廖星男，李嘉咪，鄧凱，龍清云，黃世文，徐海波

（1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，湖北 武漢 430071；2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)高分子材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072）

聲動(dòng)力治療（SDT）作為一種新型的癌癥治療方法，具有非電離輻射、深的組織穿透能力、時(shí)空可控性等特點(diǎn)［1］，已成為癌癥治療的研究熱點(diǎn)。典型的聲動(dòng)力治療系統(tǒng)主要由無毒的超聲（US）和聲敏劑組成。當(dāng)聲敏劑在低強(qiáng)度的超聲激發(fā)時(shí)，可以產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)（ROS），如單線態(tài)氧（1O2）、羥基自由基（·OH），誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或壞死［2-5］。盡管聲動(dòng)力治療在臨床前研究發(fā)現(xiàn)可以顯著抑制各種癌細(xì)胞的增殖，但是體內(nèi)抗腫瘤效果依然無法滿足臨床需求。

研究發(fā)現(xiàn)，提高聲敏劑在腫瘤部位的富集率是增強(qiáng)聲動(dòng)力治療的有效方法。血卟啉作為第1個(gè)被報(bào)道具有聲動(dòng)力毒性作用的小分子［6］，超聲作用下可以在體內(nèi)將腫瘤的生長率抑制到21%。通過對(duì)血卟啉介導(dǎo)聲動(dòng)力治療癌癥機(jī)制的廣泛和深入研究發(fā)現(xiàn)，大量的熒光分子，如卟啉衍生物［7］、葉綠素及其衍生［7-10］、姜黃素及其衍生［11-12］等具有強(qiáng)聲敏作用。然而，已報(bào)道的有機(jī)小分子聲敏劑具有疏水性強(qiáng)、化學(xué)/生物穩(wěn)定性差等特點(diǎn)，難以在體內(nèi)保持長時(shí)間的循環(huán)，無法在腫瘤有效富集，嚴(yán)重削弱體內(nèi)聲動(dòng)力治療效果［13］。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，許多新型納米平臺(tái)被開發(fā)用于增強(qiáng)體內(nèi)癌癥聲動(dòng)力治療效果［14-15］。

納米技術(shù)的發(fā)展不僅提升了聲動(dòng)力的體內(nèi)抗腫瘤效果，也為聲動(dòng)力聯(lián)合化學(xué)療法提供了方法。聲動(dòng)力治療過程中，癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS輻射范圍?。?20 nm）、持續(xù)時(shí)間短，難以對(duì)癌細(xì)胞造成致命性損傷，容易導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［16］。而聲動(dòng)力聯(lián)合化學(xué)療法有望提升癌癥治療效果。目前臨床化學(xué)療法應(yīng)用的抗腫瘤藥物，如鉑類、阿霉素類、紫杉醇類等，存在許多副作用，如心臟毒性、腎毒性、骨髓抑制等［17］。納米技術(shù)的發(fā)展顯著改善了化療藥物的毒副作用［18］。其中，外部刺激響應(yīng)性釋放化療藥物的納米平臺(tái)已廣泛用于在臨床前癌癥治療研究。通過外源性的光［19］、US［20］、X線［21］等方式，在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)特異性、時(shí)空可控地釋放化療藥物，對(duì)于聯(lián)合聲動(dòng)力治療癌癥具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，DOX不僅是化療藥物，也可以作為聲敏劑［22-24］。因此，本研究提出利用1O2特異性響應(yīng)的酮縮硫醇（TK）鍵［25］將疏水性DOX和分子量為2 000的親水性聚乙二醇（mPEG2000）鏈接，形成具有氧化響應(yīng)性的DOX前藥膠束PTDOX-M，在體外和體內(nèi)研究PTDOX-M介導(dǎo)聲動(dòng)力-化學(xué)療法的抗腫瘤效果，為癌癥治療提供安全有效的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二甲基氨基吡啶（DMAP，99%），巰基丙酸（MAA，99%），無水丙酮（99%），二氮二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，99%）購于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。重均分子量2 000的聚乙二醇單甲醚（mPEG2000），鹽酸阿霉素（DOX?HCl）購于美國生命科學(xué)與高科技集團(tuán)公司（Sigma-Aldrich）。將mPEG2000與甲苯共沸出水后用無水乙醚沉降以備后用。分析級(jí)試劑如濃鹽酸、乙醇、環(huán)己烷購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。生物試劑如青霉素鏈霉素（Hycolon?）、胎牛血清（Gibco?）、高糖培養(yǎng)基（Hyco‐lon?）以及活性氧檢測試劑盒（碧云天）均通過國內(nèi)采購商購買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PTDOX-M納米膠束的制備1）將3-巰基丙 酸（5.2 g，49.1 mmol）加入 無 水 丙酮（5.8 g，98.2 mmol）中，在干燥氯化氫氣體中反應(yīng)，室溫下攪拌4 h。反應(yīng)后，將產(chǎn)物結(jié)晶放入-20℃冷凍。冷凍后的粗產(chǎn)品用正己烷和超純水按順序洗滌，經(jīng)凍干得到含TK鍵的二羧酸白色粉末（COOH-TKCOOH）。2）在 氮 氣 下，將COOH-TK-COOH（252.1 mg，1 mmol）及二環(huán)己基碳二亞胺（61.8 mg，0.3 mmol），4-二甲氨基吡啶（61.1 mg，0.5 mol）分散于的10 mL無水二氯甲烷（DCM）中，得到反應(yīng)體系A(chǔ)。將無水mPEG2000（1g，0.5 mmol）分散于10 mL無水DCM中，得到反應(yīng)體系B。將反應(yīng)體積B逐滴加入反應(yīng)體系A(chǔ)中，在冰浴中攪拌3 h后，在室溫下反應(yīng)24 h。反應(yīng)后過濾除去沉淀，用乙醚沉降后抽濾，得到白色固體（mPEG2000-TK-COOH）。3）將鹽酸阿霉素（60 mg，0.1 mmol）分散于5 mL無水二甲基甲酰胺（DMF）中，加入15 μL無水三乙胺，避光攪拌12 h，得到反應(yīng)體系C。將二環(huán)己基碳二亞胺（20.6 mg，0.1 mmol），4-二甲氨基吡啶（3.7 mg，0.03 mmol）和PEG2000-TK-COOH（130.7 mg，0.06 mmol）分散于10 mL無水DMF中，在氮?dú)庀聰嚢?～6 h，反應(yīng)后過濾除去白色沉淀，得到反應(yīng)體系D。將反應(yīng)體系C加入反應(yīng)體系D中，攪拌24 h后，用乙醚沉降，抽濾得到紅色固體（mPEG2000-TKDOX）。4）分別稱取20 mg mPEG2000-TK-DOX分散于5 mL的無水DMF中，將溶液放入截留分子量為3 500 DU的透析袋中，在去離子水中透析48 h，每隔4 h換一次水，得到納米膠束PTDOX-M。非氧化響應(yīng)的膠束PCDOX-M的制備過程中，只需將COOH-TK-COOH轉(zhuǎn)變?yōu)槎《狒?，其他步驟通PTDOX-M的制備過程一致。

1.2.2 納米膠束在超聲條件下ROS產(chǎn)生效果使用DCFH-DA熒光探針檢測超聲輻射后ROS的產(chǎn)生。配置PCDOX-M、PTDOX-M及DOX（DOX的濃度為1 μg/mL）的水溶液2 880 μL。在各溶液中加入120 μL的預(yù)處理后DCFH，置于超聲輻射不同時(shí)間（1 Hz，2 W/cm2，100%占空比），放置2 h后，使用熒光分度計(jì)測量超聲不同時(shí)間特定波長的熒光強(qiáng)度（λex=488nm，λem=525nm）。

1.2.3 納米膠束超聲條件下DOX的釋放將2 mL的PTDOX-M溶液加入截留分子量為3 500 U透析袋中，將透析袋兩端扎緊。對(duì)透析袋中的PTDOX-M在超聲（1 MHz，2 W/cm2，100%占空比）下輻射不同時(shí)間。將透析袋放入裝有10 mL PBS（pH=7.4）中的離心管中，在37℃恒溫水浴中緩慢振蕩。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)，取出3 mL PBS溶液，并加入3 mL新鮮PBS溶液。用熒光光譜儀檢測取出的3 mL PBS溶液中DOX含量（λex=488nm，λem=590nm）。

1.2.4 納米膠束體外毒性研究將4T1細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板內(nèi)，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。將不同濃度的DOX，PTDOX-M及PCDOX-M與4T1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，用PBS洗去未吸收的材料，加入新的培養(yǎng)基后，在超聲或不超聲（3 min，1 MHz，2 W/cm2，50%占空比）處理后，細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入噻唑蘭MTT后共培養(yǎng)4 h，吸盡MTT后，再加入150 μL的二甲亞砜DMSO，充分振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測量各孔在570 nm處的吸光值。

1.2.5 小鼠體內(nèi)抗腫瘤效果研究小鼠乳腺癌腫瘤模型構(gòu)建后，待腫瘤體積約80～100 mm3時(shí)。將小鼠隨機(jī)分為7組進(jìn)行治療：1）PBS組；2）Free DOX組；3）PCDOX-M組；4）PTDOX-M組；5）Free DOX+US組；6）PCDOX-M+US組；7）PTDOXM+US組。尾靜脈注射藥物（DOX：6.5 mg/kg），注射后4 h進(jìn)行超聲處理（1 Hz，2 W/cm2，50%占空比）5 min。每隔3 d進(jìn)行給藥及超聲處理，共3次。治療期間每隔2 d用游標(biāo)卡尺對(duì)腫瘤體積進(jìn)行測量［26］。治療結(jié)束后對(duì)各組的小鼠的腫瘤相對(duì)體積及相對(duì)體重進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel表格記錄數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01作為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化響應(yīng)納米藥物的制備與表征

mPEG2000-TK-DOX的合成過程及1H NMR表征如圖1和圖2所示。此外，本課題組合成不具備ROS響應(yīng)的載藥納米膠束PCDOX-M，該納米膠束利用C-C鍵將親水mPEG2000片段與DOX偶聯(lián)。利用透射電子顯微鏡對(duì)納米膠束的粒徑和形貌進(jìn)行表征，如圖3-A～B所示，PTDOX-M及PCDOX-M膠束呈圓球形，分散均勻，粒徑約30.92、32.12 nm。證明所述2種納米膠束的成功合成，并且兩種膠束的粒徑和形態(tài)沒有顯著差異。

圖1 mPEG2000-TK-DOX的制備Figure 1 The synthesis of mPEG2000-TK-DOX

圖2 HOOC-TK-COOH（A），PEG2000-TK-COOH（B），PEG2000-TK-DOX（C），PEG2000-C-DOX（D）的核磁氫譜Figure 2 1H NMR spectra of HOOC-TK-COOH（A），PEG2000-TK-COOH（B），PEG2000-TK-DOX（C），PEG2000-C-DOX（D）

圖3 成PTDOX-M（A）and PCDOX-M（B）的透射電鏡圖Figure 3 The TEM of PTDOX-M（A）and PCDOX-M（B）.（Scale Bar=100 nm）

2.2 超聲觸發(fā)ROS的產(chǎn)生及DOX釋放

如圖4-A所示，PBS在超聲后，525 nm處的熒光強(qiáng)度不產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的變化，但DOX、PTDOXM及PCDOX-M在525 nm處的熒光強(qiáng)度隨著超聲時(shí)間的延長而增加。結(jié)果表明，在超聲輻射下，DOX作為聲敏劑可以產(chǎn)生ROS。如圖4-C所示，PTDOX-M在未超聲時(shí)，幾乎沒有DOX的釋放。然而隨著超聲時(shí)間的增加，DOX的釋放增加，超聲5 min后，48 h的累積釋藥率達(dá)到了43%。然而超聲輻射前后PCDOX-M并未檢測到DOX的差異性釋放。這是由于超聲產(chǎn)生的ROS使TK鍵斷裂，DOX從膠束中釋放。

圖4 超聲觸發(fā)產(chǎn)生ROS（A）；超聲觸發(fā)DOX從PCDOX-M（B）and PTDOX-M（C）中釋放Figure 4 US-triggered ROS generation（A）；US-triggered DOX release from PCDOX-M（B）and PTDOX-M（C）

2.3 PTDOX的體外和體內(nèi)抗腫瘤研究

如圖5所示，PTDOX-M和PCDOX-M在無超聲時(shí)對(duì)4T1細(xì)胞幾乎沒有毒性。單純超聲（3 min，1 MHz，2 W/cm2，50%占空比）也不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷［27］。在超聲處理下，PTDOX-M對(duì)細(xì)胞的存活抑制率較PCDOX-M和游離態(tài)DOX高。結(jié)果表明，超聲并不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，然而PTDOX-M在超聲前，對(duì)4T1細(xì)胞毒性作用低，具有一定的安全性，超聲后，細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)，這是由于超聲產(chǎn)生的ROS與TK斷裂后釋放的DOX對(duì)細(xì)胞的雙重?fù)p傷作用所致。

圖5 超聲或不超聲處理時(shí)的DOX、PTDOX-M和PCDOX-M對(duì)4T1細(xì)胞毒性Figure 5 In vitro cytotoxicity of DOX，PTDOX-M and PCDOX-M against 4T1 cells with or without US irradiation

治療期間每隔2 d用游標(biāo)卡尺對(duì)腫瘤體積進(jìn)行測量。治療結(jié)束后對(duì)各組的小鼠的腫瘤相對(duì)體積及相對(duì)體重進(jìn)行測量。如圖6所示，相對(duì)于其他的對(duì)照組，PTDOX-M+US組的腫瘤抑制作用最強(qiáng)，腫瘤抑制率達(dá)到86.2%。各組荷瘤小鼠相對(duì)體質(zhì)量沒有差異。結(jié)果說明，PTDOX-M介導(dǎo)的聲動(dòng)力-化學(xué)療法可以顯著抑制4T1腫瘤的生長。

圖6 各組老鼠的體重變化情況；聲動(dòng)力-化療聯(lián)合治療對(duì)4T1移植瘤的生長移植情況。Figure 6 The tumor weight after varies treatment；Sonodynamic-chemotherapy combined inhibition of 4T1 tumors growth after i.v.injection of free DOX or PTDOX-M or PCDOX-M

3 討論

為了克服癌癥傳統(tǒng)治療方法的局限性，一些新型非入侵的治療方法，如光動(dòng)力（PDT）［28］、聲動(dòng)力（SDT）［2］、光熱（PTT）［15］等正在進(jìn)行廣泛的臨床前研究。目前研究發(fā)現(xiàn)，聲動(dòng)力治療被認(rèn)為可以有效地誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡和抑制實(shí)體腫瘤生長。聲動(dòng)力治療（SDT）作為一種新興、非侵入性的治療方法，具有深的組織穿透能力、非電離性、高時(shí)空可控性和低成本［16］。典型的聲動(dòng)力過程中，超聲激發(fā)腫瘤部位表層或深層的聲敏劑產(chǎn)生活性氧成分（ROS）誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或壞死，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡［29］。根據(jù)已有研究表明，超聲和聲敏劑是聲動(dòng)力過程中必不可少的組成部分。其中，聲敏劑的物理、化學(xué)/生物穩(wěn)定性，如親疏水性、穩(wěn)定性、光學(xué)性質(zhì)，是影響聲動(dòng)力治療效果的重要因素。相對(duì)于已報(bào)到的小分子聲敏劑，本項(xiàng)目制備的DOX前藥膠束能有效提升DOX的親水性和腫瘤富集能力，有助于增強(qiáng)DOX介導(dǎo)的癌癥聲動(dòng)力治療效果。

研究發(fā)現(xiàn)，聲動(dòng)力治療雖然在各種癌細(xì)胞中都顯示出了良好的結(jié)果，但在體內(nèi)抗腫瘤的效果還無法滿足臨床需求。聲動(dòng)力過程中產(chǎn)生的活性氧成分半衰期短（10～320 ns），輻射半徑?。?20 nm），導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)的活性氧成分累積量少，難以對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生顯著的損傷。而聲動(dòng)力聯(lián)合化學(xué)療法治療有望解決此問題［30］。化學(xué)療法過程中，化療藥物，如DOX在細(xì)胞內(nèi)可以長時(shí)間持續(xù)產(chǎn)生ROS，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA、蛋白、脂質(zhì)損傷，有望聯(lián)合聲動(dòng)力治療提升體內(nèi)抗腫瘤效果［31-32］。然而，化療藥物在腫瘤部位的低富集率和全身毒副作用是限制腫瘤化療和化療聯(lián)合治療的重要因素。盡管臨床采用脂質(zhì)體負(fù)載的DOX提升了藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，但是治療效果和毒副作用依然無法令人滿意。本項(xiàng)目提出應(yīng)用外源性超聲觸發(fā)化療藥物在腫瘤部位精準(zhǔn)釋放，能有效降低DOX的毒副作用。

針對(duì)上述情況，本項(xiàng)目利用氧化響應(yīng)鍵TK將疏水性DOX和親水性mPEG2000通過酯化反應(yīng)鏈接，形成兩親性聚合物mPEG2000-TK-DOX。在此基礎(chǔ)上制備了一種氧化響應(yīng)的DOX前藥膠束（PTDOXM），用于聯(lián)合聲動(dòng)力-化學(xué)療法治療癌癥。該前藥膠束中，DOX不僅是化療藥物，也是聲敏劑。在無超聲激發(fā)時(shí)，PTDOX無ROS產(chǎn)生，也無DOX釋放。在超聲輻射下，DOX前藥膠束會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，觸發(fā)膠束中的TK裂解，誘導(dǎo)DOX從膠束中釋放，而非氧化響應(yīng)的PCDOX-M中無DOX釋放。體內(nèi)抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，在超聲觸發(fā)下，與非氧化響應(yīng)的PCDOX-M相比，PTDOX-M可以顯著抑制體內(nèi)腫瘤生長。同時(shí)，上述2種DOX前藥膠束對(duì)小鼠的體重?zé)o影響。

4 結(jié)論

在超聲作用下，PTDOX-M產(chǎn)生的ROS不僅可以殺傷癌細(xì)胞，也可以在局部觸發(fā)化療藥物DOX釋放，以此介導(dǎo)的聲動(dòng)力-化學(xué)療法聯(lián)合作用可以顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長，有望避免對(duì)正常組織造成損傷，為癌癥治療提供安全高效的參考方法。