王小榛，劉 暢，宋雪嬌，邢 晨，唐 陽(yáng)，張?jiān)婪?，?桐，陳雪英，李艷華，劉艷艷

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

乳房炎是由乳房組織感染引起的炎癥反應(yīng)，已成為奶牛最普遍的疾病[1]，它不僅對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康產(chǎn)生影響，而且還會(huì)給乳制品行業(yè)帶來(lái)相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。微生物感染已成為引起奶牛乳房炎的一個(gè)主要因素，其中金黃色葡萄球菌是主要的病原菌之一，其含有多種毒力基因且分布廣泛[3]。抗生素在乳房炎的治療中被廣泛的應(yīng)用，但抗生素耐藥發(fā)生率的增加以及牛奶和奶制品中抗生素殘留的頻繁報(bào)道引起了人們的關(guān)注[4]。

中草藥在預(yù)防和治療疾病中發(fā)揮著重要作用。連翹被稱(chēng)為“瘡家圣藥”，具有消腫散結(jié)、清熱解毒等作用,以連翹為主要成分的隱乳凈已被證實(shí)對(duì)乳房炎具有一定的治療作用[5]。此外，研究表明連翹的主要臨床作用與其抗炎活性具有一定的關(guān)聯(lián)[6]，因此其具有治療乳房炎的潛力。中藥的有效藥效基礎(chǔ)是由多成分組成的復(fù)雜體系，其作用機(jī)制復(fù)雜，難以闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)計(jì)算機(jī)技術(shù)、生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)分析方法可系統(tǒng)而全面地揭示中藥多成分、多靶點(diǎn)、多作用通路關(guān)系[7]。

本試驗(yàn)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)相結(jié)合的手段，通過(guò)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)探索連翹治療乳房炎的藥效物質(zhì)，通過(guò)功能注釋分析連翹抗乳房炎的生物學(xué)過(guò)程及潛在作用機(jī)制。最后通過(guò)構(gòu)建金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠乳房炎模型，驗(yàn)證連翹發(fā)揮治療乳房炎的分子機(jī)制,為進(jìn)一步分析連翹抗乳房炎的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制闡明提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org)、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)、Draw Venn Diagram 軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)以及GraphPad Prism 8.0軟件等。

1.2 連翹成分及乳房炎靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索連翹的化學(xué)成分,將口服利用度(OB≥30%)和類(lèi)藥性(DL≥0.18)作為篩選條件，進(jìn)行活性成分及靶點(diǎn)的搜索；在DisGeNET、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)以“mastitis”為關(guān)鍵詞檢索乳房炎靶點(diǎn),使用在線韋恩軟件Draw Venn Diagram獲得連翹-乳房炎的交集靶點(diǎn)，探索連翹可能作用于乳房炎的潛在靶點(diǎn)。

1.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鐾ㄟ^(guò)Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，預(yù)測(cè)連翹治療乳房炎的關(guān)鍵藥效成分。

1.4 核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)輸入連翹和乳房炎的共同靶點(diǎn)，物種設(shè)置為“Bostaurus”，最低閾值為 0.7，獲得相互作用靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)，并通過(guò) Cytoscape 3.6.1軟件中Network Analyzer工具進(jìn)一步分析，根據(jù)Degree值篩選作用核心靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)連翹-乳房炎共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，探究藥物作用的生物學(xué)功能。通過(guò)Cytoscape插件ClueGO對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，探究藥物作用通路。

1.6 連翹水提液制備連翹購(gòu)于中國(guó)黑龍江省哈爾濱市中藥市場(chǎng)(批號(hào)：201817)，經(jīng)鑒定為連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl，標(biāo)本存放在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物藥學(xué)系。稱(chēng)取連翹藥材10 g,加入0.2 L蒸餾水，浸泡60 min,武火煮沸后文火煎3次，每次1 h，過(guò)濾，混合3次濾液，減壓濃縮至1 g/mL(生藥材)，即得連翹水提液。依據(jù)2015版中國(guó)藥典規(guī)定對(duì)連翹水提物的連翹苷及連翹酯苷A進(jìn)行含量測(cè)定[8]。

1.7 試驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)哺乳雌性BALB/c小鼠36只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物試驗(yàn)均經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號(hào)：NEAUEC20)。適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，分別為對(duì)照組(Control)、乳腺炎模型組(Model)、連翹低劑量組(FF 2.5 g/kg)、連翹中劑量組(FF 5.0 g/kg)、連翹高劑量組(FF 7.5 g/kg)和陽(yáng)性藥物組(DEX 5.0 mg/kg)。通過(guò)將105CFU金黃色葡萄球菌(ATCC,Manassas,VA,United States)注入正常小鼠第4對(duì)乳房(從頭部開(kāi)始計(jì)數(shù))進(jìn)行造模。造模次日開(kāi)始，分別給予2.5，5.0，7.5 g/kg連翹水煎液進(jìn)行灌胃治療，每日2次，連續(xù)5 d。5.0 mg/kg地塞米松(DEX)作為陽(yáng)性對(duì)照。末次給藥12 h后處死雌鼠，取乳腺組織。

1.8 病理組織學(xué)觀察收集的部分乳房組織用4%多聚甲醛固定，脫色和石蠟脫水后，對(duì)乳房切片(4 μm)進(jìn)行蘇木精伊紅染色,最后，用光學(xué)顯微鏡對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行觀察。

1.9 熒光定量PCR(qRT-PCR)使用總RNA試劑盒從乳腺組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄至cDNA(天根生化科技有限公司)。采用qRT-PCR方法檢測(cè)驗(yàn)證相關(guān)通路基因的表達(dá)，引物由上海生工設(shè)計(jì)，2-△△Ct值表示基因相對(duì)表達(dá)量，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.10 ELISA分析小鼠乳腺組織稱(chēng)質(zhì)量后于冰上研磨(1 g組織/1 mL生理鹽水)，12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中IL-17A、NF-κB、IκBα、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。在450 nm處讀取D值。

2 結(jié)果

2.1 連翹HPLC分析定量結(jié)果顯示，連翹苷和連翹酯苷A在連翹中的百分比含量分別為1.51%和5.80%，這2種活性化合物的含量均高于2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，說(shuō)明連翹符合《中國(guó)藥典》的要求(圖1)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；B.樣品中連翹苷色譜圖；C.連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；D.樣品中連翹酯苷A色譜圖

2.2 連翹抗乳房炎的藥效成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，共獲得23個(gè)潛在的連翹成分(表2)和208個(gè)成分靶點(diǎn)；通過(guò)DisGeNET、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得167個(gè)牛乳房炎靶點(diǎn)。在Draw Venn Diagram在線軟件輸入208個(gè)連翹成分靶點(diǎn)、167個(gè)牛乳房炎靶點(diǎn)，獲得連翹-乳房炎的交集靶點(diǎn)25個(gè)。通過(guò)Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)(圖2)，通過(guò)拓?fù)鋮?shù)Degree值篩選潛在的連翹抗乳房炎的藥效成分。網(wǎng)絡(luò)顯示，槲皮素(quercetin，Degree=19)、木犀草素(luteolin，Degree=10)、漢黃芩素(wogonin，Degree=6)和山奈酚(kaempferol，Degree=5)擁有最高的度值,表明這些成分可能是發(fā)揮抗乳房炎的藥效成分。

圖2 連翹成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

表2 連翹活性成分信息

2.3 PPI分析將25個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得交互靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系。通過(guò)Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化(圖3)。拓?fù)鋮?shù)Degree值代表每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性，度值與節(jié)點(diǎn)顏色深淺及節(jié)點(diǎn)大小呈正相關(guān)，即節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，其Degree值越大。排名靠前的分別是白介素-6(IL-6,Degree=13),腫瘤壞死因子(TNF,Degree=12),白介素-8(CXCL8,Degree=11),表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR,Degree=11)和細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1,Degree=10)，這些可能是連翹作用于乳房炎的核心靶點(diǎn)。

圖3 核心靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)25個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行生物過(guò)程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)的富集分析，通過(guò)富集的基因數(shù)值(Count)大小及P<0.05篩選條目并繪圖。如圖4所示，連翹參與的主要生物過(guò)程有RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter)、免疫應(yīng)答(immune response)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)等；細(xì)胞組分主要富集于胞外間隙(extracellular space)，質(zhì)膜外(external side of plasma membrane)，胞質(zhì)溶膠(cytosol)等；分子功能主要富集于細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、序列特異性DNA結(jié)合(sequence-specific DNA binding)、轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)等。

圖4 GO富集分析結(jié)果

2.5 KEGG通路分析運(yùn)用Cytoscape插件ClueGO對(duì)25個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，共富集到27條信號(hào)通路(圖5)，其中包括6個(gè)與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，如IL-17信號(hào)通路(7.28%)、NF-κB信號(hào)通路(6,24%)、TNF信號(hào)通路(6,24%)、Toll樣受體信號(hào)通路(5,20%)和T細(xì)胞受體信號(hào)通路(5,20%)，這些途徑可能在連翹治療乳房炎中起關(guān)鍵作用,說(shuō)明中草藥通過(guò)多種靶點(diǎn)和途徑發(fā)揮了巨大的作用。

圖5 KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果

2.6 乳腺組織形態(tài)學(xué)及病理學(xué)分析與空白組相比，金黃色葡萄球菌感染組的小鼠乳腺管腔結(jié)構(gòu)消失，并伴有更多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比,7.5,5.0 g/kg FF和5.0 mg/kg DEX 給藥治療可改善乳腺組織形態(tài)，緩解金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的炎癥損傷(圖6)。

A.空白組；B.模型組；C.7.5 g/kg FF治療組；D.5.0 g/kg FF治療組;E.2.5 g/kg FF治療組；F.5.0 mg/kg DEX治療組

2.7 IL17/NF-κB信號(hào)通路的分子表達(dá)與模型組相比，7.5，5.0 g/kg連翹水煎液和5.0 mg/kg DEX干預(yù)能顯著下調(diào)IL-17A、IκBα、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表達(dá)水平(圖7)和降低相應(yīng)蛋白含量(圖8)。結(jié)果表明，連翹可通過(guò)IL17/NF-κB信號(hào)通路激活緩解金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳房炎。

A.IL-17A；B.IκBα；C.NF-κB；D.TNF-α；E.IL-6；F.IL-1β。與空白組相比，##表示P<0.01；與模型組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01；ns:沒(méi)有顯著性差異。下同

A.IL-17A；B.IκBα；C.NF-κB；D.TNF-α；E.IL-6；F.IL-1β

3 討論

乳房炎是牛群中最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的炎癥性疾病，患畜治療費(fèi)用巨大[9]。當(dāng)今抗生素治療依舊是治療奶牛乳房炎的主要方法，但抗生素的濫用不僅會(huì)出現(xiàn)藥物殘留，還會(huì)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間使用患畜奶制品的人類(lèi)帶來(lái)潛在威脅。連翹具有消腫散結(jié)、清熱解毒的作用，對(duì)乳房炎具有潛在的治療作用。本試驗(yàn)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)連翹治療乳房炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)和通路涉及了細(xì)胞因子活性、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等環(huán)節(jié)。

根據(jù)成分-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，我們鑒定出11個(gè)可能對(duì)乳房炎產(chǎn)生巨大治療作用的潛在活性化合物。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)(Degree)分析，槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山奈酚的Degree值排名靠前，表明這些成分可能是連翹治療奶牛乳房炎的主要成分。此外，槲皮素、木犀草素和山奈酚這3種成分已被證實(shí)對(duì)乳房炎具有顯著治療作用。富含槲皮素的中藥可通過(guò)抑制NF-κB的活化，提高Nrf2-ARE的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮治療乳房炎作用[10-11]；木犀草素可通過(guò)抑制MMPs表達(dá)和NF-κB活化，減輕金黃色葡萄球菌引起的乳房炎的炎癥反應(yīng)[12]；山奈酚可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路抑制乳房炎的炎癥反應(yīng)[13]。這些結(jié)果再次表明，中藥是通過(guò)多種成分和多靶點(diǎn)發(fā)揮作用的。

眾所周知，蛋白質(zhì)通過(guò)相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[14]，不同的靶蛋白之間存在多種關(guān)聯(lián)，Degree值越高，靶點(diǎn)的潛在作用越大。IL-6、TNF、CXCL8、EGFR、ICAM1排名靠前，可能是連翹治療乳房炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。細(xì)胞因子是保護(hù)宿主反應(yīng)的重要介質(zhì)，包括防御腫瘤發(fā)生和微生物入侵。但是，特定的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生必須受到嚴(yán)格的調(diào)控，以防止這些分子的過(guò)度表達(dá)，也被稱(chēng)為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，這可能導(dǎo)致炎癥的增加和組織損傷[15]。在所有細(xì)胞因子中，TNF-α和IL-6在細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并可能與疾病嚴(yán)重程度的增加有關(guān)[16]。此外，IL-6被認(rèn)為是牛乳房炎的標(biāo)志物[17]。連翹水提物能有效下調(diào)TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)和蛋白含量，此結(jié)果在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠乳房炎模型得到了進(jìn)一步證實(shí)。

中草藥通過(guò)多種靶點(diǎn)和途徑發(fā)揮作用。結(jié)合GO和KEGG通路富集分析，連翹抗乳房炎的分子機(jī)制與細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、免疫調(diào)節(jié)和凋亡過(guò)程密切相關(guān)。在富集到的27條信號(hào)通路中，其中的6條通路與炎癥相關(guān)，包括IL-17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路。在這些炎癥相關(guān)通路的相互作用中，IL-17、TNF和TLRs的激活可觸發(fā)NF-κB的活化[18-20]。因此，我們選擇NF-κB信號(hào)通路作為IL-17信號(hào)通路的下游驗(yàn)證通路。IL-17家族是最近被分類(lèi)為細(xì)胞因子的一個(gè)子集，在急性和慢性炎癥反應(yīng)中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用[21],IL-17過(guò)表達(dá)可促進(jìn)乳房炎組織損傷[22]。IL-17A不僅與TNF-α協(xié)同，在TNF-α誘導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定后誘導(dǎo)基因表達(dá)，而且還激活NF-κB級(jí)聯(lián)，上調(diào)多種細(xì)胞因子和促炎趨化因子表達(dá)，以顯示其促炎作用[23-24]。在未激活狀態(tài)下,NF-κB以同源或異二聚體形式與IκBα結(jié)合[25]。此外，經(jīng)金黃色葡萄球菌感染后的奶牛體細(xì)胞中IL-17A基因表達(dá)增加，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)上清液刺激乳腺上皮細(xì)胞其IL-17A基因的表達(dá)也增加[26-27]。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，7.5,5.0 g/kg連翹顯著下調(diào)IL-17A、IκBα、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA和蛋白水平，表明連翹可通過(guò)IL17/NF-κB信號(hào)通路緩解金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳房炎炎癥反應(yīng)。

綜上，本試驗(yàn)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物試驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)連翹治療牛乳房炎的分子機(jī)制進(jìn)行初步探究，揭示了中藥發(fā)揮作用的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為治療發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的牛乳房炎的研究提供新的思路。