朱嘉皓， 蘆婷， 鐘良軍，2

1. 杭州師范大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州（310000）； 2. 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，浙江 杭州（310000）

牙周炎是以細(xì)菌感染引起的牙周組織破壞為特征的疾病，患病率高達(dá)45% ～50%，作為最嚴(yán)重的一種疾病影響著世界11.2%的人口，是第六大最常見的人類疾?。?］。已有研究顯示牙周局部免疫反應(yīng)在牙周炎的進(jìn)展過程中起到重要的作用［2］。目前研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫中，輔助性T 淋巴細(xì)胞17和調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞之間的不平衡與牙槽骨吸收以及牙周炎的進(jìn)展相關(guān)［3］。由轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒p3（Forkhead/winged helix transcriptional factor p3，F(xiàn)oxp3）介導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在維持免疫、抑制對(duì)宿主的過度免疫反應(yīng)中具有不可或缺的作用［4］。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是一種動(dòng)態(tài)平衡的生長因子，是組織感染后維持免疫系統(tǒng)平衡及協(xié)調(diào)組織修復(fù)的細(xì)胞因子［5］。白細(xì)胞介素35（interleukin-35，IL-35）作為一種新型抗炎因子，由EB 病毒誘導(dǎo)基因3（Epstein-Barrvirus-induced gene 3，EBI3）和白細(xì)胞介素12p35亞基（interleukin-12p35，IL-12p35）的異源二聚體構(gòu)成，具有抑制輔助性T 淋巴細(xì)胞17 細(xì)胞活化作用［6-7］。IL-35 亞基EBI3 能促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化，同時(shí)能促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的B 細(xì)胞活化，在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）能激活成熟的破骨細(xì)胞，在炎癥發(fā)生過程中具有重要的作用［9］，F(xiàn)oxp3 在細(xì)胞中的表達(dá)受TGF-β1 調(diào)節(jié)［10］，TGF-β1 與EBI3 在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞免疫炎癥抑制中相關(guān)［11］，但在人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs）中的研究尚屬空白。牙周炎所帶來的局部免疫反應(yīng)可對(duì)全身健康產(chǎn)生影響，故Foxp3 和EBI3可能是對(duì)牙周炎癥控制的重要靶點(diǎn)［12］。本實(shí)驗(yàn)利用牙齦卟啉單胞菌來源脂多糖（lipopolysaccharide fromPorphyromonas gingivalis，Pg-LPS）模擬炎癥環(huán)境，探索TGF-β1 對(duì)于牙周炎癥抑制作用機(jī)制，從細(xì)胞水平探究TGF-β1 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的hPDLFs 增殖、遷移、細(xì)胞周期及IL-6、IL-35 亞基EBI3、Foxp3 的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

hPDLFs 細(xì)胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司，中國）；DMEM 高糖型培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；青霉素-鏈霉素雙抗液（Gibco，美國）；實(shí)時(shí)定量PCR 引物（上海生工生物工程有限公司，中國）；CCK-8 試劑盒（碧云天，中國）；IL-6 一抗、EBI3 一抗、Foxp3 一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔二抗以及Vinculin 一抗（愛博泰克，中國）；小鼠波形蛋白抗體（碧云天，中國）；小鼠廣譜細(xì)胞角蛋白抗體（碧云天，中國）；DAB 顯色試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（碧云天，中國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，美國）；Transwell 小室（Corning，美國）；牙齦卟啉單胞菌來源脂多糖（Invitrogen，美國）；重組人TGF-β1 蛋白（MCE，美國）；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma 311，Thermo，美國）；倒置顯微鏡（CKX53，Olympus，日本）；高速臺(tái)式離心機(jī)（Megafuge 1.0R，Heraeus，德國）；實(shí)時(shí)定量PCR 儀（StepOne PlusTM，ABI，美國）；Bio-RAD 凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc MP，Bio-Rad，美國）；流式細(xì)胞分析儀（CytoFLEX Beckman Coulter，美國）；多功能酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，Thermo，美國）。

1.2 方法

1.2.1 hPDLFs 的鑒定與培養(yǎng) 購買商品化人牙周膜成纖維細(xì)胞系，獲得細(xì)胞后傳代培養(yǎng)，利用免疫組化法對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將第四代細(xì)胞消化離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)為3.0 × 104個(gè)/mL，將細(xì)胞均勻鋪至6 孔板內(nèi)，標(biāo)為抗波形絲蛋白組、抗角蛋白組及陰性對(duì)照組，待細(xì)胞爬至60% ～70%時(shí)，取出細(xì)胞爬片，以4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%Tritonx-100 處理爬片10 min，經(jīng)PBS 沖洗，室溫下封閉過氧化氫酶，10%正常山羊血清封閉15 min，孵育一抗為鼠抗人波形絲蛋白與鼠抗人角蛋白抗體4 ℃過夜，孵育二抗HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，DAB 顯色，復(fù)染，封片觀察鏡下爬片情況并拍照記錄。

將hPDLFs 培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，放置5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量生長至占培養(yǎng)皿面積90%時(shí)，使用0.25%胰酶以1∶3 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選擇生長狀態(tài)良好的4 ～6 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR 與CCK-8 法篩選Pg-LPS 炎癥刺激濃度 取生長狀態(tài)良好的4 ～6 代hPDLFs 培養(yǎng)于T25 培養(yǎng)瓶中，生長至占培養(yǎng)皿面積90%后分別接種于6 孔板和96 孔板中。將Pg-LPS 凍干粉在超凈工作臺(tái)中用含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基倍比稀釋成1、10、100 μg/mL 的Pg-LPS 完全培養(yǎng)基，只含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。加入含Pg-LPS 的培養(yǎng)基后誘導(dǎo)3 d，收集細(xì)胞，Trizol 法抽提總RNA，去除DNA 污染，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，獲得cDNA，按照BeyoFastTM SYBR GreenqPCR Mix（2X）說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，檢測(cè)IL-6 mRNA 表達(dá)量確定Pg-LPS 濃度。設(shè)置無TGF-β1 的單純Pg-LPS 組，取生長狀態(tài)良好的4 ～6 代hPDLFs，將其在T25 瓶中培養(yǎng)至占培養(yǎng)皿面積90%，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以2 × 103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換含1、10、100 μg/mL 的Pg-LPS 完全培養(yǎng)基，將96 孔板中各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、24、48、72 h 對(duì)各組細(xì)胞每孔加入CCK-8試劑10 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱放置2 h后檢測(cè)450 nm處吸光度OD 值。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)1.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以100 μg/mL濃度的Pg-LPS 作為模擬炎癥刺激因素，將實(shí)驗(yàn)分成4 組：①對(duì)照組，單純100 μg/mLPg-LPS；②低濃度組，1 ng/mL TGF-β1＋100 μg/mLPg-LPS；③中濃度組，10 ng/mL TGF-β1＋100 μg/mLPg-LPS；④高濃度組100 ng/mL TGF-β1＋100 μg/mLPg-LPS。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取生長狀態(tài)良好的4 ～6 代hPDLFs，在T25 瓶中培養(yǎng)至占培養(yǎng)皿面積90%，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以2 × 103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換含100 μg/mL的Pg-LPS 完全培養(yǎng)基，并調(diào)整至1.2.3 分組濃度，各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、24、48、72 h對(duì)各組細(xì)胞每孔加入CCK-8試劑10 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱放置2 h 后檢測(cè)450 nm 處吸光度OD 值。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)：取生長良好的hPDLFs，在T25 瓶中培養(yǎng)至占培養(yǎng)皿面積90%，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以2 × 105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞生長至90%以上時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基，并調(diào)整至1.2.3 分組濃度。用100 μL 的加樣槍頭劃出無細(xì)胞區(qū)，在劃痕后0、6、12、24 h 拍照，使用Image J 軟件測(cè)量劃痕面積，同時(shí)計(jì)算細(xì)胞愈合面積。

Transwell 小室實(shí)驗(yàn)：取生長良好的hPDLFs，以5 × 104個(gè)/孔接種到Transwell 小室的上室，下室加入含各組相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基，孵育箱中培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，無菌PBS 沖洗3 遍后，用棉簽拭去未遷移的細(xì)胞。甲醛固定20 min 后結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取3 個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，觀察各組之間的差別，并計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取生長良好的4 ～6 代hPDLFs 培養(yǎng)于T25 培養(yǎng)瓶中，生長至占培養(yǎng)皿面積90%進(jìn)行鋪板，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以2×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，待24 h 細(xì)胞貼壁后，更換含100 μg/mL 的Pg-LPS 完全培養(yǎng)基，并調(diào)整至1.2.3分組濃度。刺激72 h 后收集各組細(xì)胞，70%乙醇固定細(xì)胞，-20 ℃過夜，根據(jù)細(xì)胞周期試劑盒說明書，對(duì)細(xì)胞孵育染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞G0-G1 期、S 期、G2-M 期比例。

1.2.7 qRT-PCR 檢測(cè)hPDLFs 中IL-6、EBI3 及Foxp3的表達(dá) 取生長良好的4 ～6 代hPDLFs 培養(yǎng)于T25培養(yǎng)瓶中，生長至占培養(yǎng)皿面積90%進(jìn)行鋪板，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以2 × 105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，待24 h 細(xì)胞貼壁后，更換含100 μg/mL 的Pg-LPS完全培養(yǎng)基，并調(diào)整至1.2.3 分組濃度。刺激72 h后收集各組細(xì)胞，Trizol 法抽取各組細(xì)胞總RNA，去除DNA 污染，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，獲得cDNA，按照BeyoFastTMSYBR GreenqPCR Mix（2X）說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃（10 min）預(yù)變性后，95 ℃（5 s）→60 ℃（20 s）→72 ℃（10 s）共40 個(gè)循環(huán)。PCR 引物序列見表1，18sRNA 作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)化，采用2-ΔΔCt方法分析相關(guān)mRNA 的表達(dá)量。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.8 Western blot 檢 測(cè)hPDLFs 中IL-6、EBI3 及Foxp3 蛋白的表達(dá) 取生長良好的4 ～6 代hPDLFs培養(yǎng)于T25 培養(yǎng)瓶中，生長至占培養(yǎng)皿面積90%進(jìn)行鋪板，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以2 × 105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，待24 h 細(xì)胞貼壁后，更換含100 μg/mL 的Pg-LPS 完全培養(yǎng)基，并調(diào)整至1.2.3 分組濃度。刺激72 h 后收集各組細(xì)胞，將收集的細(xì)胞用PBS 沖洗3 次，加RIPA 裂解液提取細(xì)胞蛋白，離心后取上清加入PMSF 與Loading Buffer，金屬浴95 ℃10 min 變性處理，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，恒壓40 V 至指示劑進(jìn)入分離膠后，轉(zhuǎn)150 V 電泳至結(jié)束，在低溫恒流300 mA 環(huán)境下濕轉(zhuǎn)2 h 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，IL-6、EBI3、Foxp3、Vinculin 一抗1∶1 000 稀釋，4 ℃下?lián)u床孵育過夜，以TBST 溶液清洗3 次，20 min/次，以辣根酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）稀釋液室溫孵育1 h，TBST 溶液清洗3 次，15 min/次，將ECL 顯色液均勻地滴在PVDF 膜上，再將PVDF 膜放置于BIO-RAD 儀中曝光顯影。將目的蛋白灰度值與內(nèi)參（Vinculin）灰度值用Image J軟件分析成像結(jié)果，進(jìn)行IL-6、EBI3 和Foxp3 蛋白定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異使用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用SNK-q法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLFs 免疫組化鑒定

光學(xué)顯微鏡下見抗波形絲蛋白組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均勻分布棕黃色陽性顆粒，細(xì)胞核呈藍(lán)色；抗角蛋白組可見細(xì)胞梭形輪廓外形，但胞質(zhì)內(nèi)未見顏色改變，僅細(xì)胞核染呈藍(lán)色（圖1），說明細(xì)胞來源中胚層。

圖1 hPDLFs 免疫組化鑒定Figure 1 Immunohistochemical identification of hPDLFs

2.2 不同濃度Pg-LPS 對(duì)hPDLFs 的細(xì)胞增殖以及IL-6 mRNA 表達(dá)的影響

在細(xì)胞鋪板48 h 后，1、10、100 μg/mLPg-LPS組抑制hPDLFs 的增殖（圖2，F(xiàn)= 5.091，P＜0.05；q1-0= 4.477，q10-0= 4.740，q100-0= 4.273，P＜0.05）；在72 h，1、10、100 μg/mLPg-LPS 組進(jìn)一步抑制hPDLFs 的增殖（F= 23.72，P＜0.0001；q1-0= 9.628，q10-0= 9.272，q100-0= 10.23，P＜0.0001）。

與空白對(duì)照組相比，隨Pg-LPS 濃度的遞增，炎癥因子IL-6 的mRNA 的表達(dá)量逐漸上升（圖2），其中當(dāng)Pg-LPS 濃度為100 μg/mL 時(shí)，IL-6 mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著上升（F= 122.9，P＜0.001；q100-0= 26.57，P＜0.000 1），故選擇100 μg/mLPg-LPS 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用濃度，用于模擬炎癥狀態(tài)。

圖2 不同濃度Pg-LPS 對(duì)hPDLFs 的細(xì)胞增殖以及IL-6 mRNA 表達(dá)的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Pg-LPS on IL-6 mRNA expression and cell proliferation in hPDLFs

2.3 TGF-β1 對(duì)100 μg/mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs增殖的影響

與空白對(duì)照組相比，1、10、100 ng/mL 的TGF-β1在24、48 h 時(shí)對(duì)含Pg-LPS 的hPDLFs 的增殖結(jié)果無明顯改變；在72 h 時(shí)，10、100 ng/mL TGF-β1 對(duì)hPDLFs 的增殖效果相對(duì)于空白對(duì)照組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，F(xiàn)= 34.38，P＜0.000 1；q10-0=11.70，q100-0= 11.49，P＜0.05），表明10、100 ng/mL TGF-β1 在炎癥狀態(tài)下可提高細(xì)胞增殖情況。

圖3 不同濃度TGF-β1 對(duì)100 μg /mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs 增殖的影響Figure 3 Effects of different concentrations of TGF-β1 on the proliferation of hPDLFs stimulated with 100 μg/mL Pg-LPS

2.4 TGF-β1 對(duì)100 μg/mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs遷移能力的影響

2.4.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 通過顯微鏡對(duì)4 組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移能力的觀察，計(jì)算4 組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的愈合面積比例（圖4）。在6 h 時(shí)，與空白對(duì)照組相比，1、10、100 ng/mL TGF-β1 組的細(xì)胞劃痕愈合面積均無明顯差異；而在12 h，1、10、100 ng/mL TGF-β1 組相對(duì)于空白對(duì)照組劃痕愈合面積升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=93.38，P＜0.000 1；q1-0=13.05，q10-0=13.38，P＜0.005；q100-0= 23.37，P＜0.000 1）。

圖4 不同濃度TGF-β1 對(duì)100 μg/mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs 劃痕實(shí)驗(yàn)愈合面積的比較Figure 4 Comparison of the experimental scratch assay area of hPDLFs stimulated with 100 μg/mL Pg-LPS and different concentrations of TGFβ1

2.4.2 Transwell 小室實(shí)驗(yàn) 顯微鏡下觀察下室中4 組遷移的細(xì)胞（圖5），結(jié)果顯示在細(xì)胞鋪板24 h后，與空白對(duì)照組相比，1、10、100 ng/mL TGF-β1 組的遷移細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 138.5，P＜0.000 1；q1-0= 5.212，P＜0.05；q10-0= 18.49，q100-0=25.56，P＜0.000 1），隨TGF-β1 的濃度增高，hPDLFs的遷移能力逐漸增強(qiáng)。

圖5 不同濃度TGF-β1 對(duì)100 μg /mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs 遷移細(xì)胞數(shù)的比較Figure 5 Comparison of migrating cell numbers of hPDLFs stimulated by 100 μg/mL Pg-LPS with different concentrations of TGF-β1

2.5 TGF-β1 對(duì)100 μg/mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs細(xì)胞周期的影響

1、10、100 ng/mL TGF-β1 組可加快炎癥狀態(tài)下的hPDLFs 細(xì)胞進(jìn)程（圖6），與空白對(duì)照組相比，1、10、100 ng/mL TGF-β1 組G0-G1 期細(xì)胞百分率明顯減少（F= 214.7，P＜0.000 1；q1-0= 26.65，q10-0=29.02，q100-0= 31.45，P＜0.000 1），S 期細(xì)胞百分率明顯增加（F= 432.4，P＜0.000 1；q1-0= 35.26，q10-0=37.05，q100-0= 47.89，P＜0.000 1）；100 ng/mL TGF-β1組的G2-M 期細(xì)胞百分率降低（F= 9.319，P＜0.05；q100-0= 5.997，P＜0.05）。

圖6 不同濃度TGF-β1 對(duì)100 μg /mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs 細(xì)胞周期進(jìn)程的比較Figure 6 Comparison of cell cycle progression of hPDLFs stimulated with 100 μg/mL Pg-LPS and different concentrations of TGF-β1

2.6 TGF-β1 對(duì)100 μg/mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs 目的基因表達(dá)的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示（圖7）：與空白對(duì)照組相比，1、10、100 ng/mL TGF-β1 組IL-6 mRNA 的表達(dá)量降低（F= 101.4，P＜0.000 1；q1-0= 17.28，q10-0=22.10，q100-0= 19.86，P＜0.000 1）；在TGF-β1 濃度為1 ng/mL 和10 ng/mL 時(shí)，EBI3 mRNA 較 空 白 對(duì) 照 組明顯升高（F= 216.6，P＜0.000 1；q1-0= 28.81，q10-0=24.99，P＜0.000 1）；Foxp3 mRNA 同樣在TGF-β1 濃度為1 ng/mL 和10 ng/mL 時(shí)相對(duì)于空白對(duì)照組升高（F= 11.97，P＜0.05；q1-0= 5.952，q10-0= 4.875，P＜0.05）。

圖7 不同濃度TGF-β1 對(duì)100 μg /mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs 目的基因表達(dá)的比較Figure 7 Comparison of target gene expression in hPDLFs stimulated with 100 μg/mL Pg-LPS and different concentrations of TGF-β1

2.7 TGF-β1 對(duì)100 μg/mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs目的蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示（圖8）：與空白對(duì)照組相比，1、10、100 ng/mL TGF-β1 組IL-6 蛋白的表達(dá)量降低（F= 809.0，P＜0.000 1；q1-0= 53.00，q10-0=58.16，q100-0= 58.79，P＜0.000 1）；在TGF-β1 濃度為1 ng/mL 和10 ng/mL 時(shí)，EBI3 蛋白相比較空白對(duì)照組升高（F= 70.61，P＜0.000 1；q1-0= 9.351，P＜0.001；q10-0= 17.54，P＜0.000 1）；Foxp3 蛋白表達(dá)在TGF-β1 濃度為10 ng/mL 時(shí)相對(duì)于空白對(duì)照組提高（F= 21.22，P＜0.005；q10-0= 7.207，P＜0.05）。

圖8 不同濃度TGF-β1 對(duì)100 μg /mL Pg-LPS 刺激下hPDLFs 目的蛋白表達(dá)的比較Figure 8 Comparison of the expression of target proteins in hPDLFs stimulated with 100 μg/mL Pg-LPS and different concentrations of TGF-β1

3 討 論

牙周炎是一種慢性免疫炎癥性疾病，宿主免疫調(diào)節(jié)在牙周炎發(fā)病過程中有重要作用，EBI3 作為IL-35 亞基的一種分泌型糖蛋白，由調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞表達(dá)，通過gp130/STAT3 信號(hào)通路以自分泌方式促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分化，同時(shí)與IL-12p35 結(jié)合構(gòu)成IL-35 提高炎癥抑制的作用［8］。EBI3 缺失可致炎癥加重，其通過上調(diào)組蛋白乙酰化的表觀遺傳機(jī)制改善炎癥［13］。EBI3 與目標(biāo)蛋白以及伴侶蛋白Calnexin 結(jié)合，促進(jìn)目標(biāo)蛋白正確折疊，提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)，EBI3 與Calnexin 協(xié)同作用可提高抑制性炎癥因子IL-35 的表達(dá)［14］。

Williams 等［15］發(fā)現(xiàn)炎癥發(fā)展和免疫調(diào)節(jié)共存于念珠菌病患者的口腔黏膜，EBI3 與Foxp3 在免疫細(xì)胞中高表達(dá)，這種炎癥發(fā)展和免疫耐受之間的平衡是決定感染發(fā)展的關(guān)鍵，特別是輔助性T 細(xì)胞17 和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的失衡可影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展，調(diào)控調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是牙周炎免疫治療的重要方向，然而在炎癥環(huán)境下局部調(diào)控調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的功能具有不穩(wěn)定性［16］。過往研究顯示EBI3 與Foxp3僅在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞中表達(dá)［17］，hPDLFs 主要特征是產(chǎn)生膠原纖維且具有一定的分化潛能［18］，但在本課題組實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)hPDLFs 中存在EBI3 與Foxp3 的表達(dá)，提示hPDLFs 可能與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞性質(zhì)相似，具有參與免疫反應(yīng)、抑制炎癥的能力，目前該結(jié)果在國內(nèi)外研究中未曾報(bào)道。TGF-β1 是免疫系統(tǒng)中調(diào)控調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的細(xì)胞因子［11］，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索TGF-β1 對(duì)hPDLFs 是否具有調(diào)控作用，結(jié)果表明在炎癥狀態(tài)下，TGF-β1 提高h(yuǎn)PDLFs胞內(nèi)EBI3 和Foxp3 的表達(dá)：TGF-β1 濃度為1 ng/mL和10 ng/mL 時(shí)，EBI3 與Foxp3 的mRNA 表 達(dá)均 明顯上升，兩者具有同步性；EBI3 的蛋白表達(dá)在TGF-β 1 濃 度 為1 ng/mL 和10 ng/mL 時(shí)上升，F(xiàn)oxp3 的蛋白表達(dá)僅在TGF-β1 濃度10ng/mL 時(shí)表達(dá)上升。因?yàn)镕oxp3 的蛋白在內(nèi)毒素刺激下易降解［19］，且Foxp3的蛋白穩(wěn)定性依賴于Foxp3 乙酰化程度，IL-6 的存在一定程度能抑制Foxp3 的乙?；?0］。IL-6 為炎癥細(xì)胞因子，在生理狀態(tài)下在血液和組織中濃度較低，但炎癥反應(yīng)過程中濃度升高，可協(xié)同集落刺激因子促進(jìn)原始骨髓細(xì)胞分化和增殖［9］，IL-6 在血液及組織細(xì)胞中的水平越高代表炎癥程度越重。本研究表明hPDLFs 在炎癥狀態(tài)下，加入TGF-β1 后IL-6 的mRNA 和蛋白表達(dá)與無TGF-β1 相比均下降，表明TGF-β1 有抑制hPDLFs 炎癥因子表達(dá)的作用，TGF-β1 調(diào)控hPDLFs 中EBI3 與Foxp3 的表達(dá)從而降低炎癥是一種全新的抑炎機(jī)制，可作為牙周炎免疫治療新的研究體系。

Koidou 等［21］研究表明牙周炎治療后，齦溝液中TGF-β1 的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)組織愈合。龍晏等［22］發(fā)現(xiàn)無炎癥的情況下10 ng/mL TGF-β1 具有促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞增殖和遷移的能力，且該作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系［23］。因此本實(shí)驗(yàn)以10 ng/mL 為參考，設(shè)置濃度梯度探索在炎癥狀態(tài)下TGF-β1 是否仍具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的能力，結(jié)果表明炎癥狀態(tài)下hPDLFs 的增殖隨TGF-β1 的濃度增高而增加，遷移能力隨TGF-β1 的濃度增高而增加，Pg-LPS 抑制hPDLFs 向S 期、G2-M 期進(jìn)展，將細(xì)胞周期阻滯于G0-G1 期，而TGF-β1 可以改善這一過程。

本實(shí)驗(yàn)證明TGF-β1 可促進(jìn)炎癥狀態(tài)下hPDLFs的增殖及遷移能力，且能顯著降低IL-6 的表達(dá)；濃度為1 ng/mL 和10 ng/mL 時(shí)，EBI3 上調(diào)，抑制炎癥進(jìn)程，此過程可能與轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

【Author contributions】Zhu JH and Lu T peformed the experiments, analyzed the data, and wrote the article. Zhu JH and Zhong LJ designed the study and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.