胡 慧，李田美，姜艷芬

(西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學學院，陜西 楊凌 712100)

奶牛乳房炎是由理化因素刺激、微生物感染而引起的一種奶牛乳腺組織炎癥，是造成全球重大經(jīng)濟損失的三大牛病之一，該病嚴重影響奶牛的健康和牛奶的品質，嚴重阻礙奶牛養(yǎng)殖行業(yè)和乳制品行業(yè)的發(fā)展[1-2]。病原微生物、環(huán)境因素和易感牛三者共同作用引起乳房炎，而病原微生物感染是最主要的原因。常見的引起奶牛乳房炎的致病菌有無乳鏈球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、凝固酶陰性葡萄球菌等[3]。但因地域差異以及乳房炎防控水平的不斷提高，引起奶牛乳房炎發(fā)病的優(yōu)勢菌群也有所變化。ZHANG等[4]對我國30個城市的125個奶牛場的研究結果表明，無乳鏈球菌在所有乳腺炎致病菌中占比最高(38.6%)；而另一項研究對我國161個大型奶牛場中采集的3 288份臨床性乳房炎乳樣中的病原菌的統(tǒng)計結果顯示，主要致病菌為大腸埃希菌(14.4%)、克雷伯菌(13.0%)和凝固酶陰性葡萄球菌(11.3%)等環(huán)境致病菌[5]。目前，臨床上對乳房炎的治療仍以抗生素為主，廣泛使用廣譜抗生素使得治療效果甚微的同時造成了藥物殘留以及致病菌株的耐藥性增高[6]。因此，更好地了解奶牛乳房炎致病菌的分布對于選擇適當?shù)目咕煼ê蛯嵤╊A防性管理策略非常重要。本試驗擬通過采集陜西省部分地區(qū)奶牛場臨床型乳房炎乳樣，進行細菌的分離鑒定，了解引起乳房炎的主要致病菌及其耐藥情況，為該地區(qū)奶牛乳房炎的防治提供科學依據(jù)，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH瓊脂)、5%綿羊血瓊脂平板，購自青島科源生物科技公司；DL2000 DNA Marker，購自近岸蛋白質科技有限公司。PCR儀、生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠產(chǎn)品；厭氧培養(yǎng)箱，Baker Ruskinn公司產(chǎn)品；ThermoFisher Sensititire，Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 樣品采集2019年5月至2020年10月，分別在陜西省關中地區(qū)3個奶牛場采集臨床型乳房炎乳樣共126份，包括經(jīng)抗生素治療的18份。采樣前先經(jīng)消毒液噴淋乳房及腹部體表以清除污物，再用消毒毛巾(一牛一巾)擦拭乳房和乳頭部位，棄去前3把乳，收集30 mL乳汁于滅菌試管中，置于冰盒中于6 h 內(nèi)帶回實驗室。

1.3 細菌的分離純化將乳樣顛倒混勻，均勻涂抹于5%綿羊血血平板上，37℃培養(yǎng)24 h。分別選擇不同形態(tài)特征的菌落經(jīng)革蘭染色觀察細菌的形態(tài)后，再劃線接種到BHI瓊脂培養(yǎng)24～48 h。挑取經(jīng)鏡檢確認純化的菌落接種到BHI液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)后劃線，選取單菌落進行后續(xù)試驗。整個細菌的分離純化過程中同時將樣品置于厭氧培養(yǎng)箱(80%N2,10%H2,10%CO2)進行培養(yǎng)。

1.4 16S rDNA鑒定以純化的單菌落為模板進行16S rDNA PCR擴增，通用引物序列：27-F-5′-AGAG-TTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492-R-5′-T-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并拍照。擴增條帶約為1 500 bp且符合測序標準的擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物公司測序。測序結果在NCBI網(wǎng)站進行BLAST序列比對，確定細菌種屬并保菌至-80℃凍存。

1.5 生化鑒定選擇1.4鑒定的部分致病菌應用ThermoFisher Sensititire按照說明書步驟進行細菌的生化鑒定試驗，革蘭陽性菌使用GPID進行鑒定，革蘭陰性菌使用GNID進行鑒定。細菌復蘇后，挑取3～5個單個菌落經(jīng)去離子水乳化混勻，用Sensititire濁度計調整至0.5 Mcfarland。分別吸取50 μL 細菌混懸液加至鑒定板中，GPID在1A、2A、9A孔接種細菌混懸液，GNID在1A、2A、5A、6A、9A、10A孔接種細菌懸液，接種完后立即加入液體石蠟覆蓋。所有孔用封膜覆蓋，H行的覆蓋膜上須有孔，37℃培養(yǎng)18～24 h，Sensititire AutoReader讀取結果。

1.6 藥物敏感性檢測分別選取10種抗菌藥物對部分分離鑒定的細菌采用K-B法進行藥物敏感性檢測。嚴格按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)和歐盟藥敏試驗標準(EUCAST)進行藥敏試驗和結果判定。

2 結果

2.1 16S rDNA測序從126份臨床乳房炎乳樣中共分離純化細菌366株，純化所得菌株16S rDNA PCR均有符合預期的1 492 bp條帶(圖1)。測序結果經(jīng)BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對，顯示共分離純化29個屬的細菌，其中包括11個屬的病原菌，占所有分離菌株的56.24%，其中分離到1株厭氧菌產(chǎn)氣莢膜梭菌。3個場主要細菌陽性分離率如表1所示。3個場中葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、芽孢桿菌屬和克雷伯菌屬的樣品陽性分離率較高，分別為30.94%(29/126)，22.22%(28/126)，21.43%(27/126)，16.67%(21/126)，15.87%(20/126)，7.14%(9/126)；其中，蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和黃體鏈球菌的分離率較高，分別為15.87%(20/126)，11.90%(15/126)，11.90%(15/126)，11.11.%(14/126)，6.35%(8/126)，5.56%(7/126)，4.76%(6/126)，4.76%(6/126)。

表1 主要細菌分離鑒定結果

M.DL2000 DNA Marker；1～13.分離菌株；14.ddH2O

2.1.1A場 共采集臨床型乳房炎樣品26份，共分離細菌60株，主要致病菌屬有葡萄球菌屬和鏈球菌屬，樣品陽性分離率分別為53.85%(14/26)和15.38%(4/26)；葡萄球菌屬中產(chǎn)色葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、模仿葡萄球菌和溶血葡萄球菌的分離率分別為26.92%(7/26)，7.69%(2/26)，3.85%(1/26)，3.85%(1/26)；鏈球菌屬中乳房鏈球菌的陽性分離率為15.38%(4/26)；此外，還分離出綠色氣球菌、多殺性巴氏桿菌各1株。該場凝固酶陰性葡萄球菌和乳房鏈球菌感染為主，且存在著多種凝固酶陰性葡萄球菌的混合感染。

2.1.2B場 共采集的臨床型乳房炎樣品15份，共分離細菌52株，主要致病菌屬為不動桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬和葡萄球菌屬，分離率分別為53.33%(8/15)，20.00%(3/15)，13.33%(2/15)，13.33%(2/15)，主要為約氏不動桿菌(40.00%)，乳房鏈球菌(13.33%)和格氏乳球菌(13.33%)。該場以約氏不動桿菌、乳房鏈球菌和格氏乳球菌感染為主。

2.1.3C場 共采集臨床型乳房炎樣品85份，其中包括經(jīng)過抗菌藥物治療的18份。該場主要致病菌有腸桿菌屬(27/85)、葡萄球菌屬(25/85)、鏈球菌屬(23/85)、芽孢桿菌屬(20/85)和不動桿菌屬(17/85)，以蠟樣芽孢桿菌、鮑曼不動桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌感染為主，其分離率分別為23.53%(20/85)，17.65%(15/85)，9.41%(8/85)，9.41%(8/85)，8.24%(7/85)，7.06%(6/85)。67份未經(jīng)治療的樣品中主要致病菌屬為腸桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、不動桿菌屬和芽孢桿菌屬，其中鮑曼不動桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、黃體鏈球菌和大腸埃希菌的分離率較高，分別為22.39%(15/67)，19.40%(13/67)，11.94%(8/67)，10.45%(7/67)，8.96%(6/67)，8.96%(6/67)。經(jīng)過治療后的18份樣品中，分離出的葡萄球菌屬、腸桿菌屬比例均有下降，而芽孢桿菌屬以及克雷伯菌屬的陽性分離率較未治療的樣品升高，蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)色葡萄球菌和牛鏈球菌的陽性分離率分別為38.89%(7/18)，22.22%(4/18)，16.67%(3/18)，11.11%(2/18)。

2.2 生化鑒定按照GNID進行經(jīng)過16S rDNA測序鑒定的肺炎克雷伯菌生化試驗，應用GPID進行蠟樣芽孢桿菌和產(chǎn)色葡萄球菌生化試驗，結果顯示蠟樣芽孢桿菌能分解丙三醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、精氨酸等，不能分解尿素、山梨醇、甘露醇；產(chǎn)色葡萄球菌能分解甘露醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖等，不能分解尿素和山梨醇；肺炎克雷伯菌能分解葡萄糖、麥芽糖、木糖、山梨醇、七葉苷、肌醇等，不能分解尿素、鳥氨酸、精氨酸。3種細菌生化鑒定結果均符合對應菌株生化特點，與16S rDNA測序結果相符。

2.3 藥物敏感性檢測分別選取5株蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)色葡萄球菌分離菌株，采用紙片擴散法進行藥敏試驗。結果表明，5株肺炎克雷伯菌對氨芐西林均耐藥，對氯霉素、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢他啶均敏感(圖2A)；2019年11月樣品有2株分離株分別對頭孢呋辛、四環(huán)素中介，2020年7月樣品有1株分離株對氧氟沙星中介，其余4株為敏感。5株產(chǎn)色葡萄球菌對10種抗菌藥物均100%敏感(圖2B)。5株蠟樣芽孢桿菌對呋喃唑酮、卡那霉素、慶大霉素、青霉素均耐藥；有1株對紅霉素耐藥，4株中介；1株對新霉素耐藥，2株敏感，2株中介；5株均對環(huán)丙沙星、頭孢拉定敏感；2株對四環(huán)素中介，3株敏感；5株對頭孢哌酮中介(圖2C)。

A.肺炎克雷伯菌；B.產(chǎn)色葡萄球菌；C.蠟樣芽孢桿菌

3 討論

全球奶牛乳房炎的發(fā)病率在25%～60%之間，國內(nèi)大部分地區(qū)臨床型奶牛乳房炎的檢出率約為33.41%，隱性乳房炎檢出率約為46.40%～86.70%，每年給全球奶牛業(yè)帶來數(shù)十億美元的經(jīng)濟損失[7-8]。目前，臨床上治療乳房炎最主要的措施仍然是抗生素治療，但是長期不合理的使用抗生素，造成了環(huán)境中耐藥菌株的產(chǎn)生并促進耐藥基因的傳播，人類和動物通過接觸或食用被污染的食源性產(chǎn)品造成耐藥基因在動物和人的微生物群落間擴散，威脅公共健康安全[9-11]。因此，明確乳房炎主要致病菌及其耐藥譜對科學指導臨床用藥和減少耐藥菌的產(chǎn)生具有重要意義。

本試驗共采集了陜西省3個奶牛養(yǎng)殖場的126份乳房炎乳樣，共分離出366株菌，葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯菌屬以及不動桿菌屬的分離率較高。C場主要致病菌是葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬和芽孢桿菌屬，隨著乳房炎感染周期的延長和季節(jié)的變化，致病菌種類增多，且存在著多種常見致病菌混合感染的情況。SONG等[12]收集了中國12個主要產(chǎn)奶省15個大型牛場1 153 份乳房炎奶樣，分離到最常見的病原體是葡萄球菌(39.00%)、鏈球菌屬(11.00%)、芽孢桿菌屬(8.20%)、綠色氣球菌(6.70%)和不動桿菌屬(3.40%)，與本試驗中病原體所占比例相似。

本試驗中蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌的分離率較高，而在經(jīng)過頭孢喹肟和頭孢噻呋輪換用藥治療的乳房炎樣品中，肺炎克雷伯菌的分離率達到27.78%，說明其對部分抗生素產(chǎn)生耐藥。在本試驗中產(chǎn)色葡萄球菌分離株對10種藥物均敏感，而在我國其他地區(qū)，產(chǎn)色葡萄球菌已經(jīng)出現(xiàn)了不同程度的耐藥，且其能攜帶多種腸毒素基因，這些乳房炎源性葡萄球菌腸毒素基因的流行存在著地域相關性[13]，為奶制品安全帶來巨大隱患。四川省涼山地區(qū)乳源性肺炎克雷伯菌對氨芐西林耐藥率達到90.9%[14]。本試驗中經(jīng)過抗生素治療的樣品中分離的肺炎克雷伯菌對氨芐西林的耐藥率達到100%，對頭孢喹肟、頭孢噻呋和氨芐西林耐藥嚴重，可能與該場長期反復使用這些抗生素有關，該菌會造成持續(xù)性感染，短暫治愈后易形成反復感染，使用抗生素治療往往達不到效果[15]。據(jù)報道，分離的蠟樣芽孢桿菌對慶大霉素[16-17]、卡那霉素和環(huán)丙沙星高度敏感[18]。而本試驗中該菌存在四重耐藥的情況，說明關中地區(qū)乳源性蠟樣芽孢桿菌的耐藥情況較為嚴重，可能與不同地區(qū)不同奶牛場的用藥習慣有關，提示臨床上需要注意規(guī)范用藥，避免抗生素的濫用。

本試驗大部分分離株為環(huán)境性致病菌，金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌為接觸性傳染致病菌，主要存在于乳房內(nèi)部，在泌乳動物的擠奶過程中傳播；大腸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、黃體鏈球菌、巴黎鏈球菌和克雷伯菌屬環(huán)境性致病菌，廣泛存在于環(huán)境中，可通過墊料、土壤、飲水以及擠奶器等相互傳播。受到宿主或環(huán)境因素的影響，接觸性傳染致病菌和環(huán)境性病原菌可以相互轉換，提示養(yǎng)殖場應加強飼養(yǎng)管理，保持畜舍環(huán)境和飲水衛(wèi)生可有效降低乳房炎的發(fā)病率。本試驗明確了關中地區(qū)部分奶牛場引起奶牛乳房炎的主要病原菌和部分分離菌株的藥物敏感性情況，為乳房炎的防控和臨床用藥提供了科學依據(jù)。