毛祖元， 陳倩， 邸新晏， 陳梅， 王曉菲， 趙芳明， 凌英華

西南大學(xué) 水稻研究所/轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715

粒型是水稻的重要農(nóng)藝性狀,既是產(chǎn)量的重要組成部分,也是外觀品質(zhì)的決定因素之一.其形態(tài)是一個(gè)復(fù)合性狀,主要是由粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比及粒厚決定,受多基因調(diào)控[1].Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//archive.gramene.org/qtl/)中收錄的水稻籽粒相關(guān)性狀的QTLs已超過(guò)560個(gè),其中部分基因的遺傳機(jī)理已經(jīng)被解析.水稻籽粒大小受復(fù)雜遺傳網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控,涉及G蛋白信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、泛素-蛋白酶體通路、植物激素信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等[2-3]．

GS3是通過(guò)G蛋白信號(hào)通路調(diào)控水稻籽粒的QTL,也是在水稻中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)調(diào)控粒長(zhǎng)和粒質(zhì)量的QTL[4],由5個(gè)外顯子組成,編碼產(chǎn)物為跨膜蛋白.序列分析表明,與小粒品種相比,所有大粒品種的第2外顯子均發(fā)生無(wú)義突變,導(dǎo)致GS3蛋白C端178個(gè)氨基酸缺失,造成蛋白翻譯提前終止,表明GS3負(fù)調(diào)控水稻的粒長(zhǎng)和粒質(zhì)量[4-5]．

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一系列細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的組成部分,可對(duì)多種細(xì)胞外刺激做出反應(yīng)[6].研究結(jié)果顯示,MAPK信號(hào)通路參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多方面,MAPK磷酸酶(MAPK phosphatase,MKP)特異性地將激活的MAPK中的磷酸基去除,從而使其失活[6].通過(guò)對(duì)OsMKK10功能缺失突變體、過(guò)表達(dá)株系和OsMKK4功能獲得突變體的研究表明，OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK6級(jí)聯(lián)信號(hào)通路調(diào)控水稻籽粒大小[7]．

GW2編碼一個(gè)環(huán)形E3泛素連接酶,通過(guò)泛素-蛋白酶體通路負(fù)向調(diào)控細(xì)胞分裂,影響水稻粒寬和粒質(zhì)量[8].OsARF19由生長(zhǎng)素和BR共同誘導(dǎo),通過(guò)植物激素調(diào)控水稻籽粒大小,OsARF19與BR受體基因OsBR11的啟動(dòng)子結(jié)合,直接影響OsBR11的表達(dá),而過(guò)表達(dá)OsARF19會(huì)導(dǎo)致植物表現(xiàn)出矮稈、窄葉、癟粒和葉片角度增大[9].GLW7編碼植物轉(zhuǎn)錄因子OsSPL13,正向調(diào)控穎殼細(xì)胞的大小,從而造成籽粒的長(zhǎng)度、厚度和質(zhì)量增加[10].GW8是含有SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)水稻籽粒寬度,可直接與GW7啟動(dòng)子結(jié)合,抑制其表達(dá)[11].GS2編碼OsGRF4,是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張來(lái)調(diào)控顆粒大小[12]．

染色體片段代換系(Chromosomal Segment Substitution Line,CSSL)是研究數(shù)量性狀的良好材料[13],能將復(fù)雜的數(shù)量性狀分解成含有少量供體親本代換片段而遺傳背景又與受體親本基本一致的簡(jiǎn)單性狀,從而簡(jiǎn)化技術(shù)難度,提高實(shí)驗(yàn)精度.在前期研究中,我們以日本晴(Nipponbare)為受體親本,優(yōu)良恢復(fù)系R225為供體親本,結(jié)合多代回交、自交以及分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)等方法,培育出了水稻長(zhǎng)寬粒染色體片段代換系Z8.本研究利用日本晴/Z8構(gòu)建的次級(jí)F2分離群體,進(jìn)行重要農(nóng)藝性狀的QTL定位； 同時(shí)基于定位結(jié)果,結(jié)合MAS選育攜帶代換片段更少、遺傳背景更為純合的次級(jí)代換系.相關(guān)研究結(jié)果將為水稻粒長(zhǎng)、粒寬等重要農(nóng)藝性狀的遺傳機(jī)理解析奠定理論基礎(chǔ),并提供必要的材料支撐．

1 材料與方法

1.1 研究材料

水稻染色體片段代換系Z8,是以日本晴(Nipponbare)作為受體親本、優(yōu)良恢復(fù)系R225為供體親本,經(jīng)過(guò)多代回交、自交并結(jié)合MAS法在水稻全基因組水平上選育染色體片段代換系,并運(yùn)用多態(tài)性分子標(biāo)記從BC2F1開(kāi)始進(jìn)行篩選,直到BC3F6選育出來(lái)了1個(gè)含有14個(gè)供體親本染色體片段的代換系．

QTL定位的群體材料是由日本晴/Z8雜交構(gòu)建的150株次級(jí)F2分離群體．

材料于2019年種植在西南大學(xué)歇馬水稻研究所基地,用日本晴與Z8進(jìn)行雜交,收獲F1種子后,同年冬季種植于海南基地,收獲F2種子.2020年3月,將日本晴,Z8和F2(150個(gè)單株)的種子于西南大學(xué)歇馬水稻研究基地進(jìn)行播種； 同年4月,以株距和行距為16.67 cm和26.67 cm分別移栽.2021年3月,將從F2分離群體中選育出來(lái)的23個(gè)次級(jí)代換片段、日本晴和Z8分別種植,每行10株,每個(gè)次級(jí)代換片段和供、受體親本各20株.所有研究材料,包括親本及相應(yīng)的分離群體,均參照當(dāng)?shù)厮痉N植與栽培措施進(jìn)行統(tǒng)一管理．

1.2 研究方法

1.2.1 CSSL-Z8代換片段的鑒定

利用分布在水稻全基因組上的429個(gè)SSR標(biāo)記,對(duì)日本晴與恢復(fù)系R225進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選,共鑒定出253個(gè)多態(tài)性SSR.通過(guò)這些多態(tài)性SSR結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇(MAS),參照王大川等[14]的方法,對(duì)BC2F1進(jìn)行代換片段選擇,直到BC3F6選育出含有供體親本14個(gè)代換片段的長(zhǎng)寬粒染色體片段代換系Z8.連續(xù)的供體親本帶型標(biāo)記區(qū)間認(rèn)為是代換片段,參照Paterson等[15]的方法估算代換片段長(zhǎng)度,用Mapchart 2.3軟件標(biāo)記代換片段在Z8染色體上的分布．

1.2.2 農(nóng)藝性狀考察與表型鑒定

進(jìn)入成熟期后,齊地收割10株日本晴,10株Z8以及150個(gè)F2單株,參照韓龍植等[16]的方法,對(duì)粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比、株高、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、千粒質(zhì)量、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、單株產(chǎn)量和著粒密度等14個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行表型鑒定.收集所有性狀的表型數(shù)據(jù),利用Microsoft-Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖．

1.2.3 籽粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

取灌漿期幼嫩的水稻籽粒,利用日立SU350型掃描電鏡在-20 ℃環(huán)境下觀察日本晴和Z8穎殼外表皮細(xì)胞并拍照,每個(gè)材料重復(fù)10次,測(cè)量其細(xì)胞長(zhǎng)度和寬度并對(duì)細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差,并通過(guò)t測(cè)驗(yàn)比較Z8與日本晴之間的差異．

1.2.4 QTL定位

通過(guò)日本晴/Z8構(gòu)建的次級(jí)F2分離群體開(kāi)展目標(biāo)性狀的QTL定位.參照McCouch等[17]的方法提取親本和150個(gè)F2單株的DNA,參考王大川等[14]的方法鑒定所有材料的基因型.結(jié)合目標(biāo)性狀的表型鑒定,通過(guò)SAS(SAS Institute Inc. 2009)軟件,利用限制性最大似然(REML)法進(jìn)行QTL定位,以p<0.01為閾值判斷染色體片段上是否存在QTL位點(diǎn)[18]．

1.2.5 次級(jí)代換片段選育

基于QTL定位結(jié)果,并結(jié)合表型與基因型,從F2分離群體中篩選出23個(gè)單株自交,2021年將自交后代種成株系,并重新編號(hào),其中雙片段代換系2個(gè),三片段代換系4個(gè),四片段代換系3個(gè)以及五片段及以上的代換系14個(gè),受體親本、供體親本以及各個(gè)株系各種植20株,利用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)技術(shù)進(jìn)一步對(duì)該株系進(jìn)行篩選,選育單、雙和三片段代換系,為研究目標(biāo)性狀上單基因的加性效應(yīng)和多基因間的上位性效應(yīng)提供了研究基礎(chǔ)．

2 結(jié)果與分析

2.1 Z8的表型鑒定與籽粒穎殼的細(xì)胞學(xué)分析

表型鑒定結(jié)果顯示(表1),與日本晴相比,Z8的粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比、株高、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、千粒質(zhì)量、著粒密度和每穗總粒數(shù)等9個(gè)農(nóng)藝性狀,分別增加了1.18 mm,0.17mm,0.23,8.78 cm,2.92,8.13,3.09 g,32.48和36.95,均顯著或極顯著高于受體日本晴(圖1a-c).Z8的有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)和結(jié)實(shí)率比日本晴分別減少了2.80,3.41 cm和21.32%(p<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 而每穗實(shí)粒數(shù)和單株產(chǎn)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

由于Z8的籽粒長(zhǎng)度和寬度較日本晴都有所增加,為了解其粒型變化的原因,利用日立SU350型掃描電鏡在-20 ℃環(huán)境下觀察日本晴和Z8孕穗期外穎殼表皮細(xì)胞.結(jié)果表明,Z8外穎殼表皮細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度較日本晴分別增加了33.14 μm和5.20 μm(p<0.01),而細(xì)胞數(shù)目則減少了3.4個(gè)(p<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1d-h),表明Z8籽粒長(zhǎng)度和寬度的增加是由于籽粒外穎殼細(xì)胞橫向和縱向膨脹導(dǎo)致的．

表1 日本晴與Z8重要農(nóng)藝性狀

**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖1 日本晴和Z8的表型及外穎殼表皮細(xì)胞掃描電鏡

2.2 Z8代換片段的鑒定

分子鑒定結(jié)果顯示,Z8共攜帶了14個(gè)來(lái)自供體親本R225的片段,分別位于第1～3,5～9,11,12等10條染色體上,其中第2,7～9等4條染色體上攜帶2個(gè)代換片段(圖2).估算結(jié)果表明,14個(gè)代換片段總長(zhǎng)度為117.68 Mb,其中最短代換片段長(zhǎng)度為1.55 Mb,最長(zhǎng)代換片段長(zhǎng)度為23.35 Mb,平均長(zhǎng)度為8.41 Mb(圖2)．

2.3 日本晴/Z8構(gòu)建F2次級(jí)分離群體表型與頻率分布

利用攜帶14個(gè)供體親本代換片段的代換系Z8與受體親本日本晴構(gòu)建的次級(jí)F2分離群體,其農(nóng)藝性狀除株高、有效穗數(shù)、單株產(chǎn)量、每穗實(shí)粒數(shù)和千粒質(zhì)量的均值較親本有所增加或降低外,其余均介于親本之間(表1,表2)．

由于峰度和偏度是衡量正態(tài)分布的兩個(gè)重要參數(shù),當(dāng)符合正態(tài)分布時(shí),峰度值和偏度值分別為3和0,因此利用日本晴/Z8構(gòu)建的次級(jí)F2分離群體,對(duì)其頻率分布進(jìn)行分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn),粒型、株高等14個(gè)重要農(nóng)藝性狀的偏度值(顯示偏離標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的情況,正值為正偏態(tài),負(fù)值為負(fù)偏態(tài))均不為0,峰度值均不為3(表2),表明這些農(nóng)藝性狀均呈現(xiàn)一定的正偏態(tài)或者負(fù)偏態(tài)分布,受多基因控制且基因之間可能存在互作．

每個(gè)染色體的右側(cè)為代換片段長(zhǎng)度和分子標(biāo)記,而左側(cè)為代換片段鑒定出的QTL和標(biāo)記的物理距離,綠色陰影部分代表片段.PH為株高,PN為有效穗數(shù),PL為穗長(zhǎng),NPB為一次枝梗數(shù),NSB為二次枝梗數(shù),SPP為每穗總粒數(shù),SSR為結(jié)實(shí)率,GL為粒長(zhǎng),GW為粒寬,RLW為長(zhǎng)寬比,KGW為千粒質(zhì)量,SSD為著粒密度．圖2 Z8的代換片段(參照粳稻日本晴的基因組)

表2 日本晴/Z8構(gòu)建的次級(jí)F2群體表型

2.4 基于Z8的重要農(nóng)藝性狀QTL定位

利用日本晴/Z8構(gòu)建的次級(jí)F2作為定位群體,對(duì)在日本晴與Z8之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的12個(gè)性狀進(jìn)行QTL定位.結(jié)果顯示,在10個(gè)性狀上一共鑒定到33個(gè)QTL,其中粒長(zhǎng)、粒寬和長(zhǎng)寬比各6個(gè)； 一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和結(jié)實(shí)率各1個(gè)； 每穗實(shí)粒數(shù)2個(gè)； 株高和穗長(zhǎng)各3個(gè)； 千粒質(zhì)量4個(gè)(表3,圖2).所有QTL對(duì)目標(biāo)性狀的表型貢獻(xiàn)率在2.04%～88.67%之間,其中有8個(gè)QTL對(duì)目標(biāo)性狀的表型貢獻(xiàn)率超過(guò)10%(表3)．

表3 Z8代換系攜帶的與水稻粒型相關(guān)性狀QTL

粒長(zhǎng)(GL)檢測(cè)到6個(gè)QTL,其中qGL7-1的表型貢獻(xiàn)率為14.40%,能夠增加粒長(zhǎng)0.08 mm,表現(xiàn)為主效QTL.另5個(gè)則均表現(xiàn)為微效QTL(表型貢獻(xiàn)率小于10%),其中qGL2-1和qGL2-2分別增加粒長(zhǎng)0.06 mm與0.05 mm；qGL1,qGL9和qGL11分別減短粒長(zhǎng)0.04 mm,0.04 mm和0.06 mm,表型貢獻(xiàn)率分別是7.83%,4.44%,3.53%,3.46%和8.53%．

粒寬(GW)檢測(cè)到6個(gè)QTL,均表現(xiàn)為微效,其中qGW7-1,qGW8-2,qGW8-3分別增加粒寬0.02 mm,0.02 mm和0.01 mm；qGW2-4,qGW6和qGW9分別減小粒寬0.03 mm,0.03 mm和0.02 mm,表型貢獻(xiàn)率分別為4.70%,3.41%,3.43%,8.32%,6.81%和4.80%．

長(zhǎng)寬比(RLW)同樣檢測(cè)到6個(gè)QTL,其中qRLW6的表型貢獻(xiàn)率為10.58%,能夠增加長(zhǎng)寬比0.03,表現(xiàn)為主效QTL.另5個(gè)則均表現(xiàn)為微效QTL,其中qRLW2-1,qRLW2-2和qRLW2-4能夠增加籽粒長(zhǎng)寬比0.02；qRLW1和qRLW11則相反,均會(huì)導(dǎo)致水稻籽粒長(zhǎng)寬比降低0.02.這5個(gè)微效QTL對(duì)長(zhǎng)寬比的表型貢獻(xiàn)率分別為5.81%,4.50%,7.68%,7.87%和3.47%．

2.5 基于Z8的次級(jí)代換片段選育

基于QTL定位結(jié)果,結(jié)合MAS選育了含目標(biāo)性狀QTL的雙片段代換系2個(gè)(D1-D2),三片段代換系4個(gè)(T1-T4),四片段代換系3個(gè)(FS1-FS3),五片段代換系5個(gè)(FSL1-FSL5),六片段代換系3個(gè)(SS1-SS3),七片段代換系3個(gè)(SSL1-SSL3),九片段代換系2個(gè)(NS1-NS2)以及十二片段代換系1個(gè)(TSL1).雖然Z8的代換片段較多,沒(méi)有篩選出單片段代換系,不能進(jìn)行QTL的上位性效應(yīng)和加性效應(yīng)研究,但次級(jí)代換片段的篩選進(jìn)一步純化了材料的遺傳背景,為進(jìn)一步研究數(shù)量性狀遺傳機(jī)理提供了豐富理想的材料．

3 討論

本研究鑒定了一個(gè)以日本晴為受體親本,恢復(fù)系R225為供體親本的長(zhǎng)寬粒代換系Z8,其攜帶14個(gè)供體親本代換片段,平均長(zhǎng)度為8.41 Mb.雖然Z8的單株產(chǎn)量無(wú)明顯變化,但株高、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比和千粒質(zhì)量較日本晴分別增加了8.78 cm,2.92,8.13,1.18 mm,0.17 mm,0.23和3.09 g(p<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.因此,長(zhǎng)寬粒CSSL-Z8作為研究材料對(duì)于水稻育種具有重要意義．

根據(jù)QTL定位結(jié)果分析,在Z8染色體代換片段上所檢測(cè)到粒長(zhǎng)QTLs中,qGL1可能與GW5L為等位基因,通過(guò)抑制GSK2的磷酸化活性來(lái)正向調(diào)節(jié)油菜素類(lèi)固醇(BR)表達(dá),從而負(fù)向調(diào)節(jié)籽粒的大小[19]；qGL2-1可能與編碼絲裂原活化蛋白激酶OsMKK4的SMG1[20]為等位基因；qGL2-2,qGL7-1,qGL9和qGL11與前人報(bào)道的OsmiR156i[21],miR1432[22],DEP1[23]和OsGRF8[24]等基因分別位于同一區(qū)間內(nèi).鑒定出的粒寬QTLs中,qGW2-4可能與轉(zhuǎn)錄激活因子AFG1等位,通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞伸長(zhǎng)和增殖相關(guān)的幾個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)籽粒大小[25]；qGW6可能與OsNF-YB9為等位基因,主要在發(fā)育的胚乳中表達(dá),該基因功能缺失會(huì)導(dǎo)致籽粒長(zhǎng)、窄、細(xì)[26]；qGW7-1與蕓苔素內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)的下游信號(hào)分子OsBZR1[27]等位；qGW8-3和qGW9可能與已報(bào)道的SLG[28]/WTG1[29]和OsSPL18[30]/TAF2[31]等基因位于同一區(qū)間內(nèi)．

此外,鑒定出的控制長(zhǎng)寬比的6個(gè)QTL,qRLW1,qRLW2-1,qRLW2-2,qRLW2-4,qRLW6和qRLW11是尚未被報(bào)道的基因,但這些QTLs分別與前面qGL1,qGL2-1,qGL2-2,qGW2-4,qGW6和qGL11位于相同區(qū)間內(nèi),可能這些基因在調(diào)控粒長(zhǎng)、粒寬的同時(shí)還影響了籽粒的長(zhǎng)寬比,表明基因可能存在一因多效的作用.對(duì)于新發(fā)掘的,尤其是主效的QTLs,可進(jìn)一步精細(xì)定位和克隆,為解析這些重要農(nóng)藝性狀形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)．

染色體片段代換系(CSSL)是研究復(fù)雜數(shù)量性狀 QTL 的主要材料之一,除了從供體親本引入的片段外,背景與受體親本幾乎相同,具有消除背景對(duì)繪圖程序影響的獨(dú)特特征[32-33].在本研究中,基于含有14個(gè)代換片段的長(zhǎng)寬粒代換系Z8構(gòu)建的次級(jí)F2的QTL定位結(jié)果,選育出了23個(gè)純合的次級(jí)代換系,進(jìn)一步將控制不同性狀以及相同性狀的不同基因進(jìn)行分解,純化遺傳背景,為進(jìn)一步研究基因間加性效應(yīng)和上位性效應(yīng)提供基礎(chǔ),同時(shí)為精細(xì)定位找明了方向．

4 結(jié)論

本研究鑒定了1個(gè)以日本晴為受體、優(yōu)良恢復(fù)系R225為供體的水稻長(zhǎng)寬粒染色體片段代換系Z8.Z8攜帶14個(gè)來(lái)自R225的染色體片段,平均代換長(zhǎng)度8.41 Mb.通過(guò)日本晴/Z8構(gòu)建的次級(jí)F2分離群體,共鑒定出33個(gè)控制粒長(zhǎng)、粒寬等10個(gè)農(nóng)藝性狀的QTL,其中有8個(gè)QTL對(duì)目標(biāo)性狀的表型貢獻(xiàn)率超過(guò)10%,表現(xiàn)為主效位點(diǎn).在QTL定位基礎(chǔ)上,結(jié)合MAS選育了含目標(biāo)QTL的雙片段代換系2個(gè)(D1-D2),三片段代換系4個(gè)(T1-T4),四片段代換系3個(gè)(FS1-FS3),五片段代換系5個(gè)(FSL1-FSL5),六片段代換系3個(gè)(SS1-SS3),七片段代換系3個(gè)(SSL1-SSL3),九片段代換系2個(gè)(NS1-NS2)以及十二片段代換系1個(gè)(TSL1).目標(biāo)性狀的QTL定位以及次級(jí)代換片段系的選育,為進(jìn)一步研究目標(biāo)性狀的遺傳機(jī)理提供了良好的理論參考和材料支撐．