢出率(P<0.05)。

3 討論

雞白痢沙門菌是嚴(yán)重危害我國家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的病原菌之一。最常用的檢測(cè)方法是平板凝集試驗(yàn)，但該方法的穩(wěn)定性與特異性存在不足，檢測(cè)結(jié)果易受人為主觀因素影響，容易出現(xiàn)假陽性和漏檢等情況[15]。相比平板凝集，本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測(cè)方法敏感性是平板凝集的400倍，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有的平板凝集試驗(yàn)。因此，在臨床血清樣品檢測(cè)中，間接ELISA更便于檢出雞白痢陽性感染個(gè)體，有助于更好地開展雞白痢凈化。

在間接ELISA試驗(yàn)中，抗原質(zhì)量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大，本研究通過動(dòng)物試驗(yàn)篩選抗原性較好的菌株，并對(duì)提取的不同菌株的LPS進(jìn)行初步驗(yàn)證，最終篩選出免疫原性和特異性都較好的雞白痢沙門菌TC3株。另外，提取高純度的LPS也至關(guān)重要，本研究采用改良的熱酚水法提取雞白痢沙門菌的LPS，加入蛋白酶消化后，再次用熱酚水法去除蛋白酶，可以顯著提高LPS的純度。薛麗芝[16]提取的沙門菌LPS產(chǎn)率為1.130%，蛋白含量為64.940 0 g/L。本試驗(yàn)方法提取的LPS的產(chǎn)率為1.463%，蛋白含量為0.099 5 g/L，證明本試驗(yàn)方法提取的LPS的產(chǎn)率較高且蛋白含量較低。

包被抗原的特異性對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要的影響。D群沙門菌具有高度相似的O抗原結(jié)構(gòu)，因此基于雞白痢沙門菌LPS建立的間接ELISA檢測(cè)方法不僅可檢測(cè)出雞白痢沙門菌的抗體，也可檢測(cè)出同屬于D群沙門菌的腸炎沙門菌和都柏林沙門菌的抗體，這種D群之間的交叉反應(yīng)在平板凝集試驗(yàn)中也得到了證實(shí)[17]。但是，由于LPS具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，不同血清群沙門菌的O抗原結(jié)構(gòu)也具有一定的相似性，因此，抗原的特異性需要進(jìn)行盡可能全面的驗(yàn)證。黃仕霞等[18]在利用沙門菌O抗原建立雞沙門菌抗體ELISA檢測(cè)方法試驗(yàn)中，特異性驗(yàn)證使用雞支原體、雞新城疫、馬立克病毒等陽性血清；胡建樂[19]基于雞白痢沙門菌LPS建立的間接ELISA檢測(cè)方法特異性驗(yàn)證試驗(yàn)中，使用腸炎沙門菌、變形桿菌、巴氏桿菌等陽性血清；與之相比，本方法在特異性驗(yàn)證試驗(yàn)中，陽性血清樣品包括A群、B群、C群、D群、E群等多個(gè)血清群，較為全面地評(píng)估了不同血清群之間的特異性，且該方法與D群沙門菌抗體檢測(cè)試劑盒的符合率較高，進(jìn)一步證明了該方法特異性良好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以應(yīng)用于包括雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌在內(nèi)的D群沙門菌感染抗體的檢測(cè)。

該方法在檢測(cè)鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌等病原菌的陽性血清時(shí)，展現(xiàn)出良好的特異性，但是對(duì)甲型副傷寒沙門菌(A群)的檢測(cè)結(jié)果為弱陽性。研究表明，雞白痢沙門菌的O抗原有O1、O9、O12，甲型副傷寒沙門菌的O抗原有O1、O2、O12，二者具有相似的抗原，可能是其存在交叉反應(yīng)的原因。但是，甲型副傷寒沙門菌并不感染家禽，因此不影響該方法對(duì)家禽抗體的檢測(cè)。也有文獻(xiàn)建議，基于沙門菌O抗原的復(fù)雜性可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)，在抗體檢測(cè)后可對(duì)檢測(cè)陽性雞只進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)[20]。

綜上，本試驗(yàn)建立了基于雞白痢沙門菌LPS作為包被抗原的抗體間接ELISA檢測(cè)方法，可特異性檢測(cè)雞白痢沙門菌等D群沙門菌感染，將為種雞場(chǎng)沙門菌凈化提供有效的工具，其中對(duì)多個(gè)血清群的特異性驗(yàn)證也為基于雞白痢沙門菌LPS作為包被抗原的抗體檢測(cè)的準(zhǔn)確性提供更多科學(xué)數(shù)據(jù)。