劉 靖 代 鵬 羅瀏晗 黃 宇

腸易激綜合征（IBS）是一種腸道功能障礙綜合征，表現(xiàn)為腹部不適或腹痛并伴有排便異常，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。探究IBS的發(fā)病機(jī)制并尋求有效的生物學(xué)標(biāo)志物以評(píng)估患者癥狀和病情嚴(yán)重程度是近年來的研究熱點(diǎn)。研究表明，精神心理因素、胃腸運(yùn)動(dòng)紊亂、腦-腸軸失調(diào)、腸道菌群紊亂等多種因素可導(dǎo)致IBS發(fā)生，其中腦-腸軸失調(diào)使腸道發(fā)生氧化應(yīng)激已成為IBS發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)切入點(diǎn)[3-4]。過氧化物酶1（PRDX1）是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控蛋白[5]。黃韻潔等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，PRDX1可通過控制活性氧（ROS）的水平負(fù)向調(diào)控氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。法尼酯衍生物X受體（FXR）是一種在肝腸系統(tǒng)等組織器官中表達(dá)的膽汁酸受體，屬于激素核受體超家族一員[7]。楊保偉等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR在腹瀉型IBS患者的腸黏膜組織中呈異常表達(dá)。本研究通過檢測PRDX1和FXR在IBS患者腸黏膜組織中的表達(dá)水平，以期明確兩者在IBS發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017年7月至2019年7月蒲江縣人民醫(yī)院收治的72例IBS患者作為研究對(duì)象（設(shè)為IBS組），另選擇同期因痔瘡出血或腸息肉等行內(nèi)鏡下切除手術(shù)的80例復(fù)查者（經(jīng)腸鏡及病理檢查結(jié)果證實(shí)痔瘡出血或腸息肉疾病均痊愈）設(shè)為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)功能性胃腸病羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)確診IBS[9]；（2）病理資料完整；（3）至少 12 周（非連續(xù)性）有腹部不適或疼痛，排便后癥狀緩解；（4）至少12周（非連續(xù)性）排便頻率異常（即＞3次/d或＜3次/周）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)或減退者；（2）伴有腸道器質(zhì)性病變者；（3）心、肝、腎等臟器功能不全者。IBS組中男性43例，女性29例；年齡23～77歲，平均年齡為（53.29±10.67）歲。對(duì)照組中男性40例，女性40例，年齡23～76歲，平均年齡為（53.29±10.51）歲。2組在性別、年齡方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1.079，P＞0.05；t＝0.844，P＞0.05）。所有研究對(duì)象及家屬均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)20170513）。

1.2 主要試劑和儀器

鼠抗人PRDX1多克隆抗體（貨號(hào)ND4672-8）和鼠抗人FXR多克隆抗體（貨號(hào)M9382-9）購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（貨號(hào)627925）、正常山羊血清（貨號(hào)M78320J）、羊抗鼠二抗（貨號(hào)O6721D）和DAB顯色試劑盒（貨號(hào)67869NJ）購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。TRIzol試劑（貨號(hào)MN562J2）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)J6547M）、熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào)N5643MJ）、SYBR Premix Ex Taq試劑盒（貨號(hào)N5643MJ）、PrimeScript RT reagent試劑盒（貨號(hào)ND6527J）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀（型號(hào)7500）和分光光度計(jì) （型號(hào)UV-3672） 購自美國Sigma公司。

1.3 臨床資料收集

收集患者的性別、年齡、病程、消化道癥狀評(píng)分等一般資料，其中消化道癥狀評(píng)分＝排便困難得分＋腹痛/腹脹得分。排便困難分為排便費(fèi)力、肛門阻塞感、排便不盡感和排便急迫感這4項(xiàng)，每項(xiàng)計(jì)分均按照如下標(biāo)準(zhǔn)：無記0分，輕度（偶有發(fā)生）記1分，中度（經(jīng)常發(fā)生）記2分，重度（每次發(fā)生）記3分。排便困難得分為4項(xiàng)分值之和。腹痛/腹脹得分根據(jù)頻率和程度計(jì)分。腹痛/腹脹頻率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無記0分，＜1 d/月記0.5分，1 d/月記1分，3 d/月記1.5分，1 d/周記2分，＞1 d/周記2.5分。腹痛程度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：輕度（腹痛輕微，不影響日?；顒?dòng)）記1分，中度（腹痛較輕，但不可忽視，日?；顒?dòng)尚不需調(diào)整）記2分，重度（腹痛較重，日?；顒?dòng)受影響且需要調(diào)整）記3分。腹脹程度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：輕度（偶有腹脹，30 min 左右得到緩解）記1分，中度（經(jīng)常腹脹，1～2 h不能緩解）記2分，重度（腹脹持續(xù)，超過2 h不能緩解，需服藥后才能緩解）記3分。腹痛得分＝腹痛頻率得分＋腹痛程度得分，腹脹得分＝腹脹頻率得分＋腹脹程度得分，腹痛/腹脹得分＝腹痛得分＋腹脹得分。依據(jù)患者發(fā)病以來的整體感受，由醫(yī)生與患者共同討論完成評(píng)定。

1.4 標(biāo)本采集

IBS組于入院時(shí)、對(duì)照組于復(fù)查時(shí)行結(jié)腸鏡檢查，均在退鏡時(shí)，于距肛門口約20 cm的直腸與乙狀結(jié)腸交界處鉗取5塊腸黏膜組織。其中2塊采用中性甲醛固定24 h后，經(jīng)80%、90%、95%的乙醇及無水乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度約5 μm），供免疫組織化學(xué)研究；其余3塊立即凍存于液氮中，供后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究。

1.5 腸黏膜組織中PRDX1 mRNA和FXR mRNA的表達(dá)水平檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測腸黏膜組織中PRDX1 mRNA和FXRmRNA的表達(dá)水平。使用TRIzol試劑提取所有入組者腸黏膜組織中的總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以RNA為模板，按照PrimeScript RT reagent試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，之后使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，25 ng/μL 的 cDNA 2.0 μL，10 μmol/L 的正、反向引物各 2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。引物由大連寶生生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，PRDX1和FXR均以GADPH作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法分析腸黏膜組織中PRDX1 mRNA和FXRmRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 腸黏膜組織中PRDX1和FXR蛋白水平檢測

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測腸黏膜組織中PRDX1和FXR蛋白的表達(dá)水平。取1.4中的切片，使用二甲苯常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸鹽酸緩沖液微波加熱后進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫下行內(nèi)源性過氧化物酶滅活，PBS洗3次，滴加正常山羊血清封閉15 min，傾去，勿洗；加入鼠抗人PRDX1多克隆抗體（1∶100）及鼠抗人FXR多克隆抗體（1∶100）作為一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶100）室溫孵育10 min，PBS洗3次，DAB顯色5～10 min，蘇木素復(fù)染3 min，1%乙醇鹽酸溶液分化3 s，碳酸鋰返藍(lán)5 s，脫水、透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：光鏡下觀察切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同高倍鏡視野（×200）進(jìn)行結(jié)果判定。PRDX1陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：呈現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于細(xì)胞漿。FXR陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于細(xì)胞膜。按照陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，5個(gè)視野取平均值，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%判定為陰性，≥10%判定為陽性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析IBS患者腸黏膜組織中PRDX1 mRNA和FXRmRNA的表達(dá)水平與消化道癥狀評(píng)分的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組腸黏膜組織中PRDX1 mRNA和FXR mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

IBS組腸黏膜組織中PRDX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.03±0.37，F(xiàn)XRmRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.08±0.03，均低于對(duì)照組（1.96±0.69、0.66±0.21），2組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.192，P＜0.05 ；t＝23.216，P＜0.05）。

2.2 2組腸黏膜組織中PRDX1和FXR蛋白陽性率比較

IBS組腸黏膜組織中PRDX1蛋白陽性率為20.83%，F(xiàn)XR蛋白陽性率為22.22%，均低于對(duì)照組（82.50%、85.00%），2組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝55.442，P＝0.000 ；χ2＝57.895，P＝0.000）。 見表2。

表2 2組腸黏膜組織中PRDX1和FXR蛋白陽性率比較

2.3 IBS組患者腸黏膜組織中PRDX1 mRNA和FXR mRNA的表達(dá)水平與消化道癥狀評(píng)分的相關(guān)性

IBS組患者的消化道癥狀評(píng)分為（8.05±2.03）分。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腸黏膜組織中PRDX1 mRNA的表達(dá)水平與消化道癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.390，P＝0.000），F(xiàn)XRmRNA的表達(dá)水平也與消化道癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.331，P＝0.000）。見圖1、圖2。

圖1 腸黏膜組織中PRDX1 mRNA的表達(dá)水平與消化道癥狀評(píng)分的相關(guān)性

圖2 腸黏膜組織中FXR mRNA的表達(dá)水平與消化道癥狀評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

IBS是一種功能性胃腸病，無器質(zhì)性病變，臨床主要表現(xiàn)為腹部不適或腹痛、排便異常。在歐美國家，IBS的患病率為10%～20%；在中國，IBS的患病率為5.8%～7.5%[10]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并且給患者帶來較大的精神負(fù)擔(dān)。IBS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病率較高，診斷存在一定困難。因此，探究IBS的相關(guān)機(jī)制并尋找有效的生物標(biāo)志物具有重要意義。

有學(xué)者從腦-腸軸互動(dòng)及氧化應(yīng)激的角度探究IBS的發(fā)病機(jī)制，已證實(shí)氧化應(yīng)激與IBS的發(fā)病進(jìn)程有關(guān)[11]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受外界負(fù)面刺激時(shí)，氧化劑與抗氧化劑之間的平衡被破壞，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧分子大量產(chǎn)生和累積，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，造成組織損傷[12-13]。PRDX1是特異性巰基抗氧化蛋白超家族成員之一，主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，其蛋白N端和C端分別含有1個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基（2-Cys），是氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)器[14]。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PRDX1表達(dá)可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，降低HepG2細(xì)胞的存活率[15]。由此推測，PRDX1異常表達(dá)可能通過氧化應(yīng)激參與IBS的發(fā)生和發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，IBS組腸黏膜組織中PRDX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量及PRDX1蛋白陽性率均顯著低于對(duì)照組，這提示PRDX1表達(dá)與IBS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，與上述研究結(jié)論相符。FXR是一種膽汁酸受體，參與肝腸循環(huán)，通過調(diào)控參與代謝的關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的代謝調(diào)節(jié)作用，膽汁酸介導(dǎo)FXR的激活成為能量穩(wěn)態(tài)維持、糖與脂肪代謝等過程的主要途徑[16-17]。劉立萍等[18]的研究表明，苓桂樹甘湯可能通過上調(diào)FXR表達(dá)調(diào)節(jié)腸道菌群，從而發(fā)揮對(duì)瘦素缺陷代謝紊亂模型小鼠骨損傷的保護(hù)作用。Torres等[19]的研究顯示，F(xiàn)XR介導(dǎo)的機(jī)制可防止膽汁酸累積，保護(hù)腸道上皮屏障的完整性，防止腸道炎性反應(yīng)發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，IBS組腸黏膜組織中FXRmRNA的相對(duì)表達(dá)量及FXR蛋白陽性率均顯著低于對(duì)照組，這提示FXR表達(dá)可能與IBS的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。IBS患者的癥狀嚴(yán)重程度常以消化道癥狀評(píng)分表示，分值越高提示癥狀越嚴(yán)重[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IBS患者腸黏膜組織中PRDX1 mRNA和FXRmRNA的表達(dá)水平均與消化道癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，這提示PRDX1 mRNA和FXRmRNA的表達(dá)水平均與IBS病情嚴(yán)重程度有關(guān)，進(jìn)一步說明PRDX1和FXR可能參與了IBS的發(fā)生和發(fā)展過程。

綜上所述，PRDX1和FXR在IBS患者腸黏膜組織中的表達(dá)水平較低，且均與患者消化道癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，可能共同參與了IBS的發(fā)生和發(fā)展過程。本研究存在一定不足，如樣本量較少，并且對(duì)照組為因痔瘡出血或腸息肉等人群，缺少“無器質(zhì)性”疾病人群數(shù)據(jù)，后期將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證本文結(jié)論。