喬楓

（1.青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海師范大學(xué)，青海 西寧 810016，2.高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，青海師范大學(xué)，青海 西寧 810016）

土壤鹽堿化一直是全球普遍存在的問題之一，嚴(yán)重制約農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展。世界上約20%的灌溉農(nóng)業(yè)土地發(fā)生了土壤鹽滯化［1］。我國的土壤鹽堿化面積達到3 600多萬hm2，約占我國可利用土地面積的4.88%，我國是土壤鹽堿化比較嚴(yán)重的國家之一［2-3］。土壤鹽堿化主要是由自然環(huán)境惡化、灌溉條件匱乏、氣候惡化等造成的［4-5］。由Na2CO3和NaHCO3鹽分引起的土壤鹽堿化，被稱為蘇打鹽堿土［6］。這種鹽堿土降低了農(nóng)田土壤肥力，制約農(nóng)作物的生長和發(fā)育［7-8］。NaHCO3脅迫引起離子毒害作用，Na+抑制植物細(xì)胞代謝過程，產(chǎn)生過氧化物等次生代謝產(chǎn)物，還會干擾植物細(xì)胞吸收其他離子［9］。NaHCO3脅迫誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧并在體內(nèi)積累，過量的活性氧破壞體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生物大分子氧化損傷［10］。NaHCO3脅迫比NaCl脅迫更嚴(yán)重［11］，NaHCO3脅迫抑制種子的萌發(fā)［12-13］，而且高濃度的NaHCO3脅迫阻止了植物的生長發(fā)育，甚至引起植株死亡［14］。例如，50 mmol/L NaHCO3脅迫甘草無菌苗，甘草幼苗生長量、葉綠體色素含量、抗氧化保護酶（SOD、POD、CAT）活性顯著下降，丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量增加［15］。劉小娥等［16］用150～200 mmol/L NaHCO3處理三色堇實生苗14 d，發(fā)現(xiàn)其葉片中可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性顯著增加。在NaHCO3處理下，三色堇通過增加滲透物質(zhì)含量、提高抗氧化酶活性來減輕脅迫的過氧化傷害，能夠在一定程度上提高幼苗的耐鹽堿能力。

莜麥即裸燕麥（Avena nudaL.），一年生農(nóng)作物，是我國北方高寒地區(qū)主要作物之一，主要分布在我國內(nèi)蒙古、山西、河北、甘肅等地區(qū)［17］。莜麥既可以作為糧食作物，秸稈也可以作為牛、馬、羊等青貯飼料，是一種糧食飼料兼用作物［18-19］。同時莜麥具有豐富的營養(yǎng)價值、藥用與保健功能等［20-22］。莜麥具有抗旱、抗寒、耐鹽、耐瘠薄等特性［23］，但是有關(guān)莜麥幼苗對NaHCO3處理下的生理響應(yīng)模式未見報道。因此，本研究選用糧食作物兼優(yōu)良的飼草莜麥作為研究材料，通過設(shè)置不同質(zhì)量濃度NaHCO3處理莜麥幼苗，探討NaHCO3脅迫下莜麥幼苗的生理響應(yīng)，研究結(jié)果為不同程度鹽堿地種植莜麥提供線索和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究試驗材料莜麥種子由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物資源種子庫提供。選健康無病害的種子，用水沖洗數(shù)次，蒸餾水沖洗數(shù)次，再用75%乙醇消毒5 min，種子用于后續(xù)的發(fā)芽率試驗和脅迫處理。

1.2 種子發(fā)芽率的統(tǒng)計

將種子放入鋪有2層濾紙的直徑20 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿放100粒，置于陽光充足的實驗室內(nèi)，溫度為25℃，相對濕度為45%，光照周期為10 h/d。用不同質(zhì)量濃度的NaHCO3溶液（0（CK）、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 g/mL）定時定量處理種子，連續(xù)5 d，3個重復(fù)，記錄種子發(fā)芽率。

1.3 幼苗的培養(yǎng)和NaHCO3溶液脅迫

將種子放入鋪有2層濾紙的直徑20 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿均勻放種子，置于陽光充足的實驗室內(nèi)，每天定時澆10 mL水，待幼苗長出2～3片子葉，約7 d，分組編號。無需移植，后改用NaHCO3溶液處理莜麥幼苗，和處理種子一樣，用不同質(zhì)量濃度NaHCO3溶 液（0（CK）、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 g/mL）每天定時定量處理幼苗，持續(xù)處理7 d后，取樣測定NaHCO3溶液脅迫下幼苗的生理生化指標(biāo)。

1.4 生理生化指標(biāo)的測定方法

幼苗株高選用直尺測定每株幼苗從葉基到葉尖最長距離的垂直高度，重復(fù)10次，取平均數(shù)。幼苗根長采用直尺測定每株幼苗主根長度，重復(fù)10次，取平均數(shù)。

葉綠素總含量測定參照乙醇丙酮浸泡提取法［24］，脯氨酸的測定采用磺基水楊酸法［25］，SOD活性采用氮藍四唑法［25］，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法［25］，APX活性的測定參照《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》［25］，MDA含量的測定參照硫代巴比妥酸比色法［25］，可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法［25］，所有的生理指標(biāo)重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHCO3脅迫下莜麥種子的發(fā)芽率

不同質(zhì)量濃度NaHCO3脅迫下莜麥種子的發(fā)芽率見圖1。隨著NaHCO3質(zhì)量濃度的增加，種子的發(fā)芽率逐漸下降，發(fā)芽率由72%降低到3%。與對照相比，0.2～6.4 mg/L NaHCO3處理下種子的發(fā)芽率顯著下降（P<0.05），在高質(zhì)量濃度3.2、6.4 mg/L NaHCO3處理下種子的發(fā)芽率分別為10%、3%。

圖1 NaHCO3脅迫下種子的發(fā)芽率Figure 1 Germination rate of seeds under NaHCO3 stress

2.2 NaHCO3脅迫對莜麥幼苗株高和根長的影響

不同質(zhì)量濃度NaHCO3對莜麥幼苗長度的影響見圖2。隨著NaHCO3質(zhì)量濃度的增加幼苗葉和根的長度逐漸減小，與對照相比所有處理都顯著降低（P<0.05）。其中6.4 mg/L NaHCO3處理幼苗葉長度是對照的42%（P<0.05），幼苗根長度是對照的45%（P<0.05）。

圖2 NaHCO3對幼苗長度的影響Figure 2 Effects of NaHCO3 stress on seedling length

2.3 NaHCO3脅迫對莜麥幼苗葉綠素的影響

NaHCO3對莜麥幼苗葉綠素含量的影響見圖3，結(jié)果顯示隨著NaHCO3處理質(zhì)量濃度的增加幼苗葉中葉綠素a、b、a+b含量呈先增加后降低的趨勢，0.8～6.4 mg/L NaHCO3處理下幼苗葉綠素含量顯著降低，與對照相比降低了17%～37%（P<0.05）。葉綠素a/b呈先降低后升高趨勢。低質(zhì)量濃度0.2～0.4 mg/L NaHCO3促進幼苗葉綠素b、a+b含量增加；0.8～6.4 mg/L高質(zhì)量濃度NaHCO3處理抑制葉綠素a、a+b的含量，影響了光合作用。

圖3 NaHCO3脅迫對幼苗葉綠素含量的影響Figure 3 Effects of NaHCO3 stress on chlorophyll content

2.4 NaHCO3脅迫對莜麥幼苗MDA、可溶性糖、氧負(fù)離子的影響

不同質(zhì)量濃度NaHCO3對幼苗MDA含量、可溶性糖含量、氧負(fù)離子產(chǎn)生速率的影響見圖4。隨著NaHCO3處理質(zhì)量濃度的增加幼苗MDA和可溶性糖含量呈逐漸增加的趨勢，且幼苗葉中的量高于根中的量。葉中平均MDA含量是根中的2.31倍，葉中平均可溶性糖含量是根中的2.52倍，葉中平均O2.-產(chǎn)生速率是根中的2.16倍。表明葉比根對MDA、可溶性糖、氧負(fù)離子積累量多。

圖4 NaHCO3脅迫對幼苗MDA、可溶性糖、O2.-產(chǎn)生速率的影響Figure 4 Effects of seedling MDA，soluble sugar，O2-generation rate under NaHCO3 stress

0.2 ～6.4 mg/L NaHCO3處理下葉中MDA、可溶性糖含量顯著增加，分別比對照增加了1.02～8.35、0.83～3.05倍（P<0.05）；0.4～6.4 mg/L NaHCO3處理下根中MDA含量顯著增加，比對照增加 了1.05～7.34倍（P<0.05）。1.6～6.4 mg/L NaHCO3處理下根中可溶性糖含量顯著增加。比對照增加了9.42～17.72倍（P<0.05），表明在高質(zhì)量濃度1.6～6.4 mg/L NaHCO3處理下根中可溶性糖積累速度快，是葉中的4.7～5.7倍。

3.2～6.4 mg/L NaHCO3處理下葉中O2.-產(chǎn)生速率顯著增加，是對照的9.17～11.12倍（P<0.05）；6.4 mg/L NaHCO3處理下根中O2.-產(chǎn)生速率顯著增加，是對照的55.68倍（P<0.05）。表明在6.4 mg/L高質(zhì)量濃度NaHCO3處理下幼苗的葉與根中的O2.-產(chǎn)生速率顯著增加（P<0.05）。

2.5 NaHCO3脅迫對莜麥幼苗脯氨酸含量的影響

本研究中脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線和脯氨酸含量變化見圖5。隨著NaHCO3處理質(zhì)量濃度的增加，幼苗脯氨酸含量呈先逐漸升高后逐漸降低的趨勢。同樣處理下葉中脯氨酸含量高于根中的含量，葉中平均脯氨酸含量是根中的4.54倍，表明葉片對脯氨酸較為敏感。

圖5 NaHCO3脅迫對幼苗脯氨酸含量的影響Figure 5 Effects of seedling proline content under NaHCO3 stress

0.2～1.6 mg/L NaHCO3處理下幼苗葉中脯氨酸含量顯著增加，比對照增加0.34～1.43倍（P<0.05），且在0.8 mg/L NaHCO3處理下葉中脯氨酸含量最高；0.4～0.8 mg/L NaHCO3處理下幼苗根中脯氨酸含量顯著增加，比對照增加2.44～4.35倍（P<0.05），且在0.4 mg/L NaHCO3處理下根中脯氨酸含量最高。在高質(zhì)量濃度6.4 mg/L NaHCO3處理下葉和根中脯氨酸含量最低。

2.6 NaHCO3脅迫對莜麥幼苗抗氧化酶活性的影響

不同質(zhì)量濃度NaHCO3對幼苗抗氧化酶活性的影響見圖6，結(jié)果顯示隨著NaHCO3處理質(zhì)量濃度的增加抗氧化酶活性變化呈先逐漸升高后逐漸降低的趨勢。同樣處理下葉中抗氧化酶活性高于根中的活性，表明葉片對抗氧化酶較為敏感。

圖6 NaHCO3脅迫對幼苗抗氧化酶活性的影響Figure 6 Effects of seedling antioxidant enzymes under NaHCO3 stress

0.4 ～3.2 mg/L NaHCO3處理下葉中SOD活性顯著增加，是對照的1.30～1.53倍（P<0.05），且在0.8 mg/L NaHCO3處理下葉中SOD活性最高；不同質(zhì)量濃度NaHCO3處理下根中SOD活性與對照沒有顯著差異。

0.4～3.2 mg/L NaHCO3處理下葉中APX活性顯著增加，是對照的7.6～20倍（P<0.05），且在3.2 mg/L NaHCO3處理下葉中APX活性最高；0.4～1.6 mg/L NaHCO3處理下根中APX顯著增加，是對照 的8.39～12.44倍（P<0.05），且 在1.6 mg/L NaHCO3處理下根中APX活性最高。

0.2～3.2 mg/L NaHCO3處理下葉中POD活性顯著增加，是對照的1.78～3.05倍（P<0.05），且在0.4 mg/L NaHCO3處理下葉中POD活性最高；不同質(zhì)量濃度NaHCO3處理下根中POD活性與對照沒有顯著差異。

0.8～1.6 mg/L NaHCO3處理下葉中CAT活性顯著增加，是對照的1.36～1.61倍（P<0.05），且在1.6 mg/L NaHCO3處理下葉中CAT活性最高；0.4 mg/L NaHCO3處理下根中CAT顯著增加，是對照的2.70倍（P<0.05），且根中CAT活性最高。

綜上分析在0.4、0.8、1.6、3.2 mg/L NaHCO3處理下，對應(yīng)葉中POD、SOD、CAT、APX活性分別達到最大，這些抗氧化酶相互協(xié)調(diào)抵抗不良環(huán)境。

2.7 不同生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析

不同生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析見表1，呈極顯著相關(guān)關(guān)系的分別是葉片長度/根長（r=0.906）、葉片長度/可溶性糖含量（r=-0.983）、MDA含量/O2.-產(chǎn)生速率（r=0.997）、可溶性糖含量/O2.-產(chǎn)生速率（r=0.878）（P<0.01）；呈顯著相關(guān)關(guān)系的分別是葉片長度/MDA含量（r=-0.872）、根長/可溶性糖含量（r=-0.850）、MDA含量/可溶性糖含量（r=0.872）、葉片長度/O2.-產(chǎn)生速率（r=-0.865）、脯氨酸含量/SOD活性（r=0.821）（P<0.05）。表明在NaHCO3脅迫下，莜麥幼苗的葉片長度主要由體內(nèi)MDA、可溶性糖含量、O2.-產(chǎn)生速率的異常變化所引起的。

表1 生理指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系分析Table 1 Correlation analysis between physiological indexes

3 討論

鹽脅迫會增加細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，并導(dǎo)致鈉的積累，增加毒性水平。因此，為了響應(yīng)鹽脅迫信號，植物通過各種機制進行適應(yīng)，包括調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)，激活滲透脅迫途徑，介導(dǎo)植物激素信號，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動力學(xué)和細(xì)胞壁組成［26］。植物對NaHCO3脅迫的生理響應(yīng)涉及光合作用、滲透物質(zhì)積累、離子轉(zhuǎn)運、次生物質(zhì)代謝等途徑［27］。葉綠素是光合作用的色素因子，研究發(fā)現(xiàn)NaHCO3脅迫影響了光合作用，降低了葉片中葉綠素含量［28］。本研究中NaHCO3脅迫的加劇，葉片中的葉綠素含量降低，加速葉片衰老，這與以上研究結(jié)果一致。25 mmol/L NaHCO3處理紅水稻幼苗5 d，與對照相比，其根長、胚芽鞘長度分別降低了25.3%、27%，O2.-的產(chǎn)生速率顯著升高（P<0.05）、MDA含量顯著升高了22.1%、CAT活性上升了82.4%、APX活性上升了89%［29］。100 mmol/L NaHCO3處理桑椹幼苗，幼苗光合作用和呼吸作用被顯著抑制，O2.-的產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著升高，CAT活性顯著下降，POD活性升高，POD和AsAGSH循環(huán)功能增強，但SOD對O2.-的清除無效，CAT和Trx-Prx途徑對H2O2的清除受到抑制；反過來，桑樹幼苗葉片的氧化損傷也不能減輕［30］。

植物處于逆境中，膜系統(tǒng)受到氧化損傷，丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物，是逆境中的重要指標(biāo)之一。當(dāng)莜麥?zhǔn)艿教妓釟溻c脅迫時，細(xì)胞膜脂發(fā)生過氧化作用，細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶被損傷，積累丙二醛，導(dǎo)致丙二醛含量增加［31-33］。本研究中隨著碳酸氫鈉處理質(zhì)量濃度的增加，丙二醛含量呈增加的趨勢，反應(yīng)出膜氧化程度加劇，與以上研究結(jié)果相同.植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有可溶性糖、脯氨酸等，可溶性糖使細(xì)胞原生質(zhì)濃度升高，抵抗細(xì)胞脫水，為植物的生長發(fā)育提供物質(zhì)、能量等［34］。脯氨酸含量的高低能夠反應(yīng)出植物的受損害程度，逆境脅迫下，脯氨酸會大量積累，用來清除體內(nèi)的活性氧自由基，進而保護細(xì)胞膜、代謝酶等，減少細(xì)胞的傷害程度［35］。本研究中莜麥幼苗受到NaHCO3脅迫時，莜麥幼苗中的可溶性糖含量和脯氨酸含量增加，來緩解滲透脅迫，這與郭文婷等［12］和Song等［36］的研究結(jié)果一致。通過增加植物體內(nèi)游離氨基酸如脯氨酸的含量，提高蛋白酶和ATP酶的活性來保證能量供應(yīng)，緩解滲透脅迫［37］。

植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧的代謝平衡，降低膜脂氧化損傷［38］?？寡趸到y(tǒng)包括酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)兩種，酶系統(tǒng)包括SOD、POD、APX、CAT等，其中SOD將O2.-發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，H2O2進一步被POD、CAT、APX協(xié)同作用轉(zhuǎn)化成H2O，它們是清除活性氧過程中所必需的［38］。非酶系統(tǒng)含多種抗氧化劑，如ASA、GSH等，植物通過ASA-GSH循環(huán)參與清除多余的H2O2，來維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)［39］。本研究中碳酸氫鈉脅迫莜麥幼苗，隨著脅迫質(zhì)量濃度的增加，SOD、POD、APX、CAT活性表現(xiàn)出先逐漸增加后逐漸下降，抗氧化酶的活性升高可以維持莜麥較低水平的活性氧，降低對膜脂的氧化傷害程度，抵抗不良環(huán)境。之后抗氧化酶活性降低的原因可能是高質(zhì)量濃度處理破壞了酶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶功能部分或全部喪失，酶活性降低。

4 結(jié)論

不同質(zhì)量濃度NaHCO3處理莜麥幼苗，處理1周后，幼苗的葉綠素含量逐漸下降，滲透物質(zhì)可溶性糖和脯氨酸含量逐漸增加，丙二醛含量增加，膜脂氧化程度加劇，抗氧化酶活性先增加后下降，抗氧化酶活性提高，可以有效清除O2.-和H2O2等活性氧，減輕植物的傷害程度。莜麥對6個不同質(zhì)量濃度NaHCO3的脅迫，葉片比根的響應(yīng)敏感。莜麥幼苗能正常生長的NaHCO3質(zhì)量濃度為0.4 mg/L。