王 斌，魏宇辰，白新棟，王晨驍，馮 航，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

干酪性淋巴結(jié)炎(caseous lymphadenitis，CLA)是一種人獸共患慢性傳染病，其中以羊的發(fā)病和危害最為廣泛和嚴(yán)重，在全球多地均有羊干酪性淋巴結(jié)炎的流行報道[1-2]。羊干酪性淋巴結(jié)炎以局部干酪性膿腫為主要特征，根據(jù)發(fā)病部位的不同可分為體表型、內(nèi)臟型和混合型，體表型多見于下頜、肩前和肷部，內(nèi)臟型多見于肺臟和肝臟[3]。通常情況下，該病在羊群中病死率較低，但其對羊群的危害仍不可忽視，羊患病后表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦，導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低和生產(chǎn)性能下降；另一方面，病程后期膿腫部位破潰后，膿腫內(nèi)容物外流可能會造成皮毛、乳肉制品和環(huán)境污染，對羊只經(jīng)濟(jì)價值、公共衛(wèi)生安全和羊群疫病風(fēng)險等方面均有不利影響[4]。通常認(rèn)為，偽結(jié)核棒狀桿菌是羊CLA的病原菌[5]，偽結(jié)核棒狀桿菌因為具有感染后宿主常為慢性病理過程而不致死、能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)、體內(nèi)外可長期生存等特點，因此被稱為“完美寄生蟲”[1]。然而，隨著國內(nèi)外關(guān)于羊CLA研究的深入，諸多研究成果表明羊CLA膿腫內(nèi)容物中分離的病原菌并不是偽結(jié)核棒狀桿菌一種病原菌[6-11]，除偽結(jié)核棒狀桿菌外，金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌是其中最為多見的2種細(xì)菌。截止目前，我國關(guān)于羊CLA的病原研究基本上均以山羊為主，本試驗除對山羊CLA進(jìn)行病原研究外，還將我國陜西關(guān)中地區(qū)山羊與甘肅慶陽地區(qū)綿羊CLA樣膿腫的發(fā)病率和病原分離率進(jìn)行對比分析，能夠進(jìn)一步充實我國關(guān)于羊CLA病原的研究數(shù)據(jù)，以期最終為該病的防治方法和凈化措施研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖場及試驗動物山羊均為陜西關(guān)中地區(qū)的8家養(yǎng)殖場中的奶山羊，綿羊均為甘肅慶陽地區(qū)14家養(yǎng)殖場中的湖羊。

1.2 群體發(fā)病率調(diào)查在養(yǎng)殖場內(nèi)全群篩查，記錄羊群總數(shù)和其中出現(xiàn)CLA樣體表膿腫羊的數(shù)量，發(fā)病率=發(fā)病羊數(shù)/羊群總數(shù)×100%。

1.3 樣品信息隨機(jī)選擇發(fā)病羊，病羊體表膿腫部位表面消毒后，使用20 mL一次性無菌注射器抽取內(nèi)容物約2 mL，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，于2～8℃保存運輸至實驗室。共獲得山羊體表膿腫樣品135份，綿羊體表膿腫樣品107份。

1.4 單只羊體表多處膿腫統(tǒng)計將單只羊體表不同部位出現(xiàn)2處及2處以上膿腫的現(xiàn)象稱為單只羊多處膿腫(圖1)，共有11只山羊和7只綿羊存在多處膿腫，無菌采集每一處膿腫內(nèi)容物，并記錄羊只和樣品信息。

A.山羊；B.綿羊

1.5 主要試劑5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基為西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院重大疫病綜合防控與凈化團(tuán)隊自制；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生物公司；引物合成和基因測序由西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司完成；2×Taq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker購自北京迪寧生物科技有限公司。

1.6 細(xì)菌分離培養(yǎng)將樣品運送至實驗室后，對含樣品的離心管表面消毒，于超凈工作臺內(nèi)使用無菌接種環(huán)蘸取1環(huán)采集的膿腫內(nèi)容物，三區(qū)劃線接種于5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，在電熱恒溫培養(yǎng)箱中(36±1)℃培養(yǎng)48 h，之后挑取單菌落接種于血瓊脂培養(yǎng)基使用相同培養(yǎng)條件進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.7 細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增和測序鑒定經(jīng)純化培養(yǎng)后的細(xì)菌挑取單菌落，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，以提取的DNA為模板，使用細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增通用引物[12]27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 10 μL，模板2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 356 bp，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后送至擎科澤西生物技術(shù)有限公司測序，獲得序列后登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對，以此確定分離菌株信息，記錄每份樣品中所獲得的細(xì)菌種類和數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 體表膿腫發(fā)病率經(jīng)對山羊和綿羊養(yǎng)殖場中羊體表CLA樣膿腫的發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示：山羊發(fā)病率為0.3%～9.5%，平均發(fā)病率為1.8%；綿羊發(fā)病率為0.2%～10.1%，平均發(fā)病率為1.9%。每個養(yǎng)殖場發(fā)病率結(jié)果統(tǒng)計見表1，2。

表1 山羊體表膿腫發(fā)病率統(tǒng)計

表2 綿羊體表膿腫發(fā)病率統(tǒng)計

2.2 膿腫樣品細(xì)菌分離鑒定分離菌DNA樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，均出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的目的片段(圖2)。PCR產(chǎn)物經(jīng)16S rRNA基因測序比對鑒定，結(jié)果顯示膿腫樣品中分離的菌株以金黃色葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、化膿隱秘桿菌為主(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1.陽性對照；2.金黃色葡萄球菌；3.偽結(jié)核棒狀桿菌；4.化膿隱秘桿菌；5.鞘氨醇單胞菌；6.鏈球菌；7.多殺性巴氏桿菌；8.陰性對照

山羊源135份樣品中，獲得69株金黃色葡萄球菌，其中62株為單一種類存在，7株為與其他細(xì)菌混合存在；獲得偽結(jié)核棒狀桿菌42株，其中35株偽結(jié)核棒狀桿菌為單一種類存在，7株為與其他細(xì)菌混合存在；獲得16株化膿隱秘桿菌，其中10株為單一種類存在，6株為與其他細(xì)菌混合存在；獲得鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)7株，鏈球菌(Streptococcus)4株，綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和迪茨細(xì)菌(Dietzia)各1株。每個養(yǎng)殖場樣品中細(xì)菌分離鑒定結(jié)果如下(表3)。

表3 山羊膿腫樣品細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

綿羊源107份樣品中，未獲得偽結(jié)核棒狀桿菌；獲得金黃色葡萄球菌82株，其中77株為單一存在，5株為與其他細(xì)菌混合存在；獲得化膿隱秘桿菌22株，其中20株為單一存在，2株為與其他細(xì)菌混合存在；獲得腔隙莫拉菌(Moraxellalacunata)2株，多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、鏈球菌(Streptococcus)、羊創(chuàng)傷球菌(Helcococcusovis)、鼠鼻羅氏菌(Rothiamuridae)和不動桿菌(Acinetobacter)各1株。每個養(yǎng)殖場樣品中細(xì)菌分離鑒定結(jié)果如下表(表4)。

表4 綿羊膿腫樣品細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.3 膿腫樣品中細(xì)菌分離率統(tǒng)計共采集242份山羊和綿羊體表膿腫內(nèi)容物樣品，經(jīng)細(xì)菌分離鑒定，對不同細(xì)菌在羊源體表膿腫樣品中的總分離率及山羊和綿羊中各自分離率分別予以統(tǒng)計，結(jié)果顯示：山羊體表膿腫樣品中，按分離率由高到低依次為金黃色葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、化膿隱秘桿菌和鏈球菌等其他細(xì)菌；綿羊體表膿腫樣品中，按分離率由高到低依次為金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌和其他細(xì)菌，未分離到偽結(jié)核棒狀桿菌。結(jié)果統(tǒng)計如下(表5，圖2)。

表5 羊膿腫樣品細(xì)菌分離率統(tǒng)計

2.4 體表多處膿腫樣品細(xì)菌分離鑒定體表有多處膿腫的11只山羊中，膿腫數(shù)量為2～5個；對11只山羊每處膿腫的樣品細(xì)菌分離鑒定結(jié)果顯示，山羊體表多處膿腫中分離的細(xì)菌包含金黃色葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌和化膿隱秘桿菌等3種細(xì)菌，其中有6個個體每處膿腫分離的細(xì)菌種類一致且均為金黃色葡萄球菌，而其余5個個體多處膿腫分離的細(xì)菌種類表現(xiàn)為不一致；體表有多處膿腫的4只綿羊中，膿腫數(shù)量為2～4個，每只綿羊體表多處膿腫中分離的細(xì)菌種類一致，且均為金黃色葡萄球菌。膿腫樣品來源和細(xì)菌分離鑒定結(jié)果如表6。

圖4 羊源膿腫樣品中細(xì)菌分離率

表6 單只羊多處膿腫的病原分離鑒定統(tǒng)計

3 討論

近年來，隨著我國羊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，羊CLA的防治工作備受關(guān)注。而國內(nèi)學(xué)者關(guān)于我國CLA的研究，大多集中于對山羊病例的研究[13-16]，關(guān)于綿羊該病的報道十分少見。本試驗對甘肅省慶陽地區(qū)綿羊和陜西省關(guān)中地區(qū)山羊進(jìn)行發(fā)病率和病原學(xué)比較，對于該病的流行病學(xué)和病原學(xué)研究以及防制措施制定能夠提供重要參考依據(jù)。

本試驗從臨床發(fā)病羊中采集膿腫組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，在所有膿腫樣品中，細(xì)菌分離率由高到低依次為金黃色葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、化膿隱秘桿菌及其他種類細(xì)菌，與已有研究結(jié)果基本一致。本試驗結(jié)果表明，在采集的107份綿羊源膿腫樣品中，未分離到偽結(jié)核棒狀桿菌，而135份山羊源樣品中偽結(jié)核棒狀桿菌的分離率為31.1%，說明偽結(jié)核棒狀桿菌在本次采集的綿羊和山羊CLA樣膿腫樣品中分離率存在差異，偽結(jié)核棒狀桿菌可能與甘肅省慶陽地區(qū)綿羊CLA樣體表膿腫發(fā)病無關(guān)，偽結(jié)核棒狀桿菌在我國與國外綿羊的感染現(xiàn)狀和分離率可能不一致[17-18]。另外，膿腫樣品中分離的金黃色葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌和化膿隱秘桿菌絕大部分為單一存在形式，兩兩混合或者三者混合的存在形式極少，關(guān)于該3種病原菌之間是否存在某種未知競爭關(guān)系也可能值得研究。綿羊和山羊體表多處膿腫組織中病原分離鑒定結(jié)果表明，不同膿腫部位分離的細(xì)菌包含金黃色葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌和化膿隱秘桿菌等3種細(xì)菌，山羊體表每處膿腫分離的細(xì)菌既可為同一種細(xì)菌(均為金黃色葡萄球菌)，也可為不同種類的細(xì)菌，而綿羊每處膿腫組織中分離的細(xì)菌種類一致且均為金黃色葡萄球菌，表明金黃色葡萄球菌可能與體表多處膿腫的發(fā)生關(guān)系密切。鑒于此，關(guān)于羊CLA樣體表膿腫的科學(xué)研究和臨床防治，針對金黃色葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、化膿隱秘桿菌開展聯(lián)防聯(lián)控研究可能更為科學(xué)。

據(jù)報道，金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌人工感染動物后，能引發(fā)動物出現(xiàn)與偽結(jié)核棒狀桿菌感染后一致或相近的臨床癥狀與病理變化[19-21]。因此，一方面關(guān)于CLA的病原種類，除普遍認(rèn)知的偽結(jié)核棒狀桿菌外，可能還應(yīng)將金黃色葡萄球菌和化膿隱秘桿菌列入其中；另一方面，從病名角度，或可對于以金黃色葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、化膿隱秘桿菌為主引起的CLA體表膿腫進(jìn)行統(tǒng)一命名，已有部分學(xué)者將其稱為“羊皮下膿腫”，而羊皮下膿腫的范疇較為廣泛，針對性可能不足；稱之為CLA，則將病原種類限定于偽結(jié)核棒狀桿菌，亦不夠合理；本研究中將其稱為“羊CLA樣膿腫”，可供參考，關(guān)于該問題的最終定論，還需更多學(xué)者參與研究討論。