肖梅仙 王 波 匡 黎 李洪波

胃癌在中國的發(fā)病率和病死率均較高，根據(jù)發(fā)病部位不同，其可分為近端胃癌和遠(yuǎn)端胃癌[1]。遠(yuǎn)端胃癌是指發(fā)生于胃大彎和胃小彎下1/3處連線以下的胃癌，其發(fā)病率高于近端胃癌[2]。研究表明，1997年至2017年間中國遠(yuǎn)端胃癌患者的總生存期（OS）增長率為67.7%，低于近端胃癌（91.7%）[3]。根治性手術(shù)是目前治療胃癌的有效手段，但由于多數(shù)患者確診時已處于中晚期，患者的5年生存率低于5%[4]。腫瘤免疫微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要環(huán)境因素。近年來，免疫治療已成為腫瘤治療方面的研究熱點。研究表明，有效的腫瘤免疫治療依賴于T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[5]。根據(jù)T淋巴細(xì)胞受體（TCR）的不同，可將T淋巴細(xì)胞分為γδT淋巴細(xì)胞和αβT淋巴細(xì)胞。雖然人體內(nèi)的γδT淋巴細(xì)胞在全部T淋巴細(xì)胞中的占比＜10%，但其在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用[6]。陳新孚等[7]通過分析人胃癌組織中γδT淋巴細(xì)胞亞群變化發(fā)現(xiàn)，CD27+γδT淋巴細(xì)胞亞群是胃癌組織中的優(yōu)勢細(xì)胞亞群。本研究探討了CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達與遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期進一步明確γδT淋巴細(xì)胞在胃癌發(fā)病中的作用，為胃癌的診斷、治療及預(yù)后預(yù)測提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年3月至2020年3月在十堰市國藥東風(fēng)總醫(yī)院接受根治性手術(shù)的102例遠(yuǎn)端胃癌患者，收集術(shù)后患者的胃癌組織和癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm）標(biāo)本，制備單細(xì)胞懸液，保存于-80 ℃冰箱。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～80歲；（2）經(jīng)術(shù)前胃鏡活體組織病理檢查、術(shù)中觀察及術(shù)后病理檢查結(jié)果證實為原發(fā)性遠(yuǎn)端胃癌[8]，病理類型為腺癌；（3）術(shù)前未進行放射、化學(xué)、生物及免疫治療；（4）病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他惡性腫瘤史；（2）合并心、肝、腎等重要器官功能不全；（3）轉(zhuǎn)移性胃癌；（4）妊娠期或哺乳期婦女；（5）智力、精神或意識障礙。102例患者中男性64例，女性38例，年齡32～75歲，平均年齡為（49.38±11.23）歲，平均BMI為（23.48±4.87）kg/m2。所有患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集

記錄遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、身高、體質(zhì)量、吸煙情況、飲酒情況、血清癌胚抗原（CEA）水平、血清CA19-9水平、腫瘤TNM分期、腫瘤最大徑、發(fā)病部位、分化程度、血管侵犯情況、神經(jīng)侵犯情況及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

采用ELISA法測定血清CEA和CA19-9水平。抽取患者術(shù)后空腹靜脈血4 mL，以3 000 r/min離心5 min，分離血清樣本，使用ELISA試劑盒（購自上海哈靈生物科技有限公司，貨號分別為HL10309、HL10636）和Multiskan FC型酶標(biāo)儀（購自美國賽默飛世爾公司）測定血清CEA和CA19-9水平。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：CEA＞15 ng/mL為陽性，CA19-9＞39 U/mL為陽性。

1.3 CD27+ γδT 淋巴細(xì)胞表達檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD27+γδT淋巴細(xì)胞的表達。取凍存的組織勻漿制備單細(xì)胞懸液，滴加淋巴細(xì)胞分離液（購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，貨號HLSM1077），以1 500 r/min離心15 min；取沉淀加入無菌PBS溶液（購自上海恒斐生物科技有限公司，貨號PYG0021），以1 000 r/min離心10 min；PBS沖洗，調(diào)整細(xì)胞密度至5×106/mL。取流式細(xì)胞管，加入100 μL細(xì)胞懸液，每個樣本設(shè)置2根對照管，其中1根加入20 μL FITC標(biāo)記的抗TCR γδ抗體（購自上海博奧派克生物科技有限公司，貨號1780-02）和PE標(biāo)記的抗CD27抗體（購自上海滬震實業(yè)有限公司，貨號HZ-2491R），另1根加入20 μL FITC標(biāo)記的抗IgG1抗體（購自上海雅吉生物科技有限公司，貨號C03-11001）和PE標(biāo)記的抗IgG2抗體（購自武漢艾美捷科技有限公司，貨號9060），室溫避光反應(yīng)15 min；加入2 mL PBS，以1 000 r/min離心5 min，取沉淀。使用1%多聚甲醛溶液（購自上海集奇生物科技有限公司，貨號MM1507）固定細(xì)胞，2～8 ℃避光保存待用；以淋巴細(xì)胞設(shè)門，24 h內(nèi)使用FACS Aria Ⅱ型流式細(xì)胞儀（購自美國BD公司）檢測CD27+γδT淋巴細(xì)胞的表達，應(yīng)用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 隨訪

術(shù)后采用電話或門診復(fù)診的方式對所有患者進行為期2年的隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪時間截至2022年3月31日，以患者死亡作為終點事件，計算OS。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組及以上的比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以例（%）表示。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞的表達與患者臨床病理特征的相關(guān)性。繪制Kaplan-Meier曲線，采用Log-rank檢驗分析胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞的表達與患者預(yù)后的關(guān)系。采用ROC曲線分析γδT淋巴細(xì)胞的表達判斷患者預(yù)后的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中CD27+ γδT淋巴細(xì)胞表達比較

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者的胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞的占比為（66.38±2.12）%，顯著高于癌旁組織［（52.34±1.97）%］，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝48.997，P＝0.000）。見圖 1。

圖1 胃癌組織和癌旁組織中CD27+ γδT淋巴細(xì)胞的表達情況 A 胃癌組織 B 癌旁組織

2.2 不同臨床病理特征的患者胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達比較

由表1可知，Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞占比分別高于Ⅰ～Ⅱ期、未分化及低/中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；而不同年齡、性別、BMI、血清CEA水平、血清CA19-9水平、腫瘤最大徑、發(fā)病部位，以及是否吸煙、飲酒、血管侵犯、神經(jīng)侵犯的患者的胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞占比的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 不同臨床病理特征的患者的胃癌組織中CD27+ γδT淋巴細(xì)胞表達比較

2.3 胃癌組織中CD27+ γδT淋巴細(xì)胞表達與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達與遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者的腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈顯著正相關(guān)（P均＜0.05）。見表2。

表2 CD27+ γδT淋巴細(xì)胞表達與臨床病理特征的相關(guān)性分析

2.4 胃癌組織中CD27+ γδT淋巴細(xì)胞表達與患者預(yù)后的關(guān)系

遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者的胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞占比的中位數(shù)為64.87%，以此將患者分為高表達組（＞64.87%，57例）和低表達組（≤64.87%，45例），結(jié)果顯示高表達組的OS為（14.46±3.32）個月，顯著短于低表達組[（18.84±3.41）個月]，2組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝6.537，P＝0.000）。見圖 2。

圖2 不同CD27+ γδT淋巴細(xì)胞表達的患者的預(yù)后比較

2.5 CD27+ γδT淋巴細(xì)胞表達判斷患者預(yù)后的效能

ROC曲線分析結(jié)果表明，CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達判斷遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后的敏感度為71.82%，特異度為74.24%，曲線下面積（AUC）為0.763（95%CI：0.612～0.867）。見圖 3。

圖3 CD27+ γδT淋巴細(xì)胞表達判斷患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

據(jù)報道，胃腸道腫瘤占全球惡性腫瘤發(fā)病例數(shù)的26%，占全部死亡例數(shù)的35%，其中胃癌是亞洲地區(qū)較為常見且疾病負(fù)擔(dān)較重的胃腸道腫瘤之一[9-10]。目前臨床用于評估胃癌根治術(shù)后患者遠(yuǎn)期預(yù)后的指標(biāo)主要有TNM分期[11]、AJCC分期[11]、血清學(xué)檢查[12]、影像學(xué)檢查[13]等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤程度與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[14]。既往研究表明，T淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫的關(guān)鍵組成部分[15]。γδT淋巴細(xì)胞可通過其表面自然殺傷細(xì)胞受體，以及分泌IL-17、TNF-α等細(xì)胞因子等方式起到直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[16]。

隨著對γδT淋巴細(xì)胞的研究不斷深入，其在腫瘤靶向免疫治療中顯示出巨大潛力[17]。吳彥霖等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中γδT淋巴細(xì)胞表達與患者臨床分期相關(guān)，且γδT淋巴細(xì)胞高表達的患者預(yù)后更佳。劉磊等[19]分析了γδT淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞癌患者根治性肝切除術(shù)后預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)癌旁肝星狀細(xì)胞與γδT淋巴細(xì)胞的比值越高，可能預(yù)示著預(yù)后不良的風(fēng)險越高。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者的胃癌組織和癌旁組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞占比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞占比顯著高于癌旁組織，與以往研究結(jié)果相符[7]，這提示CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達上調(diào)可能參與了胃黏膜病變發(fā)生癌變的過程。此外，本研究通過比較不同臨床病理特征的患者的胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD27+γδT淋巴細(xì)胞在Ⅲ～Ⅳ期、高分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的胃癌組織中表達上調(diào)，且相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達與遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者的腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈顯著正相關(guān)，上述結(jié)果表明CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達上調(diào)可能參與了胃癌的進展過程，其有可能成為胃癌診斷和治療的新靶點。之后，本研究比較了胃癌組織中CD27+γδT淋巴細(xì)胞高表達組與低表達組的OS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達組的OS顯著短于低表達組，這提示CD27+γδT淋巴細(xì)胞高表達預(yù)示著預(yù)后不良的風(fēng)險增高。ROC曲線分析結(jié)果顯示，CD27+γδT淋巴細(xì)胞表達判斷遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后的敏感度、特異度、AUC分別為 71.82%、74.24% 和 0.763，這提示 CD27+γδT淋巴細(xì)胞可能成為評估遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，但其實際應(yīng)用價值仍有待進一步證實。

綜上所述，CD27+γδT淋巴細(xì)胞可能參與了遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程，其表達判斷根治術(shù)后患者預(yù)后的效能較高。本研究尚存在一定不足，如僅探討了CD27+γδT淋巴細(xì)胞在遠(yuǎn)端胃癌組織中的表達，未對γδT淋巴細(xì)胞的其他亞群進行分析，也未能比較其在近端胃癌組織中的表達情況，擬在今后進一步探究。