勞澤輝，凌國偉，華國花

（番禺區(qū)中醫(yī)院 骨科，廣東 廣州 511400）

脊髓型頸椎?。╟ervical spondylotic myelopathy,CSM）是一種常見的骨科慢性疾病，患者長期未得到有效治療容易誘發(fā)局部癱瘓及神經(jīng)傳導(dǎo)障礙性疾病，嚴重影響患者的正常生活［1］。目前對脊髓型頸椎病的治療主要包括理療、中藥治療及西藥止痛等基礎(chǔ)療法，這些療法常無法有效根治且病痛易復(fù)發(fā)，其主要原因在于缺乏對脊髓型頸椎病的發(fā)病機制的有效了解［2-3］。目前有文獻報道，在退變椎間盤中核因子κB（NF-κB）高表達，它的激活可以調(diào)控諸多細胞因子、炎性介質(zhì)、趨化因子及胞外基質(zhì)各種降解酶類的表達，進而誘發(fā)椎間盤的退變，同時circRNAs 與膝關(guān)節(jié)炎及頸椎病動物疾病模型中NF-κB 信號通路的調(diào)控，其中miR-146a、miR-155 是circRNAs 中重要的調(diào)節(jié)因子，這些研究初步證實說明circRNAs 在脊髓型頸椎病的發(fā)生過程中具有潛在作用［4-5］。因此，本項目提出科研假說“circRNAs 調(diào)控NF-κB信號通路在脊髓型頸椎病中的作用及機制研究”，同時擬通過構(gòu)建脊髓型頸椎病大鼠模型，通過生物信息學(xué)基于NF-κB 構(gòu)建circRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過RT-PCR 進行驗證，通過雙熒光素酶報告基因檢測明確circRNA 之間的直接作用，并在體內(nèi)進一步驗證明確基于NF-κB 的circRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在脊髓型頸椎病中的作用及調(diào)控機制，為其治療提供新型靶標(biāo)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

選取20 只3 個月月齡，體重（490±30）g 的健康清潔級SD 大鼠作為研究對象［購自北京維通利華試驗動物有限公司，提供許可證號：SCXK（京）2016-0006］，將其隨機分為對照組和試驗組，各10 只。對照組為空白組不進行處理，試驗組參照脊髓型頸椎病動物模型的建模方法進行改良造模。本次試驗過程及動物的處置均符合動物倫理學(xué)，所有入選動物依照常規(guī)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，且入動物房隔離觀察1 周后進行造模。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

多功能酶標(biāo)分析儀（Biotek ElX808,美國），PCR 分析儀（Bio-Rad S100,美國），光學(xué)顯微鏡（Leica DMIL LED,德國），垂直電泳儀，轉(zhuǎn)膜電泳槽，聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜），脫色搖床。腫瘤壞死因子（TNF）-α 的酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)公司AZ0672）、白細胞介素（IL）-1β 的ELISA 試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)公司AZ0646）、IL-6 的ELISA 試劑盒（碧云天PI328）的ELISA 檢測試劑盒，腺病毒包裝miRNA 模擬物/抑制物（上海生工合成），核酸提取試劑盒（上海博日生物S002ZC），大鼠Toll 樣受體4（TLR4）、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 引物及定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑由上海生工合成提供，兔抗大鼠MyD88 單克隆抗體（Abcam 公司ab219413），兔抗NF-κB p65 單克隆抗體（Ep2294Y），羊抗兔IgG（HRP）（Abcam 公司ab6795），12%分離膠（20%ddH2O，40% 的 30%Acr-Bis，38% 1.5M pH8.8 Tris，1% 的10%SDS，1% 的10%APS 和0.2%TEMED），5% 濃縮膠（70% ddH2O，16.5% 的30% Acr-Bis，12.5% 1M Ph6.8 Tris，1% 的10%SDS，1%的10%APS 和0.1%的TEMED），封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST），10x Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.0）。

1.3 脊髓型頸椎病大鼠造模方法

參照栗勝勇等（2018 年）報道［6］，以1 mL/kg體重的量進行腹腔注射阿佛?。ㄈ逡掖?，南京愛貝生物）以腹腔麻醉，待其進入麻醉狀態(tài)后俯臥固定，將大鼠頸部及上背部毛剃除并常規(guī)消毒，在頸椎第5 棘突背部正中縱切3 cm 暴露肌群，鈍性分離皮下組織及肌肉暴露C6-T2 椎弓及脊髓，在C6-C7 處脊髓中注射2% 福爾馬林100 μL，形成一個有張力的包塊阻止傳導(dǎo)，對照組不進行任何處理，術(shù)后消毒及常規(guī)縫合，造模后動物活動不方便，應(yīng)做好每日護理。

1.4 脊髓型頸椎病模型大鼠評估

造模前24 h 和造模后48 h 分別采集動物尾根動脈血，采用ELISA 法檢測血清中炎性因子IL-1β、IL-6 及TNF-α 的表達水平，同時造模8 周后采用高通量芯片分析大鼠髓核組織中差異表達的circRNAs 和mRNAs。采集造模8 周成功后的大鼠的髓核細胞進行體外培養(yǎng)，試驗組的髓核細胞采用腺病毒為載體轉(zhuǎn)染miRNA 模擬物/抑制物，通過Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后3 周、6 周和12 周的大鼠標(biāo)本中信號通路關(guān)鍵蛋白MyD88、NF-κB 的P65蛋白，采用Image J 軟件轉(zhuǎn)化為灰度分析表達量；同時對同階段樣本采用定量RT-PCR 檢測標(biāo)本中TLR4、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 的表達水平及計算基因相對表達量（ΔΔct）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓型頸椎病大鼠造模前后血清炎性因子水平變化

造模前試驗組與對照組的血清炎性因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 彼此均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），造模后試驗組的血清炎性因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 脊髓型頸椎病大鼠造模前后血清炎性因子水平比較（,pg/mL）

表1 脊髓型頸椎病大鼠造模前后血清炎性因子水平比較（,pg/mL）

2.2 造模后髓核細胞轉(zhuǎn)染后不同時間段的MyD88及NF-κB 信號蛋白P65 表達水平比較

造模大鼠髓核細胞表達的MyD88 蛋白及NF-κB信號蛋白P65 的水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)miRNA 模擬物/抑制物轉(zhuǎn)染后，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長髓核細胞表達的MyD88蛋白及NF-κB 信號蛋白P65 的水平均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 造模后不同干預(yù)時間段的MyD88 及NF-κB 信號蛋白P65 的Western blot 結(jié)果

表2 不同時間段造模大鼠的髓核細胞NF-κB 信號蛋白MyD88 及P65 的變化（）

表2 不同時間段造模大鼠的髓核細胞NF-κB 信號蛋白MyD88 及P65 的變化（）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與試驗組轉(zhuǎn)染3 周比較，P＜0.05；3）與試驗組轉(zhuǎn)染6 周比較，P＜0.05。

2.3 髓核細胞轉(zhuǎn)染不同時間段TLR4、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 基因表達水平比較

經(jīng)定量RT-PCR 對轉(zhuǎn)染后不同時間段大鼠髓核細胞的TLR4、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 基因表達比較，除miR-146a 在轉(zhuǎn)染后6 周和12 周的表達水平彼此差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.27,P=0.109）外，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長TLR4、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 基因的表達水平均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），對照組的TLR4、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 基因表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同轉(zhuǎn)染時間段造模大鼠髓核細胞的TLR4、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 水平（）

表3 不同轉(zhuǎn)染時間段造模大鼠髓核細胞的TLR4、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 水平（）

3 討論

CSM 是一種頸椎退行性疾病，多見于40 歲以上患者，此病具有病程長及病因復(fù)雜的特點，從而很大程度上增加了治療難度。脊髓型頸椎病隨著病程延長，常導(dǎo)致患部脊髓受壓缺血及局部神經(jīng)傳導(dǎo)障礙，嚴重者誘發(fā)半身不遂等［7］。隨著分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 信號通路參與椎間盤退變，在退變椎間盤髓核細胞中NF-κB 相關(guān)蛋白呈現(xiàn)高表達，同時有研究證實NF-κB 信號被激活后可調(diào)控諸多細胞因子、炎性趨化因子如IL-1、IL-8、THF-α、IL-17 等的表達，通過相應(yīng)的抑制劑阻斷NF-κB 信號通路后，炎癥因子的表達則明顯的出現(xiàn)減少，同時NF-κB 信號蛋白p50 和p65 表達水平呈現(xiàn)明顯下降［8-9］。同時有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在老化或者退變的椎間盤組織中，當(dāng)NF-κB p65 等位基因被敲除或加入IKK 抑制劑后NF-κB 信號蛋白的表達均表現(xiàn)逆轉(zhuǎn)性的改變，因此NF-κB 信號蛋白可能在脊髓型頸椎病中發(fā)揮重要作用，但是其具體調(diào)控機制目前尚不清晰。環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是一類特殊的非編碼RNA，可免受RNA 外切酶的剪切，因此具有較強的穩(wěn)定性［10-11］。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 在許多疾病中存在顯著的差異表達，如circRNA 被發(fā)現(xiàn)在許多骨科疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤、骨性關(guān)節(jié)炎中存在差異表達，除此之外某些關(guān)鍵circRNA 不僅被證明可以作為這些骨科疾病的分子標(biāo)志物，為這些特定疾病的分子診斷和治療提供了新的策略［12-13］。但是，目前對circRNAs 及NF-κB 在脊髓型頸椎病中的作用及其調(diào)控機制尚不清晰，因此本項目擬針對此進行研究。

本研究通過對脊髓型頸椎病大鼠造模前后血清炎性指標(biāo)及造模后髓核細胞轉(zhuǎn)染miRNA 模擬物/抑制物后不同時間段circRNA 的特定基因表達比較發(fā)現(xiàn)，造模后試驗組的血清炎性因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平均高于對照組（P＜0.05），此結(jié)果初步證明造模成功，炎性因子的顯著增加代表患部炎癥未發(fā)生消退。經(jīng)定量RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)隨著轉(zhuǎn)染時間的延長TLR4、TRAF-6、miR-146a和miR-155 基因的表達水平均明顯下降（P＜0.05），此結(jié)果進一步說明TLR4、TRAF-6、miR-146a 和miR-155 基因參與脊髓型頸椎病的NF-κB 信號調(diào)控，且經(jīng)過經(jīng)miRNA 模擬物/抑制物轉(zhuǎn)染后，隨著轉(zhuǎn)染時間延長TLR4、TRAF-6 和miR-155 基因表達水平明顯下降，說明這三種基因可作為NF-κB信號調(diào)控的主要基因。同時此次試驗中，證實造模成功后大鼠髓核細胞表達的MyD88 蛋白及NF-κB 信號蛋白P65 的水平均升高，說明MyD88蛋白參與NF-κB 信號傳導(dǎo)，同時對調(diào)控NF-κB 信號蛋白p65 表達具有促進作用；結(jié)合miRNA 模擬物/抑制物轉(zhuǎn)染后，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長髓核細胞中TLR4、TRAF-6 和miR-155 基因的表達水平下降，進一步證實MyD88 蛋白及NF-κB 信號蛋白P65 可通過與TLR4、TRAF-6 和miR-155 基因協(xié)同表達，刺激NF-κB 信號通路釋放炎性因子刺激脊髓型頸椎病的病情加重。本研究結(jié)果與陳進城等和張圓芳等的報道的兔脊椎病模型相同［14-15］，從而進一步有效證實circRNA 可基于關(guān)鍵基因miR-155、TLR4 和TRAF-6 對NF-κB 信號通路調(diào)節(jié)，抑制這些基因的表達對疾病防控具有重要意義。

綜上所述，circRNA 可通過關(guān)鍵基因miR-155、TLR4 和TRAF-6 的表達調(diào)控NF-κB 信號通路釋放炎性因子，抑制circRNA 關(guān)鍵基因的表達對脊髓型頸椎病的病情控制具有重要意義。