袁姣姣 余 洋 向仍運(yùn)

全球范圍內(nèi)，胰腺癌居惡性腫瘤相關(guān)死亡原因的第4位，患者的5年生存率僅為4%[1]。早期胰腺癌缺乏典型癥狀，確診時(shí)多為中晚期。臨床上用于診斷胰腺癌的血清學(xué)標(biāo)志物包括CA19-9、癌胚抗原（CEA）等，但CA19-9存在假陽(yáng)性問(wèn)題，而CEA的特異度較低[2]。因此，尋找能夠有效診斷早期胰腺癌的血清學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。外泌體是直徑為30～150 nm的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)小體，在細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。外泌體Ephrin A型受體2（Exo-EphA2）是具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展作用的重要因子，其能夠通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中MAPK，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及機(jī)體對(duì)化學(xué)治療藥物耐藥性的形成[3]。羧肽酶A1（CPA1）基因位于7q32.2，為鋅金屬蛋白酶家族成員，主要表達(dá)于胰腺細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中CPA1的表達(dá)水平顯著升高，導(dǎo)致胰腺細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，從而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[4-5]。本研究通過(guò)檢測(cè)胰腺癌患者的血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平，探討其在胰腺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 —般資料

選擇2018年1月至2020年1月吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的82例胰腺癌患者作為研究對(duì)象（設(shè)為胰腺癌組），并選擇同期該院的60名健康體檢者設(shè)為對(duì)照組，收集所有入組者的臨床資料。胰腺癌組中男性42例，女性40例；年齡42～74歲，平均年齡為（63.78±8.08）歲；腫瘤最大徑≤4 cm者50例，＞4 cm者32例；腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期28例；分化程度高/中分化47例，低分化35例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移20例。對(duì)照組中男性33人，女性27人；年齡41～73歲，平均年齡為（62.07±8.24）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均接受根治性手術(shù)或姑息性手術(shù)治療，經(jīng)病理檢查確診為胰腺癌；（2）為初次診治，既往無(wú)放射治療、化學(xué)治療或免疫治療史；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他器官惡性腫瘤；（2）有急、慢性感染性疾病或自身免疫??；（3）有嚴(yán)重的心、肺功能不全。所有入組者均對(duì)本研究知情同意并簽字，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào) 201705101）。

1.2 觀察指標(biāo)

收集所有入組者的一般臨床資料，包括年齡、性別、BMI、糖尿病史、吸煙情況、血清總膽固醇（TC）及三酰甘油（TG）水平。記錄胰腺癌組患者的腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、分化程度、TNM分期等臨床病理特征。

1.3 血清外泌體分離

對(duì)照組體檢時(shí)抽取空腹靜脈血5 mL，胰腺癌組患者入院后第1天抽取空腹靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清。血清Exo-EphA2蛋白分離步驟：取300 μL血清，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，加入70 μL外泌體純化試劑（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)EX0010），顛倒混合均勻后靜置于4 ℃環(huán)境1 h，4 ℃條件下以2 000 r/min離心30 min，棄上清液，以相同轉(zhuǎn)速再次離心5 min，去除上層液體組分，用100 μL buffer溶解, 保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.4 血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)450 nm處OD值，并計(jì)算每孔樣品的濃度。試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧生物科技有限公司（貨號(hào)JN2139）。所有樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平的相關(guān)性。采用單因素和多因素logistic回歸法分析胰腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。采用ROC曲線評(píng)估血清Exo-EphA2、CPA1、CA19-9單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷胰腺癌的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組的一般資料比較

與對(duì)照組相比，胰腺癌組的血清Exo-EphA2、CPA1、CA19-9表達(dá)水平，以及血清TG水平、有糖尿病史患者占比均較高，而BMI、血清TC水平均較低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。2組在性別、年齡、吸煙者占比方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 2組的一般資料比較

2.2 血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

由表2可知，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者的血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平分別高于高/中分化、Ⅰ～Ⅱ期和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；而不同性別、年齡、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的患者的血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表2 血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平的相關(guān)性

結(jié)果顯示，血清Exo-EphA2表達(dá)水平與血清CPA1、CA19-9表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)（r＝0.572，P＝0.000；r＝0.610，P＝0.000）， 血 清 CPA1表 達(dá)水平與CA19-9表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r＝0.503，P＝0.000）。

2.4 影響胰腺癌發(fā)生的單因素和多因素logistic回歸分析

將是否發(fā)生胰腺癌作為因變量，將年齡、性別（1＝男，0＝女）、糖尿病史（1＝有，0＝無(wú)）、吸煙情況（1＝有，0＝無(wú)）、BMI、血清TC和TG，以及血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9作為自變量，納入單因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示有糖尿病史、血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9是胰腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。見表3。將單因素分析中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)（P＜0.05）納入多因素logistic回歸模型，結(jié)果顯示血清Exo-EphA2、CPA1、CA19-9高表達(dá)及有糖尿病史是胰腺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

表3 單因素logistic回歸模型分析影響胰腺癌發(fā)生的因素

表4 多因素logistic回歸模型分析影響胰腺癌發(fā)生的因素

2.5 血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷胰腺癌的效能比較

血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷胰腺癌的AUC分別為0.756、0.752、0.682和0.862，聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能顯著高于單獨(dú)檢測(cè)（Z＝2.046，P＝0.041；Z＝2.014，P＝0.044；Z＝5.510，P＝0.000）。見表 5、圖 1。

表5 血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷胰腺癌的效能比較

圖1 血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷胰腺癌的ROC曲線

3 討論

胰腺癌是惡性程度較高的消化道腫瘤，多數(shù)患者在確診時(shí)已出現(xiàn)腹部腫塊、惡病質(zhì)等晚期癥狀，失去行根治性手術(shù)的時(shí)機(jī)[6]。CA19-9是臨床上常用的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物，但其單獨(dú)檢測(cè)診斷胰腺癌的敏感度較低[7-9]。因此，尋找新的胰腺癌早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志物，或通過(guò)多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的方式，可能有助于提高胰腺癌的早期診斷率。

腫瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的外泌體能夠攜帶蛋白及核酸等物質(zhì)，通過(guò)重塑腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的構(gòu)成和功能，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10-11]。EphA2基因?qū)儆诘鞍桌野彼峒っ讣易宄蓡T，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，EphA2在胃癌[12]、乳腺癌[13]等腫瘤中高表達(dá)，其通過(guò)激活YES相關(guān)蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌患者血清Exo-EphA2高表達(dá)，并且其是胰腺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這提示血清Exo-EphA2高表達(dá)可能促進(jìn)了胰腺癌的發(fā)生。胰腺癌組織中Exo-EphA2表達(dá)水平升高的機(jī)制可能與非編碼RNA的表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124能夠靶向結(jié)合EphA2 mRNA的3＇非編碼區(qū)，降低EphA2 mRNA的穩(wěn)定性，抑制EphA2蛋白表達(dá)，而胰腺癌細(xì)胞中miR-124表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致EphA2表達(dá)上調(diào)[14]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌患者的血清Exo-EphA2表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示Exo-EphA2參與促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，EphA2能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期依賴激酶6的表達(dá)，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[15]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞系分泌產(chǎn)生Exo-EphA2，能夠通過(guò)旁分泌及自分泌的方式，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱等化學(xué)治療藥物的抵抗[3]。另有研究表明，Exo-EphA2高表達(dá)的胰腺癌患者3年總生存率僅為14.9%，明顯低于Exo-EphA2低表達(dá)者[16]。由此推測(cè)，Exo-EphA2有潛力作為一種新的胰腺癌標(biāo)志物。

CPA1是由胰腺腺泡細(xì)胞分泌產(chǎn)生的金屬蛋白酶，具有蛋白剪切、酶原抑制等生理功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CPA1基因在胰腺癌中異常表達(dá)，其可能是一種新的胰腺癌標(biāo)志物[4]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌患者血清CPA1高表達(dá)，并且其是胰腺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這提示CPA1可能與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)。研究表明，胰腺癌患者存在CPA1基因突變的現(xiàn)象，由CPA1基因突變產(chǎn)生的異常蛋白突變體誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致慢性炎性反應(yīng)及腫瘤發(fā)生[17]。此外，胰腺癌發(fā)生時(shí)由于胰腺導(dǎo)管阻塞，CPA1被吸收入血，導(dǎo)致其在外周血中的表達(dá)水平顯著升高[18]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌患者的血清CPA1表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示CPA1參與促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展。分析其原因可能是胰腺癌中CPA1的表達(dá)水平升高導(dǎo)致周圍正常胰腺組織細(xì)胞受到溶解性損傷，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[19]。有研究將血清CPA1與CA19-9聯(lián)合檢測(cè)用于診斷胰腺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)能夠有效診斷臨床分期為Ⅰ期的胰腺癌患者，診斷的敏感度為68%～90%[5]。因此，CPA1可能是一種新的胰腺癌標(biāo)志物，可應(yīng)用于胰腺癌的早期診斷。

本研究結(jié)果顯示，血清Exo-EphA2、CPA1表達(dá)水平與血清CA19-9表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胰腺癌的診斷效能顯著高于單獨(dú)檢測(cè)，并且聯(lián)合檢測(cè)可以顯著提高診斷的敏感度，而診斷的特異度也較高，這提示聯(lián)合檢測(cè)有助于彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的不足。因此，聯(lián)合檢測(cè)血清ExoEphA2、CPA1和CA 19-9有助于提高胰腺癌的早期診斷率，或可作為新的診斷胰腺癌的生物標(biāo)志物。

綜上所述，胰腺癌患者的血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表達(dá)水平較高，且其表達(dá)水平與胰腺癌的分化程度、TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9聯(lián)合檢測(cè)具有較高的胰腺癌診斷價(jià)值，有潛力成為新的胰腺癌標(biāo)志物。本研究樣本量有限，有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究，以驗(yàn)證本文結(jié)論。