丁亞輝，陳艷，高雅芳，王程健，杜穎

（1.浙江省人民醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 杭州 310014；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院 研究生院，安徽 蚌埠 233030）

斑塊的不穩(wěn)定性會(huì)增加不良心血管事件的發(fā)生率，其中易損斑塊破裂引起的血栓事件是引起嚴(yán)重不良事件的主要原因［1］。易損斑塊的早期診斷識(shí)別有助于盡早采取積極措施降低不良事件的發(fā)生。磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）可通過(guò)多參數(shù)序列獲得較高的軟組織對(duì)比度從而提高斑塊成分的識(shí)別能力，有助于識(shí)別易損斑塊［2］。近幾年為了進(jìn)一步提高M(jìn)RI 對(duì)特定組織的分辨能力，結(jié)合分子靶向技術(shù)的磁共振成像技術(shù)得到了重視和發(fā)展。本研究對(duì)Fe5C2碳化鐵納米顆粒進(jìn)行P-選擇素抗體/熒光修飾，制備一種靶向易損斑塊的MRI/熒光雙模對(duì)比劑并進(jìn)行了體外血栓和動(dòng)物活體成像研究。

1 材料和方法

1.1 碳化鐵納米顆粒合成

在油胺與十八烯組成的混合溶劑中加入適量誘導(dǎo)劑溴化胺，在180℃下加入前驅(qū)體Fe(CO)5并保溫60 min 得到bcc-Fe 晶種。將bcc-Fe 晶種加入到十八胺后再加入適量鹵化胺，將體系升溫到250～350°C 保溫120 min，催化有機(jī)相中的有機(jī)物斷裂與碳化，促使bcc-Fe 晶種碳化成Fe5C2碳化鐵納米顆粒。

1.2 納米顆粒表面修飾

1.2.1 親和素-生物素化碳化鐵納米顆粒（以下簡(jiǎn)稱親和素納米顆粒）制備 取100μL 碳化鐵納米顆粒和100 mg 氨基PEG2000-生物素（廣州碳水生物科技）溶解于2 mL 二氯甲烷中，并加入0.4 mL雙蒸水后用超聲波震蕩儀聲震60 s。將所得產(chǎn)物與10 mL 3% 聚乙烯醇溶液混合，并用均質(zhì)機(jī)以15 000 rpm 均質(zhì)5 min，最后加入20 mL 2%異丙醇溶液在室溫下攪拌2 h，讓有機(jī)溶劑充分揮發(fā)。使用PBS 溶液離心洗滌3 次（4 000 rpm,5 min），去上清以去除未反應(yīng)的氨基PEG2000-生物素，收集沉淀獲取生物素化的碳化鐵納米顆粒。每1 mg 生物素化的碳化鐵納米顆粒用10 μg Dylight649 標(biāo)記親和素（BioLegend,美國(guó)）進(jìn)行孵育，以封閉納米顆粒表明的所有生物素基團(tuán)。在室溫下緩慢搖晃孵育30 min，并用PBS 反復(fù)離心洗滌上述懸液3 次（4 000 rpm,5 min），去上清以去除未反應(yīng)的親和素，收集獲得純化的親和素納米顆粒。使用透射掃描電鏡對(duì)樣品的尺寸和形態(tài)進(jìn)行表征。

1.2.2 生物素化P-選擇素抗體的制備 稱取2 mg Sulfo-NHS-LC-Biotinylation（ApexBio,美國(guó)），加入400 μL 無(wú)菌超純水充分溶解。將200 μL P-選擇素抗體（Biovision,美國(guó)）加入現(xiàn)配置的D-生物素-NHS（上海阿拉丁生化科技）溶液10 μL 中，搖勻，冰育2 h，取出反應(yīng)產(chǎn)物，滴入脫鹽柱中，1 000 g 離心2 min，除去緩沖反應(yīng)產(chǎn)物和過(guò)剩的生物素試劑。用生物素定量試劑盒（武漢華美生物）計(jì)算樣品中的生物素的濃度，并計(jì)算生物素/抗體偶聯(lián)比。

1.2.3 計(jì)算與氨基PEG2000-生物素以1∶3 摩爾比率的生物素化P-選擇素抗體 加入親和素納米顆粒懸液中，并在微孔板震蕩器上25℃孵育0.5 h，再以PBS 重懸洗滌上述反應(yīng)液，4 000 rpm 5 min離心3 次，棄上清以除去多余的生物素化抗體，即可得到純化的攜帶P-選擇素抗體的親和素納米顆粒（以下簡(jiǎn)稱P-選擇素納米顆粒）。

1.3 體外血栓模型檢測(cè)

取小鼠血液3 mL，加入凝血酶100 u，二磷酸腺苷0.5 mg 充分混合后迅速注入2 mm 內(nèi)徑的塑料管路中，以37℃恒溫孵育30 min。取長(zhǎng)度約3 cm的血栓兩段，一端用絲線固定后，分別在相同濃度的親和素納米顆粒和P-選擇素納米顆粒試劑中浸泡反應(yīng)10 min，然后置入自制的流動(dòng)腔沖洗裝置中，用PBS 溶液以10 cm/s 持續(xù)沖洗15 min，取出后用1%瓊脂糖溶液固定。使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)血栓進(jìn)行成像，使用654 nm 激發(fā)光激發(fā)熒光，以670 nm 進(jìn)行熒光成像拍照，選定血栓成像的感興趣區(qū)（region of interesting，ROI）進(jìn)行量化測(cè)定并進(jìn)行。

1.4 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊在體磁共振檢測(cè)

6 周齡ApoE-/-小鼠喂食高脂高膽固醇飼料（含15% 的脂肪和0.25% 的膽固醇）連續(xù)24 周，取主動(dòng)脈組織做冰凍切片，使用H&E 染色確認(rèn)斑塊造模成功。

將6 只ApoE-/-小鼠分為三組，從尾靜脈注射300μL 濃度為0.3 mg/mL Fe 的親和素碳化鐵納米顆粒（親和素組）、P-選擇素碳化鐵納米顆粒（P-選擇素組）對(duì)比劑以及300μL PBS 溶液（對(duì)照組）經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，在注射后的24 h 進(jìn)行MRI 成像。小鼠麻醉后固定為仰臥位，將小鼠的心胸部放置于掃描區(qū)域。采用德國(guó)Bruker 公司BioSpec 70/20 USR 7.0T 小動(dòng)物磁共振，掃描序列及參數(shù)：T1 FLASH 序列，重復(fù)時(shí)間（TR）：40.8 ms，回波時(shí)間（TE）：2.3 ms，flip angel=40.0°，視野（FOV）：2.5×2.5 cm2；矩陣：256×256，層厚/層間距：1.0 mm/1.2 mm；T2 TurboRARE 序列，TR：800.0 ms，TE：25.0 ms，flip angel=90.0°，F(xiàn)OV：2.5×2.5 cm2；矩陣：256×256，層厚/層間距：1.0 mm/1.2 mm。T1 FLASH 序列圖像使用ImageJ 軟件比較分析主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊信號(hào)的鈣化，畫(huà)出ROI 測(cè)定MRI 信號(hào)強(qiáng)度，并與鄰近肌肉的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度（relative signal intensity，rSI）。rSI=SIplaque/SImuscle。選擇3 個(gè)斑塊層面圖像，每個(gè)斑塊區(qū)域和鄰近肌肉各設(shè)定三個(gè)ROI 進(jìn)行測(cè)量，取平均值后計(jì)算rSI。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)MRI 圖像分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒特征

使用透射掃描電鏡檢測(cè)顯示，親和素碳化鐵納米顆粒的直徑（15.98±2.11）nm（10.46 nm～21.45 nm），殼層結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為非晶體結(jié)構(gòu)，大小基本一致，呈散在分布（見(jiàn)圖1）。使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)親和素納米顆粒和P-選擇素納米顆粒試劑樣本進(jìn)行熒光成像檢測(cè)，證實(shí)Dylight649 標(biāo)記的親和素與碳化鐵納米顆粒偶聯(lián)成功。

圖1 親和素碳化鐵納米顆粒的透射掃描電鏡圖

2.2 體外血栓熒光成像

對(duì)每個(gè)血栓樣本取三個(gè)ROI 區(qū)域進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定并取平均值，結(jié)果顯示P-選擇素碳化鐵納米顆粒組的熒光強(qiáng)度平均比親和素碳化鐵納米顆粒的熒光強(qiáng)度升高21%。

2.3 小鼠主動(dòng)脈斑塊MRI 成像

MRI 圖像顯示小鼠主動(dòng)脈管壁均有增厚和斑塊形成。結(jié)果顯示，P-選擇素組相比親和素組和對(duì)照組有更高的rSI 值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），P 選擇素組和其他兩組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（與對(duì)照組比較P=0.004，與親和素組比較P=0.001），親和素組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。同時(shí)在對(duì)比P-選擇素組同一易損斑塊的T1 FLASH 和T2 TurboRARE 圖像可以發(fā)現(xiàn)，易損斑塊在T1 FLASH 上呈現(xiàn)明顯的高信號(hào)（更亮，圖2 左側(cè)箭頭），而在T2 TurboRARE上則為明顯的低信號(hào)（更暗，圖2 右側(cè)箭頭），對(duì)比度明顯增強(qiáng)（見(jiàn)圖2）。

圖2 P-選擇素組T1 FLASH 序列圖像

表1 不同對(duì)比劑小鼠主動(dòng)脈斑塊MRI 相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的差異（）

表1 不同對(duì)比劑小鼠主動(dòng)脈斑塊MRI 相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的差異（）

注：1）與對(duì)照組比較，P=0.173；2）與對(duì)照組比較，P=0.004；3）與親和素組比較，P=0.001。

3 討論

順磁性對(duì)比劑可以增強(qiáng)MRI 的T1 信號(hào)（更亮），降低T2 信號(hào)（更暗），從而提高M(jìn)RI 的圖像對(duì)比度。氧化鐵納米顆粒是常用的MRI 對(duì)比劑，但其磁化強(qiáng)度中等對(duì)比增強(qiáng)效果欠佳。因此人們?cè)鴩L試使用CoFe、FePt 等，但這些納米顆粒材料會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的粒子聚集且大多數(shù)具有高毒性，因此限制了其應(yīng)用［3］。鐵碳化物（Fe3C、Fe5C2和Fe7C3）主要用于合金及硬質(zhì)涂層，具有良好的磁性。因此近幾年碳化鐵納米顆粒作為一種具有高磁化強(qiáng)度的新型材料被關(guān)注，尤其是Fe5C2?；贔e5C2制作的直徑約20 nm 碳化鐵納米顆粒能夠產(chǎn)生比傳統(tǒng)氧化鐵納米顆粒（Fe3O4）更顯著的MRI對(duì)比度增強(qiáng)（7.0T 時(shí)r2 值為428.5 m/MSvs.232.2 m/MS）［4］。同時(shí)碳化鐵納米顆粒表面的碳可以保護(hù)Fe5C2核不被氧化，在空氣中暴露1 周至2個(gè)月后飽和磁化強(qiáng)度也沒(méi)有明顯變化，而碳化鐵納米顆粒經(jīng)過(guò)酒石酸等包裹后的水溶液穩(wěn)定性好，至少3 個(gè)月的時(shí)間沒(méi)有任何沉淀［3-5］。本研究使用PEG2000 包裹后同樣發(fā)現(xiàn)碳化鐵納米顆粒的穩(wěn)定性很好，水溶液在存放3 個(gè)月以上也未發(fā)生明顯沉淀聚集現(xiàn)象。Fe5C2碳化鐵納米顆粒的毒性也較低，即使用100 μg/mL 濃度的碳化鐵處理，細(xì)胞存活率仍高達(dá)85%以上［4］。Fe5C2碳化鐵納米顆粒相比Fe3O4具有更好的對(duì)比度增強(qiáng)，給BALB/c 小鼠靜脈注射Fe5C2碳化鐵納米顆粒后發(fā)現(xiàn)，肝臟區(qū)域碳化鐵納米顆粒相比氧化鐵納米顆粒的T2 信號(hào)明顯變暗，對(duì)比度增強(qiáng)［4］。在腫瘤顯像中碳化鐵納米顆粒比氧化鐵納米顆粒有更顯著的信號(hào)變化［3］。

易損斑塊容易存在纖維帽破裂和斑塊內(nèi)出血誘發(fā)局部血小板的活化和聚集。血小板激活后，P-選擇素從α 顆粒轉(zhuǎn)移到血小板表面，可以讓特異性抗體與活化的血小板結(jié)合，成為重要的粘附分子［6-7］。因此P-選擇素也被用于活化血小板的重要分子靶標(biāo)［8］。有研究將P-選擇素與超聲微泡橋接，構(gòu)建出具有血栓靶向能力的分子超聲對(duì)比劑，成功應(yīng)用于血管和心房血栓的超聲分子成像［9-10］。本研究體外血管流動(dòng)腔模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P-選擇素抗體化碳化鐵納米顆粒處理的血栓有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，顯示出更好的血栓靶向能力。而在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的活體MRI 檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，P-選擇素組的斑塊的rSI 顯著高于親和素組和對(duì)照組，這表明經(jīng)過(guò)P-選擇素修飾后的碳化鐵納米顆?？梢愿行У陌邢蛞讚p斑塊，提高易損斑塊的對(duì)比度，并且通過(guò)T1 和T2 影像對(duì)比，也有助于更好的識(shí)別易損斑塊。

綜上所述，使用P-選擇素修飾的Fe5C2碳化鐵納米顆?？梢杂行О邢蛞讚p斑塊，提高圖像對(duì)比度，對(duì)于無(wú)創(chuàng)診斷易損斑塊具有積極意義。