李心蕊，潘陽陽，韓小紅，藺 蕙，張燕燕，王立斌，余四九，崔 燕，徐庚全*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是我國藏區(qū)譽有“高原之舟”和“全能家畜”的畜牧資源，生存在3 000 m以上海拔地區(qū)，具有耐寒耐低氧的生存特性[1]。精子發(fā)育的優(yōu)良決定著公畜的繁殖性能，而睪丸需要攝取更多的氧氣以維持精子的生成，牦牛常年生存的生活環(huán)境致使其睪丸中氧分壓相對較低，迫使睪丸組織對缺氧具有更強的抗逆性[2]。據(jù)報道，高原低氧環(huán)境對雄性生育能力具有抑制作用，不僅會導(dǎo)致多種酶及蛋白降解的能力降低，甚至也會使精子生成數(shù)量減少[3-4]。牦牛長期適應(yīng)環(huán)境維持正常的繁殖力，其抗逆性的原理尚不清楚，有大量學(xué)者對牦牛睪丸的發(fā)育進(jìn)行研究，以期揭示生殖系統(tǒng)對低氧的適應(yīng)機制。

前動力蛋白2(prokineticin2，PK2)是一種分泌型的小分子蛋白[4]，屬于AVIT蛋白家族成員之一。PK2是由MOLLAY等[5]從蟾蜍的皮膚分泌物中發(fā)現(xiàn)的，因其相對分子質(zhì)量為8 kDa，被命名為Bv8(Bombinavariegate molecular mass-8 kDa)。隨后Bv8的同源蛋白在一些哺乳動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，并分別命名為前動力蛋白1(prokineticinl,PK1)和PK2。PK2一直是作為促進(jìn)腸道收縮的蛋白而為人們熟知[7]。另據(jù)報道，在生理狀態(tài)的人類和小鼠睪丸組織中，PK2基因在精小管中穩(wěn)定強烈表達(dá)[4-5]并在促性腺發(fā)育[8]及精子形成的最后階段[9]發(fā)揮作用；也有研究證實，將小鼠的PK2基因敲除后，其生殖器官的質(zhì)量降低，睪丸內(nèi)生精管萎縮，管腔狹小，間質(zhì)稀疏且間質(zhì)細(xì)胞較少，精子發(fā)生缺陷[6-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以誘導(dǎo)PK2的表達(dá)量上調(diào)[10]，而表達(dá)PK2受體的血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷分裂增殖[11]，因此推測PK2可以通過旁分泌途徑促進(jìn)睪丸的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以達(dá)到調(diào)節(jié)睪丸生精功能的作用。

目前，關(guān)于PK2在高原動物睪丸發(fā)育各階段中的表達(dá)情況尚未見報道。本試驗采集發(fā)育不同階段的牦牛睪丸組織，研究PK2的表達(dá)情況，為明確牦牛生殖系統(tǒng)低氧耐受適應(yīng)機制提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為提高牦牛繁殖力補充資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理樣本來源于甘肅甘南安多屠宰場,選取幼年期(1～2歲)、性成熟初期(2～3歲)、性成熟后期(3～5歲)和老年期(5～7歲)4個階段[12]的健康牦牛各3頭，處死后采集睪丸組織，液氮冷凍，-80℃保存。另取1 cm3組織塊，置于4%多聚甲醛中固定保存。

1.2 主要試劑和儀器PCR儀(Eppendorf,德國)；實時熒光定量PCR儀(Loch1公司,瑞士)；DAB顯色液(ZSGB-bio)；TRIzol試劑(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)；Taq PCR Master Mix(Promeg,美國)；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(寶生物，大連)；山羊抗兔IgG/HRP抗體(Bioss,北京)；兔抗PK2多克隆抗體(Novus Biologicals,上海)；SP試劑盒(Bioss,北京)。

1.3 牦牛總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄按照TRIzol試劑說明書提取不同發(fā)育階段的牦牛睪丸組織總RNA,分光光度計測D450 nm值，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA的完整性。將RNA稀釋為統(tǒng)一濃度，根據(jù)Go ScriptTMReverse Transcription System說明書反轉(zhuǎn)錄，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物，交由上海生工基因科技公司合成(引物信息見表1)。

表1 引物序列

1.5 qRT-PCR檢測牦牛睪丸組織中PK2 mRNA的表達(dá)以cDNA為模板擴增牦牛PK2基因。反應(yīng)體系為：2×SYBR?Premix Ex TaqTMEraserTM10 mL,200 mg/L模板cDNA 1 μL,上、下游引物各 0.5 mL,去離子水 8 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min;95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次。試驗重復(fù)4次，繪制熔解曲線和擴增曲線，Ct值通過2-△△Ct方法計算并得到PK2 mRNA的相對表達(dá)量，并用SPSS 25.0軟件分析其在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織的表達(dá)差異性。

1.6 IHC檢測牦牛睪丸組織中PK2的定位制作4 μm厚不同發(fā)育階段的牦牛睪丸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，滴加3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，沸水浴15 min修復(fù)抗原，按照說明書進(jìn)行染色，一抗1∶300稀釋，陰性對照組用PBS代替一抗，DAB顯色，樹脂封片后拍照。

1.7 Western blot檢測牦牛睪丸組織中PK2蛋白的表達(dá)將-80℃保存的各發(fā)育階段牦牛睪丸組織研磨成粉末，利用裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF)提取蛋白樣品，-80℃保存。將蛋白樣品100℃變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(10%分離膠與5%濃縮膠)；剪切目的蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF膜上；PBST洗去多余轉(zhuǎn)膜液后，4℃封閉過夜；4℃一抗孵育8 h；室溫二抗孵育1 h；曝光成像，利用Image J收集灰度值分析其相對表達(dá)量并通過SPSS 25.0軟件分析其差異性。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中PK2 mRNA的表達(dá)瓊脂糖凝膠電泳顯示，PK2 和β-actinmRNA擴增產(chǎn)物條帶單一且大小與預(yù)期相符(圖1)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，其熔解曲線峰單一，因此引物特異性能夠滿足試驗驗的要求。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，PK2 mRNA在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中均有表達(dá)，性成熟后期組和老年期組的表達(dá)量高，幼年期組與性成熟初期組表達(dá)量低，且差異顯著(P<0.05)，性成熟后期組與老年期組之間表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)，同樣幼年期組與性成熟初期組之間表達(dá)量也無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

上圖為PK2產(chǎn)物電泳分析；下圖為β-actin產(chǎn)物電泳分析。M.DL2000 DNA Marker；1.幼年期組；2.性成熟初期組；3.性成熟后期組；4.老年期組

1.相同小寫字母之間表示差異不顯著(P>0.05)；2.不同小寫字母之間表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 IHC檢測PK2在不同發(fā)育階段牦牛睪丸中的表達(dá)定位IHC結(jié)果顯示，PK2蛋白在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中均有表達(dá)，且性成熟初期組、性成熟后期組和老年組的陽性表達(dá)細(xì)胞種類較幼年組多。在1歲幼年期組中，可觀察到已有少量精子細(xì)胞和精子出現(xiàn)，且PK2主要分布在精子細(xì)胞及精子中，在其他細(xì)胞中幾乎不表達(dá)(圖3A)。PK2蛋白在性成熟初期牦牛睪丸中主要表達(dá)在精子細(xì)胞、精子、初級精母細(xì)胞及次級精母細(xì)胞中(圖3B)，性成熟后期組與老年期組表達(dá)部位與性成熟初期組相同(圖3C，D)，表明隨著性成熟的發(fā)生，PK2陽性表達(dá)的生精細(xì)胞的種類與數(shù)量增多。

A.幼年期組；B.性成熟初期組；C.性成熟后期組；D.老年期組；E.幼年期組陰性對照；F.性成熟初期組陰性對照；G.性成熟后期組陰性對照；H.老年期組陰性對照。CST.生精小管；RS.精子細(xì)胞；LC.間質(zhì)細(xì)胞；SC.支持細(xì)胞；PS.初級精母細(xì)胞；S.精原細(xì)胞；SS.次級精母細(xì)胞；Sp.精子

2.3 Western blot檢測不同發(fā)育階段牦牛睪丸中PK2蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，PK2蛋白在各時期組中存在表達(dá)差異(圖4)。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PK2蛋白在不同發(fā)育階段牦牛睪丸中均有表達(dá)，幼年期為低表達(dá)，其他3個時期為高表達(dá)，其表達(dá)趨勢為隨著年齡變化先升高，后維持在高水平表達(dá)(圖5)。在幼年期牦牛睪丸中PK2蛋白的表達(dá)量顯著低于性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睪丸(P<0.05)，且在性成熟初期、性成熟后期及老年期3組間的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

1.幼年期組；2.性成熟初期組；3.性成熟后期組；4.老年期組

圖5 PK2蛋白在牦牛睪丸發(fā)育各階段中的表達(dá)

3 討論

PK2在哺乳動物睪丸、前列腺組織中均有表達(dá)并參與維持其正常的生理功能[13]。XIN等[14]建立了PK2敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)敲除PK2后的小鼠基本上喪失了生育能力，雄鼠的睪丸發(fā)育障礙；MATSUMOTO等[15]提出敲除PK2的雄性小鼠因GnRH分泌異常導(dǎo)致生精小管缺乏管腔、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞缺失；SAMSON等[16]認(rèn)為,PK2有助于調(diào)節(jié)睪丸內(nèi)外激素的運輸，故PK2的缺失會對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生直接損害，而且也可通過影響激素的分泌及運輸過程使其出現(xiàn)障礙。WECHSELBER等[17]指出，PK2 mRNA的表達(dá)主要局限于睪丸，且通過原位雜交表明，其主要表達(dá)于第Ⅶ～Ⅸ期的初級精母細(xì)胞。鄭加翠[18]指出，PK2蛋白主要表達(dá)在人睪丸間質(zhì)細(xì)胞中。而在本試驗中發(fā)現(xiàn)1歲幼年期牦牛睪丸中已經(jīng)可以出現(xiàn)各級生精細(xì)胞，這與朱俊峰等[19]的試驗結(jié)果相符。IHC結(jié)果顯示，PK2蛋白在幼年期牦牛睪丸內(nèi)主要表達(dá)在精子細(xì)胞及精子中，而在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睪丸中除在精子中表達(dá)外，也在其他各級生精細(xì)胞中表達(dá)，這與鄭加翠等的研究結(jié)果不一致。LECOUTER等[10]指出，缺氧可誘導(dǎo)PK2的表達(dá)量上調(diào)；同時，WECHSELBER等[17]推測，PK2蛋自儲存在精母細(xì)胞中，只在成熟精子中發(fā)揮作用，PK2蛋白在不同動物睪丸中表達(dá)部位不一致的主要原因可能是由于物種差異引起，但具體的原因仍需進(jìn)一步研究。

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在幼年期及性成熟初期牦牛睪丸中PK2 mRNA表達(dá)水平較低，而在性成熟后期及老年期牦牛睪丸組織中表達(dá)水平較高，表明其mRNA表達(dá)水平與性成熟程度密切相關(guān)。有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在小鼠出生2周后，睪丸開始產(chǎn)生初級精母細(xì)胞，此時僅能檢測到少量PK2 mRNA的表達(dá)[17]；而出生3周后的小鼠睪丸開始出現(xiàn)粗線期晚期和雙倍體期的精母細(xì)胞，此時睪丸中PK2 mRNA表達(dá)水平顯著升高，此后一直處于高水平表達(dá)[17]，這與本研究結(jié)果趨勢相符。本試驗結(jié)果表明，PK2蛋白在不同階段牦牛睪丸中表達(dá)趨勢與其mRNA表達(dá)趨勢大體相同，即在幼年期低表達(dá)，性成熟后期及老年期高表達(dá)。值得注意的是在性成熟初期時PK2蛋白表達(dá)量已經(jīng)達(dá)到較高水平，而PK2 mRNA在同時期仍處于較低水平。近年來基因組計劃研究表明，基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中絕大多數(shù)為非編碼RNA，按功能可分為調(diào)節(jié)性非編碼RNA及非調(diào)節(jié)性非編碼RNA[20]。LncRNA作為非編碼RNA的一種，可通過堿基互補配對抑制或者上調(diào)mRNA的表達(dá)水平，從而參與機體生理與病理過程的調(diào)節(jié)[21]。楊花等[22]提出，在性成熟前后湖羊的 53 個差異表達(dá) lncRNA 對雄性生殖和睪丸發(fā)育具有潛在作用。何其杰等[23]發(fā)現(xiàn)，存在于大足黑山羊睪丸支持細(xì)胞中的1ncRNA WNT3-IT，可以通過正向調(diào)控支持細(xì)胞中WNT3的表達(dá)，調(diào)節(jié)支持細(xì)胞在G0/G1期增殖活性，進(jìn)而影響支持細(xì)胞的增殖能力，并在睪丸發(fā)育后期的精子發(fā)生與支持細(xì)胞分化過程中起重要作用。在性成熟初期牦牛睪丸組織中PK2 mRNA與蛋白可能與WNT3蛋白存在相同或類似的生理作用，但具體的機制仍需進(jìn)一步確定。

LECOUTER等[10]以腺病毒為載體，將PK2遞送到小鼠睪丸導(dǎo)致了明顯的血管生成反應(yīng)。PK2已被確定為是一種有效的血管生成因子，可以通過Gaq/Ga13信號通路促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并在一定程度上調(diào)節(jié)睪丸的生殖功能[18,24]；由于PK2基因的表達(dá)模式與睪丸的成熟密切相關(guān)[17]，且在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睪丸中精子與血管生成趨于穩(wěn)定[25]，PK2在性成熟后期及老年期的高表達(dá)量在此得到了驗證。此外，WECHSELBER 等[17]提出 PK2可能在減數(shù)分裂和精子形成前的最后一次DNA復(fù)制中起自分泌或旁分泌信號分子的作用；LI等[6]指出,PK2/PKR1信號通路在生理條件下與精子發(fā)生有關(guān)，并推測PK2可能在精子成熟時進(jìn)行蛋白水解并釋放，同時參與精子形成最后階段的生理過程。由此推測PK2在牦牛睪丸的發(fā)育過程中起著重要作用，但其具體參與的生理過程及其機制仍需進(jìn)一步的探索。

PK2在各發(fā)育階段的牦牛睪丸組織中均有表達(dá)，且在幼年期牦牛睪丸中主要表達(dá)在精子細(xì)胞及精子中，在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睪丸中也表達(dá)于初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞中。PK2蛋白及mRNA表達(dá)量隨牦牛年齡變化而呈現(xiàn)先升高并維持在較高水平的趨勢，即在幼年期處于低表達(dá)水平，而在性成熟后期及老年期的牦牛睪丸組織中維持在高表達(dá)水平，僅在性成熟初期中其mRNA與蛋白的表達(dá)量不同，提示PK2參與了牦牛睪丸的發(fā)育過程，促進(jìn)了精子的發(fā)生，為后期研究其在牦牛睪丸中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。