張翠平,喬鳳昌,張菁菁,許爭峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南京 210004)

DYRK1A基因是位于唐氏綜合征(Down syndrome，DS)關(guān)鍵區(qū)域的高度保守的基因，編碼蛋白為雙底物特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶A，在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)退行性變、神經(jīng)元增殖和分化、樹突和脊柱生長以及突觸傳遞中呈劑量依賴性的作用[1]。DYRK1A基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性智力障礙7型(Mental retardation autosomal dominant 7，MRD7)，也稱為DYRK1A-相關(guān)智力障礙,主要表現(xiàn)為智力障礙、癲癇發(fā)作、語言發(fā)育遲緩、嬰兒期喂養(yǎng)困難以及明顯的顏面部異常，如小頭畸形、眼睛深陷、耳廓異常、耳輪增厚和蒜頭鼻等[2]。目前，有1643個(gè)智力障礙(https://hpo.jax.org/app/browse/term/HP:0001249)相關(guān)的基因和1630個(gè)癲癇(https://hpo.jax.org/app/browse/term/HP:0001250)相關(guān)的基因，種類較多且致病機(jī)制復(fù)雜。本研究應(yīng)用全外顯子測序技術(shù)對1例患有智力障礙和癲癇的患兒及其父母進(jìn)行基因變異分析，明確其遺傳學(xué)病因，為疾病臨床診斷及產(chǎn)前診斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究資料 先證者，男，漢族，11歲，身高150cm，眼睛狹長，牙齒不整齊。早產(chǎn)，出生體重1700g，身長49cm。否認(rèn)家族遺傳性或先天性病史?，F(xiàn)智力低下，智力評分47分(中度智力缺損)；癲癇，每月發(fā)作一次，發(fā)作時(shí)雙拳緊握，全身抽搐，感冒或換季誘發(fā)，經(jīng)藥物治療后緩解。肢體運(yùn)動(dòng)落后，精細(xì)運(yùn)動(dòng)不良，語言重復(fù)，記憶力差，且有尿道下裂，主動(dòng)脈瓣狹窄和斜視。其父母均無相似癥狀，家系圖見圖1A。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),家系成員均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 抽取先證者及其父母外周血各5mL，取400μL應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA。先證者母親孕20周時(shí)抽取羊水15mL，取8mL應(yīng)用羊水基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用于后續(xù)的Sanger驗(yàn)證，剩余羊水樣本離心留沉淀，-80℃冰箱保存。DNA濃度均>60ng/μL，總DNA量>2μg，A260/A280在1.8～2.0之間，A260/A320在1.8～2.3之間，樣本-20℃保存。

1.2.2 全外顯子測序 將先證者及其父母基因組DNA樣本進(jìn)行建庫，采用IDT The xGen Exome Research Panel v1.0全外顯子捕獲芯片捕獲基因組外顯子區(qū)域，使用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行測序。測序結(jié)果用BWA0.6.2-r126軟件與參考基因組(UCSC hg19 Feb.2009)進(jìn)行比對。經(jīng)SAMtool軟件去除重復(fù)序列，GATK軟件局部重新比對和堿基質(zhì)量校正，得到單核苷酸變異(single nucleotide variants，SNVs)和<50bp的短插入/缺失(short insertions and deletions，indels)。運(yùn)用ANNOVAR軟件對SNVs、indels位點(diǎn)進(jìn)行注釋，經(jīng)人類外顯子數(shù)據(jù)庫(ExAC)、參考人群千人基因組(1000G)和人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫(gnomAD)等對變異位點(diǎn)進(jìn)行過濾(最小等位基因頻率<0.05)，PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster等軟件進(jìn)行危害性預(yù)測以及HGMD、ClinVar、OMIM數(shù)據(jù)庫對結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。候選變異位點(diǎn)根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG，2015)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南對突變位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析[3]。

1.2.3 Sanger測序驗(yàn)證 根據(jù)全外顯子測序結(jié)果，用NCBI在線軟件對突變位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由擎科生物科技有限公司合成。引物序列：上游5'-GGCATCTCTTCTACTTAGGAAGGTC-3'，下游3'-GGAAGGCACATTCCCCAAGA-5'，退火溫度60℃，產(chǎn)物大小493bp。PCR反應(yīng)體系25μL，包括12.5μL mix，10μL ddH2O，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL。反應(yīng)條件：95℃ 10min;95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司進(jìn)行一代測序驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與DYRK1A基因轉(zhuǎn)錄本(NM_001347721.2)進(jìn)行序列比對。

1.2.4 產(chǎn)前基因診斷 采用天昊醫(yī)藥公司提供的人類個(gè)體識(shí)別試劑盒，比對羊水樣本與孕婦外周血STR位點(diǎn)，鑒別是否存在母源DNA污染。針對該家系的致病位點(diǎn)，通過Sanger測序?qū)υ袐D羊水樣本進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。

2 結(jié) 果

2.1 全外顯子測序結(jié)果 先證者全外顯子測序捕獲效率為87.81%，目標(biāo)區(qū)域平均測序深度85.57×，其中測序深度20×以上的區(qū)域占目標(biāo)捕獲區(qū)域的98.44%，覆蓋度良好。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)DYRK1A基因(NM_001347721.2)第6號外顯子存在c.504dupT(p.D169*fs*1)的雜合突變(圖1B)，該移碼突變導(dǎo)致基因開放閱讀框發(fā)生改變，進(jìn)而影響蛋白功能(PVS1)；且該突變在ExAC、1000G和gnomAD數(shù)據(jù)庫中頻率為0(PM2)；父母該基因位點(diǎn)均未檢出變異(圖1C)，為新發(fā)突變(PS2)。因此，該位點(diǎn)的致病性評級為致病性變異。OMIM數(shù)據(jù)庫顯示該基因的突變會(huì)導(dǎo)致MRD7。

2.2 Sanger測序驗(yàn)證 先證者DYRK1A基因存在c.504dupT(p.D169*fs*1)雜合突變，父母為野生型，與全外顯子測序結(jié)果一致(圖1C)。

2.3 胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果 先證者母親再次妊娠，孕20周行羊水穿刺。STR位點(diǎn)檢測結(jié)果顯示，胎兒與其母親存在生物學(xué)母子關(guān)系，基因分型結(jié)果表明胎兒DNA未受母體基因組DNA污染。胎兒羊水DNA檢測結(jié)果表明，胎兒該位點(diǎn)不存在DYRK1A基因c.504dupT突變(圖1C)。

圖1 家系圖及測序結(jié)果

3 討 論

DYRK1A基因位于染色體21q22.13區(qū)，含有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子，編碼蛋白長度為763個(gè)氨基酸的雙底物特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶A。該蛋白包含一個(gè)重要的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(Protein Kinase)、Poly-Ser、Poly-His和Ser/Thr-rich等特殊結(jié)構(gòu)，在進(jìn)化上高度保守[4]。該蛋白廣泛表達(dá)于胎兒和成人組織中，且在腦組織中呈高表達(dá)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,如神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)增殖和分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和突觸可塑性等至關(guān)重要[5-6]。據(jù)報(bào)道，DYRK1A基因位于DS的關(guān)鍵區(qū)域，故與DS發(fā)生密切相關(guān)，且其功能呈高度基因劑量依賴性。DS患兒中DYRK1A基因過表達(dá)被認(rèn)為是神經(jīng)發(fā)育改變的主要原因；DYRK1A基因單倍劑量不足引起的表達(dá)降低同樣具有致病性，可導(dǎo)致MRD7[1,7]。

本研究通過全外顯子測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，先證者DYRK1A基因第6號外顯子存在c.504dupT(p.D169*fs*1)雜合突變，經(jīng)父母外周血樣本驗(yàn)證，為新發(fā)突變。通過文獻(xiàn)檢索和HGMD、ClinVar數(shù)據(jù)庫查詢，該變異未曾報(bào)道。其中HGMD數(shù)據(jù)庫共收錄54個(gè)DYRK1A基因變異，主要以錯(cuò)義突變(19/54)、微缺失(10/54)和大片段缺失(11/54)為主。在ClinVar數(shù)據(jù)庫中，DYRK1A基因單核苷酸變異和短插入/缺失(<50bp)導(dǎo)致的致病和可疑致病突變共68例，包括錯(cuò)義突變、移碼突變、剪接位點(diǎn)突變和框內(nèi)蛋白長度改變等，其中移碼突變22例(32.3%)。因移碼突變可引起閱讀框變化，造成下游一系列密碼子改變，推測移碼突變導(dǎo)致的氨基酸序列改變嚴(yán)重影響DYRK1A基因的功能。此患者DYRK1A基因c.504dupT導(dǎo)致的移碼突變使第169位的編碼天冬氨酸(Asp)的密碼子被終止密碼子取代，產(chǎn)生截短蛋白，引起基因開放閱讀框發(fā)生改變。目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分子模型表明，DYRK1A的活性依賴于激活環(huán)中一個(gè)保守的酪氨酸殘基Tyr-321的自磷酸化，而截短蛋白破壞了Protein Kinase結(jié)構(gòu)域(159-479aa)，因此推測該變異影響了DYRK1A的活性，進(jìn)而引起基因功能改變，且已有文獻(xiàn)報(bào)道DYRK1A基因的單倍劑量不足會(huì)導(dǎo)致MRD7[1,8]。

2008年Moller等首次報(bào)道了2例具有小頭畸形、智力障礙、自閉癥和顏面部異常的MRD7患兒。細(xì)胞遺傳學(xué)分析和FISH技術(shù)檢測到患兒染色體易位導(dǎo)致21號染色體DYRK1A基因被斷裂點(diǎn)截?cái)?，從而使該基因功能被破壞[9]。一項(xiàng)由3009例智力障礙患兒組成的大規(guī)模研究強(qiáng)烈支持DYRK1A基因在人類大腦發(fā)育中的作用，DYRK1A基因單倍劑量不足可導(dǎo)致智力障礙相關(guān)綜合征[10]。本課題組前期研究中，已報(bào)道1例DYRK1A基因(c.930C>A,p.Tyr310*)突變導(dǎo)致MRD7的病例，該患兒存在嚴(yán)重智力低下、運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、癲癇和小頭畸形等表型[2]。此外，有研究以非洲爪蟾蜍胚胎為模型，發(fā)現(xiàn)DYRK1A在胚胎腎元中表達(dá)，對泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要，且該研究中有2例DYRK1A突變患者存在尿道下裂的表型[11]。MRD7患者也有眼睛深陷、近視和斜視的報(bào)道[5]。綜上發(fā)現(xiàn)，先證者多種表型，如顏面部異常、智力障礙、癲癇、尿道下裂及斜視等均與MRD7的疾病特征相符。

目前，以智力障礙和癲癇發(fā)作為特征的疾病很多，如Angelman綜合征具有生長發(fā)育遲緩、智力障礙、小頭畸形以及癲癇等表型，脆性X綜合征可表現(xiàn)為智力低下和孤獨(dú)癥譜系障礙，Rett綜合征有手部刻板動(dòng)作、語言缺失、癲癇和發(fā)育遲緩等表現(xiàn)。疾病臨床表型的異質(zhì)性以及各疾病表型特征之間的重疊，使臨床醫(yī)生在疾病鑒別方面仍面臨巨大挑戰(zhàn)，且智力低下和癲癇等表型無法在孕期通過影像學(xué)等手段來發(fā)現(xiàn)，故分子遺傳學(xué)及基因檢測技術(shù)的快速發(fā)展為遺傳性疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供了新方法。本研究通過全外顯子測序發(fā)現(xiàn)患兒DYRK1A基因c.504dupT雜合突變，該突變所導(dǎo)致的MRD7與患兒智力低下、癲癇、語言運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后、尿道下裂、主動(dòng)脈瓣狹窄和斜視的表型相符，為患兒找到了致病原因，同時(shí)對再生育提供指導(dǎo)。在臨床上，先證者父母均不攜帶致病突變時(shí)，一般認(rèn)為是新發(fā)突變，但實(shí)際上并不能排除父母生殖腺嵌合的可能，若為后者其同胞患病風(fēng)險(xiǎn)較群體發(fā)病率增加。本研究在孕婦孕20周時(shí)抽取羊水樣本，對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，經(jīng)驗(yàn)證DYRK1A基因c.504為野生型。

綜上所述，對1例具有智力障礙和癲癇的患兒及其家系進(jìn)行全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)DYRK1A基因c.504dupT(p.D169*fs*1)雜合突變，最終診斷為MRD7。此發(fā)現(xiàn)為該家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了依據(jù)，且豐富了該疾病致病基因變異譜。