李玲依， 焦穎瑞， 胡健， 楊仕會(huì)， 曹紅宇， 張紅梅， 王兵兵， 馮萍， 凌英華， 張婷， 何光華， 姚賀盛

西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院,重慶 400715

光合作用是產(chǎn)量形成的基礎(chǔ),從能量轉(zhuǎn)化角度講,影響水稻產(chǎn)量潛力的主要因素包括：光吸收量、光能利用效率和收獲指數(shù)[1],而當(dāng)前水稻收獲指數(shù)已接近理論上限[2],難以依靠優(yōu)化收獲指數(shù)來大幅提高水稻的產(chǎn)量.因此,提高光合適應(yīng)能力,促進(jìn)生育前期獲得較高光合物質(zhì)基礎(chǔ),在維持較高收獲指數(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高光能利用效率以形成較高的生物量是實(shí)現(xiàn)水稻高產(chǎn)的重要途徑[3-5]．

西南地區(qū)是我國重要的水稻栽培區(qū),但生育前期長期的陰雨寡日照、自然光照弱等客觀因素致使冠層內(nèi)葉片光合速率低,難以在生育前期獲得較好的光合物質(zhì)基礎(chǔ).提高低光光適應(yīng)能力進(jìn)而提升低光光能利用效率成為該區(qū)域水稻光合適應(yīng)性研究的重要目標(biāo).水稻低光光能利用效率具有高度遺傳特性,是影響水稻生物量形成的關(guān)鍵因素之一,且育成水稻品種之間低光光能利用效率存在很大變異,尚未在人工馴化過程中受到強(qiáng)烈選擇[6].因此,低光光適應(yīng)能力強(qiáng)的基因及資源材料挖掘成為進(jìn)一步提高水稻產(chǎn)量的重要研究方向．

光合有效輻射(PPFD)不僅影響植物葉片的形態(tài)學(xué)特征變化(如光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù))[7-8],還會(huì)對葉片的光合生理特征(如光合電子傳遞效率、光合碳同化效率)產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)作用[9-10].這些生理特征均會(huì)影響葉片的光合能力和光能利用效率.除單葉水平光合效率外,保持合理的單株葉片面積也是提高作物群體光合和光能利用效率的重要基礎(chǔ),適宜的單株葉片面積可以顯著改善群體光合物質(zhì)的產(chǎn)出,進(jìn)而促進(jìn)作物產(chǎn)量的形成[11]．

前期研究發(fā)現(xiàn),嘌呤合成途徑基因(Virescent-Albino Leaf 1,VAL1)編碼蛋白VAL1,是嘌呤生物合成途徑中的關(guān)鍵基因,參與調(diào)節(jié)水稻葉片發(fā)育過程中的葉綠體發(fā)育、葉綠素代謝和細(xì)胞分裂.通過將VAL1在野生型材料中超表達(dá),獲得了光合速率顯著提高且表型穩(wěn)定的水稻株系(VAL1-OE)[12].本研究測定結(jié)果顯示,VAL1-OE水稻具備同時(shí)適應(yīng)低光和高光環(huán)境的典型生理特性,這表明VAL1-OE水稻同時(shí)擁有高效利用低光和高光的能力.在自然界中,很少發(fā)現(xiàn)同時(shí)具備適應(yīng)低光和高光能力的天然植物[13],這一特性使VAL1-OE水稻成為開展光合適應(yīng)性研究的優(yōu)勢材料.本文擬通過研究VAL1-OE與野生型材料在光合色素合成、光能吸收及光合碳同化效率等生理途徑的差異,揭示VAL1-OE水稻增強(qiáng)光合適應(yīng)能力及提高光合碳同化速率的調(diào)控機(jī)制,為挖掘寡日照地區(qū)水稻增產(chǎn)潛力,篩選光照廣適稻種資源提供參考．

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)概況

試驗(yàn)于2020年4月至8月在西南大學(xué)水稻研究所歇馬(北緯N29°46′4.20″,東經(jīng)E106°21′53.07″)試驗(yàn)基地進(jìn)行.試驗(yàn)選用縉恢10號野生型(WT)和VAL1超表達(dá)水稻(VAL1-OE)為試驗(yàn)材料,在抽穗期進(jìn)行株型特征、葉片表型、光合作用及光能利用效率的測定與分析.試驗(yàn)選取2個(gè)水稻材料,于4月育秧,5月6日移至田間插秧,栽插規(guī)格為株行距16.67 cm×26.66 cm,每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)10行×10列,共100株,管理措施同大田.試驗(yàn)區(qū)3 m高處運(yùn)用防鳥網(wǎng)完全覆蓋,以防止鳥類采食影響試驗(yàn)結(jié)果．

1.2 樣品采集及處理

大田試驗(yàn)中,選擇分蘗期水稻分別進(jìn)行光合測定、色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定和干物質(zhì)分配測定．

水稻成熟后單獨(dú)收種考種,水稻考種包括穗長、穗實(shí)粒數(shù)、穗空殼數(shù)等基本產(chǎn)量構(gòu)成指標(biāo)．

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 株型指標(biāo)測定

在抽穗期對水稻進(jìn)行取樣,每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)取代表性植株3株,洗凈根部泥土,然后測量相關(guān)指標(biāo).測量指標(biāo)包括株高、分孽數(shù)量、比葉質(zhì)量(LMA)、單株葉面積(S)、葉片干質(zhì)量(W)以及葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù),其中,單株葉面積(S)計(jì)算公式為

S=W/LMA

1.3.2 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法：用切割法切下部分葉片(用游標(biāo)卡尺量葉片的長度并計(jì)算面積),然后加入10 mL葉綠素提取液,黑暗環(huán)境浸提48 h,每隔12 h混勻1次,最后用紫外分光光度測量吸光度.測定時(shí)提前20 min將紫外分光光度預(yù)熱,待預(yù)熱結(jié)束后,以空白的葉綠素提取液作為對照,分別在645 nm,663 nm兩個(gè)波長下測定提取液的吸光值(OD)[14]．

Chla= 12.2OD663-2.81OD645

Chlb= 20.13OD645-5.03OD663

Chl(a+b)=17.32OD645+7.18OD663

OD645,OD663分別表示在波長645 nm,663 nm下測得的吸光值,Chla,Chlb,Chl(a+b)分別表示葉綠素a,葉綠素b和總?cè)~綠素的濃度．

單位面積葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Cc,mg/m2)

Cc=C×V×10/S

式中,C為相應(yīng)葉綠素的濃度(mg/mL),V為提取液體積(mL),S為測試樣品的面積(m2)．

1.3.3 比葉質(zhì)量的測定

用切割法切下部分葉片(用游標(biāo)卡尺量葉片的長度并計(jì)算面積),先在烘箱中105 ℃殺青30 min,再在65 ℃烘至恒質(zhì)量,最后用百分之一天平稱質(zhì)量．

1.3.4 光響應(yīng)曲線(A-PPFD)的測定

水稻葉片A-PPFD的測定運(yùn)用GFS-3000和雙通道熒光儀(Chlorophyll Fluorescence & P700 Measuring System,DUAL-PAM-100,Walz,Germany)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行測定．

選取冠層上部倒1葉片為測試樣本,樣本葉片進(jìn)行暗適應(yīng)30 min后進(jìn)行測定.測定時(shí),溫度為27 ℃,相對濕度為70%,CO2濃度為400 μmol/mol,流速為400 μmol/s,光合有效輻射梯度設(shè)置為1 895，1 523，1 218，980，621，390，221，116，85，55，30，17，7和0 μmol/(m2·s).選取1 523,980和390 μmol/(m2·s) 3個(gè)光強(qiáng)的點(diǎn)進(jìn)行比較．

在測定A-PPFD時(shí),葉綠素?zé)晒夂蚉700進(jìn)行同步測定,光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的電子傳遞速率ETRI和ETRII分別由試驗(yàn)儀器直接測定．

1.3.5 干物質(zhì)、產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的測定

干物質(zhì)的測定：將水稻各器官分別裝于紙質(zhì)信封,置于烘箱中105 ℃殺青30 min,然后在65 ℃烘干至恒質(zhì)量后,用百分之一天平稱質(zhì)量．

產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的測定：水稻成熟前,調(diào)查每個(gè)小區(qū)的單株有效分蘗數(shù),每個(gè)小區(qū)取10株進(jìn)行考種,考種指標(biāo)包括穗長、一次枝梗、二次枝梗、每穗實(shí)粒數(shù)和癟粒數(shù),計(jì)算結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量．

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)和植型表型分析

通過將VAL1基因在野生型材料縉恢10號(WT)中進(jìn)行超表達(dá)獲得了表型穩(wěn)定的水稻株系VAL1-OE(圖1a),在分蘗期對野生型和VAL1-OE水稻葉片葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因進(jìn)行了qRT-PCR測定分析(圖1b).試驗(yàn)結(jié)果表明,在光能吸收方面,VAL1-OE水稻葉片中編碼捕光復(fù)合體II葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因(LhcpII)的轉(zhuǎn)錄水平較野生型提高了75%； 在電子傳遞方面,VAL1-OE水稻葉片中編碼PS I P700葉綠素a脫輔基蛋白A1基因(psaA),PS II D1蛋白基因(psbA),細(xì)胞色素f脫輔基蛋白基因(petA)和細(xì)胞色素b6-f復(fù)合體小亞基基因(petG)的轉(zhuǎn)錄水平分別較野生型提高228%,355%,151%和258%； 在光合羧化固定方面,VAL1-OE水稻葉片中編碼核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基基因(rbcL)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因(RbcS)和葉綠體ATP合成酶α亞基基因(atpA)的轉(zhuǎn)錄水平分別較野生型提高了370%,131%和375%.由此可知,VAL1-OE水稻葉片中調(diào)控光吸收、傳遞與轉(zhuǎn)化過程主要基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(p<0.01)．

具有良好的株型特征是作物實(shí)現(xiàn)高光效的重要前提,分別對野生型(WT)和VAL1-OE水稻材料的株高、分蘗數(shù)量、比葉質(zhì)量和單株葉面積等性狀進(jìn)行了差異顯著性分析(圖2).結(jié)果表明：VAL1-OE水稻材料的比葉質(zhì)量(LMA)顯著高于野生型,較野生型提高了36.95%(p<0.01,圖2c)；VAL1-OE水稻材料的株高、分蘗數(shù)量和單株葉面積顯著低于野生型(p<0.05),較野生型分別降低了6.75%(圖2a),14.29%(圖2b),和31.13%(圖2d)．

2.2 光合表型分析

VAL1超表達(dá)材料(VAL1-OE)與野生型(WT)之間的色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3).試驗(yàn)結(jié)果表明,VAL1-OE水稻材料單位面積葉綠素a,葉綠素b和葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于野生型(p<0.05),分別較野生型提高了20.36%,8.09%和17.86%．

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖1 相關(guān)基因差異表達(dá)分析

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖2 株型表型差異分析

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖3 光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異分析

電子傳遞是光合作用進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié),光合電子傳遞速率的不同也可能會(huì)對最終的光合值以及產(chǎn)量產(chǎn)生影響.為探究VAL1-OE水稻材料與野生型(WT)之間光合電子傳遞的差異,分別在390,980和1 523 μmol/(m2·s)的光照強(qiáng)度下對野生型和VAL1-OE水稻材料的光系統(tǒng)II和光系統(tǒng)I電子傳遞效率進(jìn)行差異顯著性分析.試驗(yàn)結(jié)果表明,在不同光照強(qiáng)度下,VAL1-OE水稻材料光系統(tǒng)II和光系統(tǒng)I電子傳遞效率均顯著高于野生型(圖4).VAL1-OE水稻材料在390,980和1 523 μmol/(m2·s)的光照強(qiáng)度下光系統(tǒng)II電子傳遞效率分別較野生型提高了18.06%,30.76%和33.09%(p<0.05,圖4a)； 光系統(tǒng)I電子傳遞效率分別較野生型提高了16.14%,26.58%和30.28%(p<0.05,圖4b)．

光合碳同化是植物干物質(zhì)累積的基礎(chǔ),對植物生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用.VAL1-OE水稻材料與野生型(WT)在不同光強(qiáng)下的光合碳同化效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.試驗(yàn)結(jié)果表明,在不同光照強(qiáng)度下,VAL1-OE水稻材料的凈光合速率均顯著高于野生型(p<0.01).在390,980和1 523 μmol/(m2·s)的光照強(qiáng)度下分別提高了82.47%,100.43%和97.01%(圖5)．

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖4 光合電子傳遞差異分析

2.3 光能利用效率和物質(zhì)累積及產(chǎn)量構(gòu)成分析

VAL1-OE水稻材料與野生型(WT)在不同光強(qiáng)下光能利用效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6).數(shù)據(jù)結(jié)果表明,在不同光照強(qiáng)度下,VAL1-OE水稻材料的光能利用效率均顯著高于野生型(p<0.01),在390,980和1 523 μmol/(m2·s)的光照強(qiáng)度下的光能利用效率分別較野生型提高了82.47%,100.43%和97.01%.VAL1-OE水稻材料與野生型的考種數(shù)據(jù)結(jié)果表明,VAL1-OE水稻材料的抽穗期干物質(zhì)量、穗長、實(shí)粒數(shù)、癟粒數(shù)、穗數(shù)、千粒質(zhì)量和總產(chǎn)量與野生型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)．

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖5 不同光強(qiáng)下光合碳同化效率差異分析

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖6 不同光強(qiáng)下光能利用效率(LUE)差異分析

表1 物質(zhì)累積和產(chǎn)量構(gòu)成因素

3 討論

3.1 超表達(dá)VAL1水稻優(yōu)化葉片光能吸收、電子傳遞和碳同化是提高光合作用和光能利用效率的關(guān)鍵

光吸收能力的提高是優(yōu)化光合作用的前提.葉綠素a/b結(jié)合蛋白圍繞光系統(tǒng)II(PS II)的反應(yīng)中心作為主要的外部天線[15],能把接受的光能量快速傳導(dǎo)至反應(yīng)中心,參與光能轉(zhuǎn)化與傳遞,以及對各種環(huán)境的適應(yīng)等過程,對植物的光合作用起到關(guān)鍵作用[16].研究表明,在VAL1-OE超表達(dá)水稻葉片中,捕光復(fù)合體II葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因(LhcpII),編碼PS I P700葉綠素a脫輔基蛋白A1基因(psaA),PS II D1蛋白基因(psbA),細(xì)胞色素f脫輔基蛋白基因(petA)和細(xì)胞色素b6-f復(fù)合體小亞基基因(petG)的轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高(圖1),這些基因轉(zhuǎn)錄水平的提高有利于提升水稻葉片葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(圖3),使其在低光條件下能捕獲更多的光能,促進(jìn)光能的轉(zhuǎn)化和傳遞(圖4),進(jìn)而提高凈光合速率和光能利用效率(圖5,圖6)．

通常情況下,比葉質(zhì)量較大的葉片也會(huì)具有較大的光合潛力.研究結(jié)果表明,VAL1-OE超表達(dá)水稻葉片比葉質(zhì)量顯著高于野生型(圖2).這有利于使葉片在單位面積上獲得更多的氮素分配和光合蛋白的分布,進(jìn)而提高VAL1-OE超表達(dá)水稻葉片在強(qiáng)光下的電子傳遞效率(圖4)、光合碳同化效率(圖5)和光能利用效率(圖6).研究結(jié)果還表明,在強(qiáng)光條件下,VAL1-OE超表達(dá)水稻葉片ETRI顯著高于ETRII(圖4),這主要是因?yàn)閺?qiáng)光下水稻通過PS I的電子傳遞速率顯著增強(qiáng),進(jìn)而導(dǎo)致葉片環(huán)式電子傳遞顯著提高,而環(huán)式電子傳遞增強(qiáng)有利于高光強(qiáng)下實(shí)現(xiàn)對光合機(jī)構(gòu)的保護(hù)作用[17].綜上可知,VAL1-OE超表達(dá)水稻葉片關(guān)鍵光合酶編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào),顯著提高了光合捕光復(fù)合蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù),促使無論是低光還是高光條件下,VAL1-OE超表達(dá)水稻葉片較野生型均具有顯著的光合能力和光能利用效率．

3.2 在高光合基礎(chǔ)上培育高葉面積表型材料,進(jìn)一步提高光合作用面積是高光效水稻育種的突破口

具有良好的株型特征是作物實(shí)現(xiàn)高光效的基礎(chǔ).張耀文等[18]在研究作物的高光效試驗(yàn)中認(rèn)為,葉面積系數(shù)較大,株型緊湊且適于密植,莖稈粗壯抗倒伏能力強(qiáng),冠層結(jié)構(gòu)較良好,群體內(nèi)光照分布合理、群體光合速率較高.本研究結(jié)果表明,在抽穗期時(shí)VAL1-OE超表達(dá)水稻與野生型干物質(zhì)累積量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1),但株高和分蘗數(shù)量顯著低于野生型(圖2).這可能是因?yàn)閂AL1-OE超表達(dá)水稻葉片具有較強(qiáng)的光合能力,較多的干物質(zhì)累積分配到各個(gè)分蘗當(dāng)中,單分蘗獲得了更多的干物質(zhì)分配,致使其干物質(zhì)總量未出現(xiàn)較大差異.此外,在收獲期時(shí),VAL1-OE超表達(dá)水稻與野生型實(shí)際收獲植株的分蘗數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是由于進(jìn)入抽穗期后,VAL1-OE超表達(dá)水稻重新獲得一些新的有效分蘗增加了最終的有效穗數(shù)．

提高作物光能物質(zhì)生產(chǎn)能力的途徑有3個(gè)：提高光合能力、增大光合面積和延長光合作用的時(shí)間.在本研究中,雖然VAL1-OE超表達(dá)水稻具有顯著高的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、比葉質(zhì)量和凈光合速率(圖2,圖3,圖5),但VAL1-OE超表達(dá)水稻單株面積顯著低于野生型(圖2).光合面積較小成為制約VAL1-OE超表達(dá)水稻獲得更多干物質(zhì)累積和產(chǎn)量的主要因素.以VAL1-OE超表達(dá)水稻為基礎(chǔ),在實(shí)現(xiàn)高光合能力的同時(shí),培育高葉面積表型材料,提高光合作用面積是未來產(chǎn)量進(jìn)一步提升的突破口．

4 結(jié)論

超表達(dá)VAL1-OE水稻優(yōu)化葉片光能吸收、電子傳遞和碳同化是提高光合作用和光能利用效率的關(guān)鍵.VAL1-OE超表達(dá)水稻葉片關(guān)鍵光合酶編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào),顯著提高了光合捕光復(fù)合蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù),促使無論是低光還是高光條件下,VAL1-OE超表達(dá)水稻葉片較野生型均具有顯著增強(qiáng)的電子傳遞速率和凈光合速率,致使其光能利用效率顯著提高.與此同時(shí),光合面積較小成為制約VAL1-OE超表達(dá)水稻獲得更多干物質(zhì)累積和產(chǎn)量的主要因素.以VAL1-OE超表達(dá)水稻為基礎(chǔ),在實(shí)現(xiàn)高光合能力的同時(shí),培育高葉面積表型材料,提高光合作用面積是進(jìn)一步提高該水稻材料干物質(zhì)累積量和產(chǎn)量的關(guān)鍵．