吳世麗，張 燕，許 莉

(?？谑袐D幼保健院婦產(chǎn)科，海口 570102)

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，2020年全球女性新發(fā)卵巢癌31萬(wàn)例，中國(guó)6萬(wàn)例，全球女性癌癥死亡卵巢癌患者21萬(wàn)例，中國(guó)卵巢癌患者死亡人數(shù)4萬(wàn)例[1-2]。目前手術(shù)和化療是卵巢癌最主要的治療手段，然而因腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，約60%的卵巢癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，總體療效不好。AXL是受體酪氨酸激酶TAM(Tyro3、Axl、Mertk)家族中的一員，在多種類型腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與化療耐藥及不良預(yù)后相關(guān)，常作為預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物和抗腫瘤治療的靶點(diǎn)[3]。目前關(guān)于AXL的調(diào)控存在很多未知。如RMVar數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，AXL mRNA存在多個(gè)N6-甲基腺苷(m6A)位點(diǎn)，而這些不同位點(diǎn)的功能以及整體的mRNA甲基化水平變化對(duì)于AXL的基因轉(zhuǎn)錄及其功能的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。m6A修飾是近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，m6A修飾是類似于DNA和組蛋白修飾的另一種表觀遺傳調(diào)控，由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(Writers)、脫甲基酶(Erasers)和功能管理者(Readers)組成[4]。ALKB同源物5(ALKBH5)是目前已知的兩種m6A去甲基化酶之一，在腫瘤疾病進(jìn)展惡化方面具有重要的調(diào)控作用。最近，ALKBH5對(duì)許多生物學(xué)過(guò)程的影響已得到證實(shí)，包括腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、骨化等[5-7]。ALKBH5還涉及多種癌癥或非癌癥，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、糖尿病和生殖系統(tǒng)疾病。本文探討了ALKBH5調(diào)控AXL mRNA甲基化水平進(jìn)而影響卵巢癌紫杉醇耐藥的作用機(jī)制，為臨床化療治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 卵巢癌細(xì)胞SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于MEM+10%FBS+100U/mL青霉素(100μg/mL鏈霉素)置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。總RNA提取試劑(北京全式金生物)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物)，GenSeq?m6A MeRIP試劑盒(云序生物)，SYBR染料法熒光定量試劑盒(TaKaRa)；RIPA裂解液(Solarbio，R0010),Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BioLegend)。actinomycin D(Sigma)免疫印跡一抗：ALKBH5抗體(Abcam)，AXL抗體(Abcam)，GAPDH抗體(Abcam)，二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG[天德悅(北京)生物]。ALKBH5過(guò)表達(dá)(NM_017758.4的CDS區(qū)序列)慢病毒、ALKBH5干擾(5'-TATGCTGCTGATGAAATCAC-3')慢病毒、AXL過(guò)表達(dá)(NM_001278599.2的CDS區(qū)序列)慢病毒和AXL干擾(5'-ATGCTGAATGAGAACATGTCC-3')慢病毒由蘇州吉瑪基因公司制備。病毒滴度2×108TU/mL。

1.2 慢病毒感染SKOV-3細(xì)胞 SKOV3細(xì)胞傳代于6孔板培養(yǎng)18h，換新鮮不含血清的MEM培養(yǎng)液，取1μL制備好的sh-ALKBH5慢病毒或sh-AXL慢病毒和1μL polybrene(2μg/mL)加入培養(yǎng)皿，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SKOV3的MOI值為20pfu/cell，熒光顯微鏡下觀察72h的感染效率約為80%。sh-ALKBH5為ALKBH5基因干擾，NC-sh為對(duì)照干擾載體；OE-ALKBH5為ALKBH5基因過(guò)表達(dá)，NC-OE為對(duì)照空載體。

1.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖 按5×103細(xì)胞/孔接種至96孔培養(yǎng)板，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后進(jìn)行sh-ALKBH5慢病毒(或NC)感染，分別加慢病毒0、24、48、72h，每孔加CCK-8溶液10μL，將培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處吸光度值。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.4 RNA穩(wěn)定性試驗(yàn) ALKBH5作為脫甲基酶，能針對(duì)mRNA上的甲基化修飾發(fā)揮作用，精細(xì)調(diào)節(jié)mRNA的翻譯。為了研究其對(duì)mRNA的調(diào)控作用，利用放線菌素D(Actinomycin D)對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用，進(jìn)行mRNA穩(wěn)定性試驗(yàn)。ALKBH5干擾后48h,加放線菌素D(5μg/mL)處理細(xì)胞2、4、6h，收集細(xì)胞，Q-PCR檢測(cè)AXL mRNA?？俁NA提取采用TRIzol一步法，取2μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參(引物序列見(jiàn)表1，F(xiàn)：正向引物；R：反向引物)，按SYBR Green實(shí)時(shí)PCR試劑盒說(shuō)明書配制總體積為20μL的PCR反應(yīng)體系。PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃、5min預(yù)變性;94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。檢測(cè)結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 PCR引物序列

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將NC和sh-ALKBH5感染細(xì)胞分別接種于6孔板，48h后分別給予紫杉醇(paclitaxel,10μmol/L)或CHX(5μg/mL)，培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞并用PBS沖洗2次。將細(xì)胞重懸于500μL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液，加5μL Annexin-V-FITC混合均勻，室溫避光孵育15min，加2.5μL PI染色液避光5min，獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 Western blot 細(xì)胞加入預(yù)冷的RIPA裂解液裂解，超聲破碎；4℃ 12000r/min離心10min收上清。BCA法蛋白定量，加5XSDS上樣緩沖液，97℃加熱6min使蛋白變性。蛋白樣品(30μg/孔)點(diǎn)樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。分離膠濃度10%，跑膠結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗。ALKBH5與AXL一抗稀釋比例1∶1000，GAPDH稀釋比例1∶10000。4℃一抗孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜3次，每次5min。加1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜。加ECL化學(xué)發(fā)光液，置ChemiScope Mini 3300化學(xué)發(fā)光成像儀中拍照，使用Quantity One軟件分析灰度水平。

1.7 AXL m6A甲基化水平檢測(cè) 收集過(guò)表達(dá)或敲低ALKBH5的細(xì)胞，利用RNA提取試劑盒提取total RNA，按GenSeq?m6A MeRIP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。具體步驟：(1)總RNA提取和定量后，取100μg總RNA進(jìn)行RNA片段化，留1～3μg片段化的RNA作為對(duì)照input組，剩余的片段化RNA均用于后續(xù)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)；(2)偶聯(lián)有m6A抗體的免疫沉淀磁珠預(yù)處理，將片段化的RNA加至磁珠中，進(jìn)行免疫沉淀2h，4℃；(3)沉淀后的RNA用清洗buffer進(jìn)行純化；使用純化后的RNA可采用常規(guī)的qPCR法進(jìn)行目的基因定量。

1.8 免疫共沉淀(CO-IP)檢測(cè)ALKBH5與AXL相互作用 sh-ALKBH5慢病毒感染SKOV3細(xì)胞株，0、48、72h后收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞加預(yù)冷的RIPA裂解液裂解，超聲破碎；4℃，12000r/min離心10min收上清。BCA法蛋白定量，取上清200μg總蛋白加5×SDS上樣緩沖液，97℃加熱6min使蛋白變性，留作input。剩余細(xì)胞裂解液上清取1mg總蛋白加入10μg AXL抗體，4℃慢速震蕩，孵育過(guò)夜。次日取10μL protein(A+G)瓊脂糖珠加至上述過(guò)夜孵育的混合液，4℃慢速震蕩孵育2～4h，使瓊脂糖珠與抗體復(fù)合物充分耦聯(lián)。洗滌緩沖液洗抗體-瓊脂糖珠混合物5次，離心將瓊脂糖珠離心至管底，棄上清，沉淀中加15μL 2×SDS上樣緩沖液，97℃加熱變性6min。Western blot法檢測(cè)ALKBH5(44kDa)與AXL(98kDa)的相互作用。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較使用成對(duì)分析(t-test)，多組間比較滿足方差齊性時(shí)采用F檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，觀察的變量整體方差不齊時(shí)采用矯正的單因素方差分析。組間兩兩比較采用ONE-WAY ANOVA中L-S-D法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ALKBH5在卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床生存分析 CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，癌組織中ALKBH5蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組織(P<0.05)(圖1A)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALKBH5高表達(dá)患者的生存率低于ALKBH5低表達(dá)患者(P<0.001,HR=1.43)(圖1B)。

2.2 ALKBH5干擾對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 熒光定量PCR檢測(cè)和Western blot結(jié)果顯示，sh-ALKBH5組細(xì)胞株ALKBH5 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照細(xì)胞株(P<0.05)；OE-ALKBH5組細(xì)胞株ALKBH 5mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于NC-OE組(P<0.01)(圖2A～C)。細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-ALKBH5組的卵巢癌細(xì)胞克隆數(shù)明顯低于NC-sh組，OE-ALKBH5組的細(xì)胞克隆數(shù)明顯高于NC-OE組(圖2D)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，ALKBH5敲低后細(xì)胞增殖能力顯著低于NC對(duì)照細(xì)胞株，ALKBH5過(guò)表達(dá)則促進(jìn)了細(xì)胞增殖(P<0.01)(圖2E、F)。細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示，ALKBH5敲低后卵巢癌細(xì)胞遷移率與NC-sh組相比顯著升高，ALKBH5過(guò)表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞遷移率與NC-OE組相比顯著下降(P<0.05)(圖2G)。

2.3 干擾ALKBH5促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞耐藥性 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ALKBH5干擾后增加細(xì)胞凋亡(P<0.05)，ALKBH5過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡(P<0.05)。紫杉醇處理后，sh-ALKBH5細(xì)胞凋亡率顯著高于NC-sh組(P<0.05),OE-ALKBH5細(xì)胞凋亡率顯著低于NC-OE組(P<0.05)(圖3A、B)。CCK-8結(jié)果顯示，紫杉醇(5μmol/L)處理后，OE-ALKBH5細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照細(xì)胞株，而sh-ALKBH5細(xì)胞增殖能力低于對(duì)照細(xì)胞株(圖3C)。紫杉醇處理細(xì)胞后，ALKBH5干擾細(xì)胞的IC50與對(duì)照NC細(xì)胞的IC50相比約降低41.4%，過(guò)表達(dá)細(xì)胞株約增加39.9%(圖3D)。

2.4 ALKBH5調(diào)控AXL mRNA甲基化水平 gepia2.cancer網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，ALKBH5與AXL存在相關(guān)性(圖4A)。SKOV3細(xì)胞中，ALKBH5過(guò)表達(dá)或敲低后，AXL上調(diào)(P<0.001)或下調(diào)(P<0.05)(圖4B)。ALKBH5敲低后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，AXL依賴性降低(圖4C、D)。利用m6A抗體免疫共沉淀檢測(cè)富集到的甲基化AXL mRNA，結(jié)果顯示ALKBH5敲低，富集到的AXL m6A水平顯著下調(diào)(P<0.01)，而ALBH5過(guò)表達(dá)富集到的AXL m6A水平顯著上調(diào)(P<0.01)(圖4E)。免疫共沉淀蛋白水平上富集到的兩者之間不存在相互作用的現(xiàn)象(圖4F)。利用RMVar數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)AXL mRNA上存在多個(gè)m6A位點(diǎn)(表2)。

圖1 ALKBH5蛋白在卵巢癌中的表達(dá)及其與生存率的相關(guān)性

表2 AXL mRNA上m6A位點(diǎn)

圖2 ALKBH5干擾對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

圖3 ALKBH5過(guò)表達(dá)或敲低對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡和耐藥性的影響

圖4 ALKBH5表達(dá)與AXL m6A甲基化水平的相關(guān)性

2.5 ALKBH5增加AXL mRNA穩(wěn)定性、抑制細(xì)胞凋亡和藥物敏感性 放線菌素D(Actinomycin D)處理SKOV3細(xì)胞，AXL mRNA水平隨時(shí)間逐漸減少，半衰期為5.136h；同樣條件下，處理ALKBH5干擾細(xì)胞株，AXL mRNA半衰期為3.311,明顯低于對(duì)照細(xì)胞(圖5A)。放線菌素D處理shALKBH5細(xì)胞，AXL蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照細(xì)胞株(圖5B、C)。流式結(jié)果顯示，Actinomycin D處理4h后，ALKBH5敲低細(xì)胞凋亡明顯高于未敲低細(xì)胞(圖5D、E)。在SKOV3細(xì)胞上敲低AXL，AXL干擾細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的敏感性增加，過(guò)表達(dá)ALKBH5則逆轉(zhuǎn)了AXL敲低細(xì)胞的IC50(圖5F)。ALKBH5過(guò)表達(dá)，穩(wěn)定了AXL mRNA，抑制了對(duì)紫杉醇的藥物敏感性。

圖5 ALKBH5對(duì)AXL mRNA穩(wěn)定性的影響

3 討 論

遺傳信息由DNA復(fù)制到RNA轉(zhuǎn)錄以及翻譯為蛋白質(zhì)的過(guò)程中，遺傳物質(zhì)會(huì)進(jìn)行多種編輯、調(diào)節(jié)和修飾。目前研究發(fā)現(xiàn)，除了DNA甲基化修飾外，還存在多種RNA修飾，如常見(jiàn)的RNA甲基化修飾包括有6-甲基腺嘌呤(m6A)、5-羥甲基胞嘧啶(hm5C)、假尿嘧啶(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、1-甲基腺嘌呤(m1A)等,在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生物功能調(diào)控[8]。m6A是目前研究較多、也是mRNA中豐度最高的甲基化修飾形式，其生物學(xué)功能主要通過(guò)m6A結(jié)合蛋白發(fā)揮RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。m6A修飾主要由甲基轉(zhuǎn)移酶(編碼器)、去甲基化酶(消碼器)和結(jié)合蛋白(讀碼器)共同調(diào)控，目前已發(fā)現(xiàn)FTO和ALKBH5作為去甲基化酶可去除甲基化，而METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429等作為甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的主要成分發(fā)揮作用[9]。

在腫瘤中，ALKBH5的生物學(xué)功能表現(xiàn)出多樣性，可作為促癌因子和抑癌因子同時(shí)存在。研究發(fā)現(xiàn)，m6A脫甲基酶ALKBH5在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干樣細(xì)胞(GSCs)中表達(dá)顯著升高。沉默ALKBH5可抑制患者來(lái)源的GSC的增殖和自我更新。ALKBH5使FOXM1新生的轉(zhuǎn)錄本脫甲基，導(dǎo)致FOXM1表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的病理進(jìn)程[10]。乳腺癌中，腫瘤細(xì)胞暴露于缺氧環(huán)境會(huì)刺激缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和HIF-2α依賴的AlkB同源物5(ALKBH5)表達(dá)。在NANOG的3'-UTR的m6A殘基處，缺氧以HIF和ALKBH5依賴性方式誘導(dǎo)了NANOG mRNA和蛋白表達(dá)的增加，并增加了乳腺癌干細(xì)胞(BCSC)百分比[11]。作為抑癌因子，ALKBH5在胰腺癌組織中表達(dá)顯著降低，與患者生存率相關(guān)，是判斷胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志物[12]。ALKBH5靶向lncRNA KCNK15-AS1使其去甲基化，也可靶向Wnt信號(hào)通路抑制因子WIF-1，抑制胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[13-14]。

本研究通過(guò)對(duì)CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，卵巢癌組織中ALKBH5高表達(dá)，且與總生存期相關(guān)。猜測(cè)ALKBH5可能起促癌因子的作用。同時(shí)在臨床治療中，卵巢癌患者普遍出現(xiàn)耐藥的現(xiàn)象，推測(cè)ALKBH5與卵巢癌化療耐藥之間可能存在相關(guān)性。當(dāng)敲低ALKBH5后，卵巢癌細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率增加，對(duì)紫杉醇敏感性增加，IC50降低約53%。提示ALKBH5與化療耐藥性存在相關(guān)性。進(jìn)一步對(duì)卵巢癌中與ALKBH5相關(guān)尤其是與耐藥相關(guān)的蛋白分析，發(fā)現(xiàn)ALKBH5與AXL具有相關(guān)性。

AXL屬于受體酪氨酸激酶中的TAM(TYRO3-AXL-MER)家族,在腫瘤耐藥中起重要作用，如在泌尿上皮癌、乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥中高表達(dá)，并介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生[15]。AXL可通過(guò)維持同一途徑替代效應(yīng)子的活性或通過(guò)誘導(dǎo)不同信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的激活導(dǎo)致對(duì)靶向藥物的耐藥性，尤其是對(duì)其他RTK抑制劑的耐藥性[16-17]。如在非小細(xì)胞肺癌中，AXL表達(dá)維持PI3K/AKT和MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)對(duì)EGFR抑制的抵抗。此外，AXL可通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路及影響腫瘤微環(huán)境等促進(jìn)靶向治療耐藥的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中ALKBH5與AXL呈正相關(guān)，敲低ALKBH5后，AXL mRNA表達(dá)水平依賴性降低。鑒于AXL屬于激酶家族成員，用免疫共沉淀法探究蛋白水平上的相互作用，結(jié)果顯示兩者蛋白水平上不存在相互作用，ALKBH5可能是在AXL轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控。進(jìn)一步利用RMVar數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，AXL上存在多個(gè)m6A位點(diǎn)，推測(cè)ALKBH5通過(guò)作用于AXL mRNA上的m6A調(diào)控AXL mRNA表達(dá)。RNA穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，ALKBH5干擾下調(diào)了AXL mRNA半衰期，提示可能由于AXL mRNA上m6A甲基化水平增加促進(jìn)了基因降解；過(guò)表達(dá)ALKBH5使AXLmRNA上m6A甲基化水平降低抑制AXL mRNA降解，進(jìn)而促進(jìn)AXL蛋白表達(dá)。AXL敲低后，細(xì)胞凋亡和對(duì)紫杉醇的敏感性增加，驗(yàn)證了AXL的耐藥功能。以上結(jié)果提示，ALKBH5高表達(dá)具有穩(wěn)定AXL mRNA的功能，進(jìn)而增加了細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性。然而AXL mRNA上具體的m6A修飾位點(diǎn)的功能，如腫瘤細(xì)胞中因m6A修飾而逃避被降解的內(nèi)在機(jī)制有待后續(xù)研究。目前沒(méi)有脫甲基酶ALKNH5的特異性抑制劑，無(wú)法進(jìn)一步證實(shí)ALKBH5對(duì)AXL的去甲基作用，因而新型抑制劑的開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用亟需深入研究。

綜上所述，m6A去甲基化酶ALKBH5在卵巢癌中高表達(dá)，具有穩(wěn)定耐藥基因AXL的功能，可作為化療耐藥的預(yù)測(cè)因子，開(kāi)發(fā)新型ALKBH5抑制劑具有重要的臨床意義。