朱洪慧， 李映姿， 王成洋， 高遠(yuǎn)卓， 林泓， 晏紫儀， 李云峰

西南大學(xué) 水稻研究所/農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715

水稻是世界上最重要的糧食作物之一,其產(chǎn)量與世界糧食安全問題息息相關(guān).水稻產(chǎn)量由單位面積有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)以及千粒質(zhì)量決定,其中,由籽粒長、寬、厚決定的籽粒形態(tài)可以通過影響千粒質(zhì)量進(jìn)而影響水稻產(chǎn)量．

近年來,與水稻籽粒形態(tài)發(fā)育相關(guān)的基因逐漸被克隆,遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也逐漸完善.在已克隆出的粒型發(fā)育基因中,GW2,GW5/GSE5,GS5,GW8和TGW2等基因主要控制粒寬,其中GW2編碼一個RING-like E3泛素連接酶,通過將底物錨定到蛋白酶體進(jìn)行降解,從而負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂,突變后增加了穎殼細(xì)胞的數(shù)目,導(dǎo)致粒寬和粒質(zhì)量增加[1].GW5/GSE5編碼一個鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,是BR信號傳導(dǎo)的正調(diào)控因子,通過影響穎殼的細(xì)胞數(shù)目來控制粒型； 其與OsGSK2互作,抑制GSK2的自磷酸化及GSK2對OsBZR1和DLT的磷酸化,從而影響細(xì)胞核中未磷酸化的OsBZR1和DLT蛋白的積累[2-3].GW8編碼一個包含SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子OsSPL16,該基因的高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞分裂和灌漿從而促進(jìn)水稻粒寬增加和增產(chǎn)； 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)GW8/OsSPL16直接與GW7啟動子結(jié)合并抑制它的表達(dá),從而增加橫向細(xì)胞分裂正向調(diào)控水稻粒寬[4-6].GS3,TGW6,OsLG3,GLW7,GL4,qGL3/GL3.1,qLGY3/OsLG3b,TGW3和GL6等基因主要控制粒長,其中GS3編碼非典型的G γ亞基,與DEP1或GGC2競爭性結(jié)合Gβ亞基,負(fù)向調(diào)控籽粒長度[7-8].GLW7編碼SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子OsSPL13,正向調(diào)控穎殼細(xì)胞的擴(kuò)展,從而提高了水稻的粒長和產(chǎn)量[9].OsLG3編碼AP2/ERF類乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白,通過促進(jìn)細(xì)胞增殖正向調(diào)控粒長,且在不影響稻米品質(zhì)的情況下提高水稻產(chǎn)量[10].GL2/GS2,GL7/GW7,GW6a和GS9等基因同時控制粒長和粒寬,其中GL2/GS2編碼的轉(zhuǎn)錄因子OsGRF4屬于GRF家族蛋白成員,主要通過促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)張和少量細(xì)胞增殖正調(diào)控籽粒大小[11-12].GL7/GW7編碼一個TONNEAU1募集基序蛋白,表達(dá)量上調(diào)能增加穎殼細(xì)胞的縱向分裂并減少橫向分裂[8].GW6a編碼一個具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的類GNAT蛋白OsglHAT1,通過增加細(xì)胞數(shù)和增大穎殼,同時加速籽粒灌漿速率,正向調(diào)控籽粒大小和粒質(zhì)量[13].綜上,參與水稻籽粒大小調(diào)控的基因較多,涉及了多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生化代謝途徑．

本研究報道了一個與水稻籽粒發(fā)育相關(guān)的突變體,主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖與細(xì)胞擴(kuò)展異常導(dǎo)致的籽粒變小.遺傳分析表明該突變性狀受1個單隱性基因控制,我們將其命名為small grain 2(smg2).通過BSA法,我們將SMG2定位在水稻第1染色體上IN/DEL標(biāo)記A-0.85和A-1.05之間,物理距離大約為200 kb.測序發(fā)現(xiàn)定位區(qū)間內(nèi)編號LOC_Os01g02890基因的第1個外顯子上第153位堿基胞嘧啶(C)缺失,從而導(dǎo)致移碼突變和蛋白翻譯提前終止,最終將候選基因定為LOC_Os01g02890.本研究為SMG2基因后續(xù)調(diào)控籽粒形態(tài)發(fā)育的分子機(jī)制解析奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻smg2突變體來源于甲基磺酸乙酯(EMS)誘導(dǎo)的西大1B(XD1B)誘變?nèi)后w,經(jīng)過多代自交進(jìn)行分離純化后,突變性狀得到穩(wěn)定遺傳.選用粳稻品種中花11(ZH11)與smg2突變體雜交,播種雜交產(chǎn)生的F1種子,F1群體自交,得到分離群體F2的種子并播種,將F1和F2群體用作進(jìn)行遺傳分析和基因定位的材料．

1.2 形態(tài)與組織學(xué)分析

挑取野生型和smg2突變體成熟期的籽粒,用掃描電鏡(日立SU3500,日本株式會社)和體視鏡(NIKON SM1500,NIKON CORPORATION Shlnagawa Interclty Tower C,2-15-3,Konan,Minato-ku,Tokyo 108-6290 Japan)觀察表型并拍照.在抽穗期選取野生型和突變體的小穗,置于FAA固定液(50%無水乙醇,0.9 mol/L的冰乙酸和 3.7%甲醛)中4 ℃,16 h以上固定細(xì)胞形態(tài)； 后依次使用乙醇進(jìn)行梯度脫水,二甲苯進(jìn)行透明處理并浸蠟,用石蠟包埋處理.使用石蠟切片機(jī)切出12 μm厚的蠟帶,輕挑蠟帶平放于載玻片上,經(jīng)過展片、烘片后,進(jìn)行染色并用中性樹脂封片,用光學(xué)顯微鏡(NIKON E600,NIKON CORPORATION Shlnagawa Interclty Tower C,2-15-3,Konan,Minato-ku,Tokyo 108-6290 Japan)觀察制作好的石蠟切片并拍照．

1.3 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析于2021年夏的水稻抽穗期與成熟期進(jìn)行,隨機(jī)選取抽穗期的野生型和突變體各10個小穗進(jìn)行石蠟切片觀察,每張切片統(tǒng)計小穗外稃橫向細(xì)胞數(shù)量； 隨機(jī)選取成熟期的野生型和突變體各10個籽粒進(jìn)行掃描電鏡觀察,統(tǒng)計外稃縱向細(xì)胞數(shù)量； 隨機(jī)選取10株野生型和10株突變體,統(tǒng)計穗長、一次枝梗、二次枝梗、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、粒長、粒寬和粒質(zhì)量等農(nóng)藝性狀．

1.4 遺傳分析

以smg2突變體和ZH11雜交獲得F1,F1自交后代種植獲得F2群體,觀察F1表型和F2表型的分離情況,并對F2群體中具有突變體表型植株和正常單株進(jìn)行統(tǒng)計,對分離比例進(jìn)行卡方測驗(yàn)．

1.5 分子標(biāo)記定位及連鎖圖譜構(gòu)建

在ZH11/smg2雜交構(gòu)建的F2群體中選取突變單株作為定位群體,使用BSA法進(jìn)行目標(biāo)基因的定位[14].根據(jù)F2植株表型,分別選取10株正常單株和10株突變單株,剪取等量葉片,構(gòu)建正常基因池和突變基因池.用CTAB法提取親本、基因池和定位群體單株的DNA[15].定位引物選用SSR和IN/DEL引物,由北京擎科生物科技有限公司合成.PCR總體系為 15.0 μL,含 2.0 μL 10×PCR buffer,0.4 μL 2.5 mmol/L dNTPs,10.3 μL ddH2O,10 μmol/L的前后引物各0.5 μL,1.0 μL模板 DNA,0.3 μL 5 U/μL Taq酶.PCR程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性 5 min； 94 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃復(fù)性1 min,35個循環(huán)； 72 ℃延伸 10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察.將只呈現(xiàn)ZH11帶型的單株記為A,只呈現(xiàn)smg2帶型的單株記為B,同時呈現(xiàn)雙親帶型的單株記為H,用Mapmaker3.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖,根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http：//www.gramene.org/)的水稻基因組信息構(gòu)建物理圖譜,基因定位所用引物見表1．

表1 定位引物序列

1.6 候選基因分析

注釋基因信息從Gramene網(wǎng)站(http：//www.gramene.org/)上查詢所得,根據(jù)從網(wǎng)站下載的注釋基因序列,用PrimerPrimer5.0軟件設(shè)計特異性擴(kuò)增引物[16].分別以野生型和smg2突變體DNA為模板擴(kuò)增目標(biāo)序列,由測序公司進(jìn)行測序分析,擴(kuò)增引物序列見表2．

表2 擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 smg2突變體的籽粒表型觀察

與野生型(WT)相比,突變體smg2籽粒顯著變小(圖1a,b),粒長、粒寬分別只有9.20 mm和2.41 mm,為野生型的93.88%和91.25%(圖1c,d),而長寬比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1e).由于突變體粒長粒寬均減小,導(dǎo)致千粒質(zhì)量也有顯著降低,統(tǒng)計結(jié)果表明,smg2突變體千粒質(zhì)量為22.22 g,相較于野生型下降了7.67%(圖1f)．

2.2 smg2突變體穎殼的細(xì)胞學(xué)觀察

為了探究籽粒變小的具體原因,我們對smg2突變體成熟籽粒的穎殼進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)分析(圖2)．

首先,通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),在相同范圍內(nèi)smg2突變體內(nèi)、外稃上的縱向硅化細(xì)胞數(shù)量顯著多于野生型(圖2c,d,e,f,k),這說明突變體穎殼縱向細(xì)胞長度變短,但整個外稃縱向上硅化細(xì)胞的總數(shù)量在野生型與突變體間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2i).兩方面的數(shù)據(jù)綜合表明,smg2突變體籽粒變短的主要原因是穎殼細(xì)胞縱向擴(kuò)展不足.通過石蠟切片分析開花期小穗的穎殼橫向細(xì)胞數(shù)目和特征,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)野生型的細(xì)胞數(shù)量為396個,突變體的細(xì)胞數(shù)量為362個,突變體相對于野生型減少了8.59%(圖2g,h,j),表明smg2突變體穎殼橫向細(xì)胞增殖受到了抑制.統(tǒng)計切片中相同視野范圍內(nèi)的橫向細(xì)胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)突變體的細(xì)胞數(shù)量顯著多于野生型,增加了22.60%(圖2l),這說明smg2突變體穎殼橫向細(xì)胞的擴(kuò)展也受到了抑制.以上分析表明,SMG2基因一方面通過調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)展影響籽粒長度的發(fā)育,另一方面通過調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)展影響籽粒寬度的發(fā)育．

**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖1 野生型和smg2突變體的籽粒表型

2.3 smg2突變體的植株形態(tài)觀察

smg2突變體表現(xiàn)為半矮化性狀(圖3a),其莖稈倒1節(jié)和倒2節(jié)明顯短于野生型(圖3b).由于倒1節(jié)變短,突變體還表現(xiàn)出明顯的包穗性狀,大部分分化后發(fā)育成熟的穗被包裹于劍葉內(nèi),無法正常抽穗(圖3c).突變體穗長僅為19.53 cm,極顯著短于野生型(圖3d)； 一次枝梗數(shù)量減少26.17%,極顯著低于野生型(圖3e)； 二次枝梗數(shù)量極顯著高于野生型,增加了46.30%(圖3f)； 每穗穎花數(shù)和每穗粒數(shù)均極顯著低于野生型,分別降低了26.30%和41.40%(圖3g,h)； 突變體結(jié)實(shí)率僅為65.80%,極顯著低于野生型(圖3i)．

2.4 smg2突變體的遺傳分析

2.5 SMG2基因的定位

定位群體選擇F2分離群體中表現(xiàn)出突變體性狀的植株.隨機(jī)選取F2群體中野生型和突變體各10株,提取DNA構(gòu)建基因池.以父本ZH11和母本smg2為模板,選用200對平均分布于水稻所有染色上的SSR引物和IN/DEL引物,對親本進(jìn)行多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)位于第1染色體長臂端的IN/DEL標(biāo)記A-0.65,A-1.09,A-1.67,A-2.35,A-2.40以及SSR標(biāo)記RM10445R在兩個基因池中具有多態(tài)性,用這6對標(biāo)記分析F2中的44株突變單株,重組子個數(shù)分別為3,2,6,9,10,25,初步將smg2定位在A-0.65和A-1.09之間； 在這兩個引物之間進(jìn)行區(qū)間縮進(jìn),發(fā)展了3對IN/DEL引物篩選66株突變單株,重組子個數(shù)分別為2,1,1.根據(jù)重組子數(shù)目和相互關(guān)系,最終將SMG2基因定位在IN/DEL標(biāo)記A-0.85和A-1.05之間,物理距離200 kb(圖4)．

*表示p<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖2 野生型和smg2突變體的細(xì)胞學(xué)觀察和統(tǒng)計分析

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖3 野生型和smg2突變體植株的形態(tài)觀察和農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

圖4 SMG2基因在水稻第1染色體上的連鎖圖譜

2.6 SMG2候選基因的分析

根據(jù)測序品種日本晴的序列和基因注釋信息(http：//www.gramene.org/和http：//rice. plantbiology. msu. edu/),在定位區(qū)間內(nèi)(物理距離約200 kb)共有28個注釋基因(表3).在這些注釋基因中,有5個編碼具有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),5個編碼逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白,4個基因編碼抗性相關(guān)的受體蛋白,3個基因編碼激酶相關(guān)的受體蛋白,其余11個基因編碼一些不同類型的蛋白質(zhì)(表3),其中LOC_Os01g02890基因編碼1個磷脂酰絲氨酸合酶.先前有報道該基因發(fā)生突變后穗頸節(jié)極度縮短從而產(chǎn)生包穗性狀[17],這與本研究中smg2突變體表型類似,猜測LOC_Os01g02890可能是SMG2的候選基因.對該基因進(jìn)行PCR測序分析,LOC_Os01g02890包含12個外顯子,編碼框基因組全長6 563 bp,CDS全長1 275 bp,編碼包含424個氨基酸的蛋白質(zhì).測序結(jié)果表明,在突變體中,LOC_Os01g02890基因的第1個外顯子的第153位堿基發(fā)生了單堿基缺失,相比野生型缺失1個胞嘧啶(C),移碼突變后導(dǎo)致第52位氨基酸由亮氨酸變成終止密碼子,蛋白翻譯提前終止,因此將LOC_Os01g02890基因暫定為SMG2基因的候選基因(圖4)．

表3 定位區(qū)間內(nèi)的注釋基因

3 討論

3.1 smg2是突變體sui1的等位突變體

籽粒形態(tài)是水稻產(chǎn)量和稻米外觀品質(zhì)的主要影響因素之一,因此水稻粒型發(fā)育基因的克隆與分子機(jī)制研究對于水稻高產(chǎn)育種研究具有重要意義.然而影響籽粒形態(tài)的基因涉及多個調(diào)控途徑且數(shù)量龐大,為了深入研究水稻籽粒形態(tài)發(fā)育調(diào)控機(jī)制,本研究從秈稻保持系XD1B誘變?nèi)后w中鑒定了一個小粒突變體smg2,通過圖位克隆將候選基因暫定為LOC_Os01g02890.該基因先前報道了多個等位突變體,其中sui1-1,sui1-2,sui1-4等位突變體性狀均表現(xiàn)為抽穗期最上部節(jié)間顯著縮短,導(dǎo)致整穗或者部分穗被劍葉包裹而不能正常發(fā)育[17-19].在本研究中,smg2突變體除了表現(xiàn)出矮化包穗外,還具有粒長、粒寬、結(jié)實(shí)率均顯著降低等性狀,因此我們推測smg2應(yīng)為LOC_Os01g02890的一個強(qiáng)等位突變體.在以前的研究中,Yin等[18]研究表明突變體節(jié)間縮短是由于節(jié)間中Intercalary meristem(IM)未啟動發(fā)育,認(rèn)為SUI1家族基因通過調(diào)控水稻節(jié)間IM的發(fā)育和穗莖軸的細(xì)胞擴(kuò)張來影響水稻的節(jié)間發(fā)育； Ma等[19]研究認(rèn)為SUI1基因通過調(diào)控細(xì)胞壁成分的分泌來控制水稻特別是穗頸節(jié)間的細(xì)胞伸長.本研究中我們詳細(xì)分析了smg2突變體穎殼的發(fā)育特征,發(fā)現(xiàn)SMG2基因通過調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)展來影響穎殼的縱向和橫向發(fā)育,這與先前的研究是一致的.我們還發(fā)現(xiàn)SMG2也作用于細(xì)胞增殖來影響穎殼的寬度發(fā)育,這暗示其在籽粒形態(tài)發(fā)育中的功能與其在上部節(jié)間發(fā)育中的功能可能并不完全一致．

3.2 SMG2通過調(diào)控穎殼細(xì)胞發(fā)育控制籽粒大小

水稻籽粒的粒型和粒質(zhì)量一方面由穎殼大小和形狀限制,另一方面與其內(nèi)部組織,尤其是胚乳生長發(fā)育密切相關(guān).水稻籽粒最外層被一層堅硬的穎殼包裹,由外稃和內(nèi)稃組成的穎殼在很大程度上限制了籽粒的生長能力,因此穎殼細(xì)胞的數(shù)量、大小能夠影響水稻粒長、粒寬和粒厚,進(jìn)而決定水稻籽粒大小.近年來,人們鑒定了許多與水稻籽粒大小發(fā)育相關(guān)的基因,它們中絕大多數(shù)都是通過調(diào)控穎殼的細(xì)胞增殖或(和)擴(kuò)展,進(jìn)而決定籽粒形態(tài),最終在水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成中發(fā)揮重要作用,但其中大部分基因都是單獨(dú)通過影響細(xì)胞擴(kuò)展或細(xì)胞增殖來影響籽粒形態(tài)發(fā)育,如RGA1,RGB1基因均通過控制細(xì)胞增殖對水稻籽粒大小進(jìn)行正向調(diào)控[20-22]；GSK2,SRS5控制細(xì)胞伸長,對籽粒長度負(fù)向調(diào)控[23-24].在本研究中,通過細(xì)胞學(xué)觀察分析發(fā)現(xiàn),smg2突變體縱向上細(xì)胞總數(shù)量與野生型差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而相同視野范圍內(nèi)縱向細(xì)胞數(shù)量顯著增多,表明SMG2基因在縱向上通過影響細(xì)胞擴(kuò)展調(diào)控籽粒長度.在橫向上突變體細(xì)胞總數(shù)量顯著低于野生型,同時相同視野范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)量多于野生型,說明SMG2基因通過影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)展調(diào)控籽粒寬度,因此SMG2基因能同時通過兩種方式調(diào)控籽粒的形態(tài)發(fā)育.結(jié)果表明,進(jìn)一步克隆SMG2基因,并進(jìn)行功能分析,闡述SMG2基因的分子機(jī)制,對于完善水稻粒型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義．

4 結(jié)論

本研究從秈稻保持系XD1B的EMS誘變?nèi)后w中鑒定了1個小粒突變體smg2.相比野生型,smg2突變體粒長、粒寬和千粒質(zhì)量均降低,同時具有植株矮化、短穗、一次枝梗減少、二次枝梗增多、每穗粒數(shù)減少和結(jié)實(shí)率降低等表型.遺傳分析結(jié)果表明,該突變體性狀受隱性單基因控制,被精細(xì)定位在第1染色體上A-0.85和A-1.05之間,物理距離約為200 kb的范圍內(nèi),測序發(fā)現(xiàn)定位區(qū)間內(nèi)LOC_Os01g02890基因第1個外顯子上第153位堿基缺失,相較野生型缺失了1個胞嘧啶(C),導(dǎo)致移碼突變,最終將候選基因定為LOC_Os01g02890.本研究進(jìn)一步豐富了與籽粒形態(tài)相關(guān)的突變體材料,為深入理解水稻粒形遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了基因資源．