張俊艷，劉雪婷，何穎，李林梅

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 廣東省過(guò)敏反應(yīng)與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510260)

變應(yīng)性鼻炎是最常見的過(guò)敏性疾病。在歐美國(guó)家其人群發(fā)病率甚至已經(jīng)達(dá)到了40%，在中國(guó)其發(fā)病率也接近20%[1]。變應(yīng)性鼻炎不僅嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，而且還會(huì)引起一系列并發(fā)癥，甚至?xí)w延發(fā)展為哮喘。變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型作為一種有力的研究工具，在探討變應(yīng)性鼻炎發(fā)生發(fā)展的機(jī)制中，以及在對(duì)潛在的干預(yù)手段及治療藥物的療效進(jìn)行評(píng)價(jià)中都具有重要的應(yīng)用價(jià)值[2-3]。小鼠因?yàn)榕c人的同源性較高，而且容易構(gòu)建基因敲除品系，在疾病模型研究中更具優(yōu)勢(shì)。然而因?yàn)樾∈髠€(gè)體較小，模型制備后期的取材操作均具有較高的難度，比如：收集小鼠鼻腔灌洗液以及獲取小鼠鼻黏膜。通常小鼠鼻腔灌洗是經(jīng)氣管插管逆向灌注，然后收集從鼻孔流出的灌洗液。然而該方法不易掌握，對(duì)于初學(xué)者而言，很容易出現(xiàn)灌洗液從小鼠口腔中漏出，而導(dǎo)致灌洗失敗或灌洗液回收得率低的情況。另外在小鼠鼻黏膜的獲取方法上，也鮮有文章能從方法學(xué)的角度提供具體而直觀的參考。因此本研究對(duì)小鼠鼻腔灌洗的方法進(jìn)行了改良，以提高灌洗的效率。同時(shí)，對(duì)小鼠鼻黏膜完整獲取，以及分部位獲取的兩種方式進(jìn)行了具體而直觀的描述，以滿足研究者不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求，并提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

0.2% 甲紫溶液，PBS緩沖溶液，眼科剪刀，鑷子，1 mL注射器，平口針頭/管，手術(shù)刀片，萊卡體視顯微鏡(拍照用)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

約8周齡C57/BL6雌性小鼠9只，購(gòu)于廣東藥康生物科技有限公司(SCXK(粵)2020-0054)，在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)(SYXK(粵)2018-0192)。本研究實(shí)驗(yàn)方案獲得廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 小鼠后鼻道鼻腔灌洗操作步驟

二氧化碳麻醉處死小鼠，沿頸部剪下小鼠頭部。將剪刀伸進(jìn)口腔沿一側(cè)下頜剪開小鼠臉頰部，并將舌根及喉頸部的組織掀開并移至另一側(cè)(或剪掉)，分離暴露小鼠上顎，可見軟腭內(nèi)有一管道(后鼻道)，并可見開孔，在正常位置時(shí)此孔正對(duì)小鼠氣管入口上方，位置接近舌根部。用紗布吸干頭部殘端的血液。將含灌注液的注射器(平頭的針口)沿后鼻道開孔，插入后鼻道約3～5 mm，推注液體，在小鼠鼻孔處用1.5 mL EP管回收灌洗液(圖1)。

1.4 兩種鼻腔灌洗方法的比較

為了評(píng)估新方法的優(yōu)勢(shì)，我們將其與氣管插管鼻腔灌洗法進(jìn)行了比較。小鼠氣管插管鼻腔灌洗方法操作流程是：二氧化碳麻醉處死小鼠，剪開頸部皮膚和組織，暴露小鼠氣管，在氣管上剪一小孔，向小鼠頭部的方向插入灌洗針頭，將針頭抵近小鼠咽喉部，推注注射器，使灌洗液從鼻孔流出，并予以收集。注意控制好灌洗針頭的位置，避免灌洗液從小鼠口腔流出，導(dǎo)致灌洗失敗。我們安排了一名對(duì)氣管插管法頗有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員用氣管插管法對(duì)9只小鼠進(jìn)行鼻腔灌洗，之后安排另一名之前未做過(guò)鼻腔灌洗，但經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)(訓(xùn)練了2只小鼠)的實(shí)驗(yàn)員用后鼻道鼻灌洗法也對(duì)這9只小鼠進(jìn)行了鼻腔灌洗，灌洗液是300 μL，分別記錄兩種方法灌洗液的回收量以及操作耗時(shí)。 為了避免鼻腔殘留液體的影響，我們?cè)跉夤懿骞芄嘧⒑笸鶜夤芾锕嘧⒘丝諝猓懦隽吮乔粴埩粢后w，前后兩種方法間隔時(shí)間約30 min。

1.5 從鼻骨及上顎兩個(gè)窗口獲取小鼠鼻黏膜的方法

為了更好的顯示小鼠全部鼻黏膜的區(qū)域，我們用0.2%的甲紫溶液經(jīng)后鼻道灌洗鼻部，灌洗時(shí)用鑷子稍?shī)A緊鼻孔，使染色劑分布在整個(gè)鼻腔中。鈍性分離小鼠頭部皮膚組織，暴露小鼠頭骨，用鑷子沿鼻孔向上撬開鼻骨。用鑷子分離披覆在上顎的軟組織，暴露鼻腔的底部。用鑷子將小鼠左右側(cè)上頜牙齒與牙槽骨截?cái)嗤夥描囎忧碎_上顎位于后氣道底部的骨片，暴露整個(gè)后鼻道。在甲紫溶液的示蹤下，可以看到整個(gè)鼻腔被染上藍(lán)色的黏膜。用鑷子從鼻腔頂部及底部?jī)蓚€(gè)窗口分別取下鼻黏膜及軟骨，并將軟骨上的黏膜取干凈。位于后鼻道的黏膜組織也可以根據(jù)研究者的目的予以單獨(dú)獲取。 由這種方法獲取的鼻黏膜可以進(jìn)行后續(xù)鼻黏膜蛋白與組織RNA的提取等實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 從鼻骨及上顎兩個(gè)窗口獲取小鼠鼻腔黏膜 A:從鼻骨上方可見被甲紫染色的鼻腔黏膜; B:沿鼻孔向上撬開鼻骨; C:從撬開的鼻骨窗口向下觀察鼻黏膜； D:從鼻骨窗口向下觀察鼻黏膜獲取干凈的效果； E：從上顎觀察被甲紫染色的鼻腔黏膜； F：撕開上顎軟組織暴露鼻腔黏膜； G：撬開上頜牙槽骨及上顎支撐鼻道的骨質(zhì)部分暴露鼻腔黏膜； H：從上顎底部的窗口觀察鼻黏膜獲取干凈的效果

1.6 分部位獲取小鼠鼻黏膜的方法

鈍性分離小鼠頭部皮膚組織，暴露小鼠頭骨。將小鼠頭骨兩側(cè)顴骨與上頜骨連接的位置用剪刀剪開；用鑷子沿鼻孔向上撬開鼻骨。用鑷子分離披覆在上顎的軟組織，暴露鼻腔的底部。用鑷子將小鼠兩側(cè)上頜牙槽骨截?cái)?；用剪刀將小鼠上門齒及鼻尖部的骨質(zhì)剪掉。在上頜骨的底部，用刀片或剪刀斷開骨鼻中隔與左右兩側(cè)上頜骨的骨質(zhì)連接；用鑷子夾住上頜骨前端，分別往左右兩側(cè)撬開上顎骨，鑷子夾住骨鼻中隔的底部并取下骨鼻中隔，小心不要破壞鼻黏膜?？梢娕苍谧笥覀?cè)上頜骨上的鼻黏膜；以及披覆在骨鼻中隔兩側(cè)的鼻黏膜；后續(xù)可以根據(jù)研究者的興趣與研究目的，分部位獲取鼻黏膜進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)，也可以將所獲取的3個(gè)部位的鼻黏膜進(jìn)行組織固定后進(jìn)行后續(xù)的脫鈣以及組織染色等(圖3)。

圖3 分部位獲取小鼠鼻黏膜組織 A：斷開顴骨與上頜骨的連接； B： 撬開鼻骨； C：斷開骨鼻中隔與左右兩側(cè)上頜骨的骨質(zhì)連接； D： 撬開左右兩側(cè)上頜骨； E：分離并取出鼻中隔； F：披覆在左右兩側(cè)上頜骨以及骨鼻中隔兩側(cè)的鼻黏膜

2 結(jié)果

2.1 兩種鼻腔灌洗方法比較

我們將后鼻道鼻腔灌洗與氣管插管鼻腔灌洗法進(jìn)行了比較。先后對(duì)同一小鼠分別經(jīng)2名不同經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行灌洗操作，并比較兩種方法灌洗液的回收量以及操作耗時(shí)。結(jié)果顯示，對(duì)經(jīng)氣管插管法頗有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員，在灌注300 μL洗液后，鼻腔灌洗液的回收量均值為254 μL，平均回收率為84.7%，而只是經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)員用后鼻道鼻腔灌洗法的灌洗液回收量均值為280 μL，要高于頗有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員用氣管插管鼻腔灌洗法獲取的灌洗液回收量(t=5.319，P<0.01)，平均回收率高達(dá)93%。在操作耗時(shí)上，經(jīng)氣管插管鼻腔灌洗操作平均耗時(shí)為139.5 s，經(jīng)后鼻道鼻腔灌洗操作平均耗時(shí)為83 s，經(jīng)后鼻道鼻腔灌洗在操作耗時(shí)上比用氣管插管鼻腔灌洗法節(jié)省約57 s，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.878，P<0.01)。

2.2 兩種鼻黏膜獲取方法的比較

我們用甲紫溶液對(duì)鼻黏膜進(jìn)行了灌注染色，并采用上述兩種方法對(duì)鼻黏膜進(jìn)行了獲取。從鼻骨及上顎兩個(gè)窗口獲取鼻黏膜的方法能夠最大化的獲取小鼠鼻黏膜組織，取完鼻黏膜后，從上下兩個(gè)窗口觀察整個(gè)鼻腔，未見明顯的鼻黏膜殘留(圖2)。通過(guò)分部位獲取鼻黏膜的方法，我們最后能夠成功獲得披覆在兩側(cè)上頜骨以及骨鼻中隔兩側(cè)的鼻黏膜組織(圖3)。該方法對(duì)披覆在上述部位的鼻黏膜基本不會(huì)造成人為的損壞，方便進(jìn)行后續(xù)的包括病理學(xué)在內(nèi)的諸多分析。我們從后續(xù)樣品的用途上，將兩種獲取小鼠鼻黏膜的方法進(jìn)行了比較，結(jié)果如表1所示，分部位獲取鼻黏膜的方法后續(xù)能夠進(jìn)行組織病理學(xué)的檢測(cè)，兩種方法獲取的鼻黏膜都可以進(jìn)行包括細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)在內(nèi)的進(jìn)一步分析。

表1 兩種小鼠鼻黏膜獲取方法的比較

圖4 經(jīng)氣管插管及經(jīng)后鼻道獲取小鼠鼻腔灌洗液的方法比較 A:灌洗液回收量的比較; B:兩種方法操作耗時(shí)的比較 注：**表示經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，兩種方法的差異P<0.01。

3 討論

變應(yīng)性鼻炎的主要臨床表現(xiàn)是鼻塞、鼻癢，打噴嚏、和流清涕，因此它是以局部為主要表現(xiàn)的變應(yīng)性疾病。在臨床上血清變應(yīng)原特異性IgE的檢出，對(duì)變應(yīng)性鼻炎通常具有重要的診斷價(jià)值。然而有一部分患者是局部變應(yīng)性性鼻炎[4]，除了能在局部檢測(cè)出變應(yīng)原特異性IgE，血清學(xué)中并沒(méi)有變應(yīng)原特異性IgE的明顯升高[5-6]。另外，Watts等[7]在對(duì)變應(yīng)性鼻炎的研究中發(fā)現(xiàn)，患者的血液和鼻腔灌洗液樣本顯示出了截然不同的基因表達(dá)譜及基因信號(hào)通路。因此圍繞鼻腔及鼻黏膜是變應(yīng)性鼻炎研究的重點(diǎn)區(qū)域。

鼻腔灌洗以及鼻黏膜獲取是變應(yīng)性鼻炎模型研究中的重要步驟[8]。噬齒類動(dòng)物，如兔，大鼠，豚鼠，小鼠等都可用于變應(yīng)性鼻炎的研究[9-10]。然而，目前研究AR多以大鼠或豚鼠為多見。如果排除了取材困難的因素，小鼠模型用于研究變應(yīng)性鼻炎則更為合適[11]。主要原因有：①小鼠模型造模操作相對(duì)簡(jiǎn)單；②小鼠價(jià)格相對(duì)便宜，而且方便飼養(yǎng)；③小鼠種屬的商業(yè)試劑和檢測(cè)試劑盒選擇性較多，方便研究；④易于構(gòu)建基因缺陷或培育特定品系小鼠，方便深入研究[12]；⑤遺傳背景清晰，而且小鼠基因的同源性與人的更高。因此，解決小鼠在鼻腔灌洗以及鼻黏膜組織取材方面的瓶頸，將為小鼠變應(yīng)性鼻炎模型的研究提供重要幫助。

本研究我們?cè)趨⒖荚行∈蟊乔还嘞捶椒ǖ幕A(chǔ)上，提出了一種簡(jiǎn)易的鼻腔灌洗方法，即經(jīng)后鼻道的鼻腔灌洗方法。該方法操作簡(jiǎn)單，灌洗的效率高，而且容易掌握。在小鼠變應(yīng)性鼻炎模型研究中，研究者可對(duì)鼻腔灌洗液的成分，包括細(xì)胞因子以及收集的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。研究者可以根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)條件，選擇合適的灌洗液量，比如50～100 μL，甚至更少的灌洗液，或重復(fù)灌洗，以提高回收的灌洗液中相關(guān)指標(biāo)的檢出水平。在這種情況下經(jīng)后鼻道的鼻腔灌洗方法的優(yōu)勢(shì)就會(huì)更明顯，因?yàn)樗墓嘞匆夯厥盏寐矢?，而且容易掌握，基本上不?huì)出現(xiàn)漏出的情況。

在小鼠鼻黏膜獲取方法方面，David在2013年曾提出一種通過(guò)固定，脫鈣去骨的方式獲取完整小鼠鼻組織的方法[13]，該方法步驟相對(duì)繁瑣，因?yàn)槟軌蜉^完整的保持鼻組織的解剖結(jié)構(gòu)，所以比較適用于病理以及組織形態(tài)學(xué)的觀察。然而因?yàn)楸墙M織已經(jīng)被固定，所以該方法并不能實(shí)現(xiàn)對(duì)新鮮的鼻黏膜組織進(jìn)行分析研究。而其他模型或研究類文章對(duì)小鼠鼻黏膜獲取方法的描述都比較含糊，缺少具體而直觀的方法學(xué)參考。因此基于以上情況，我們提供了兩種直觀的解決方案，一種是最大程度地獲取新鮮鼻黏膜的方法，該方法從鼻骨及上顎兩個(gè)窗口暴露鼻黏膜，通過(guò)這兩個(gè)窗口能夠最大化地獲取小鼠鼻黏膜組織，而且根據(jù)研究需要，可以選擇是否獲取后鼻道及鼻咽部的黏膜組織。該方法獲取的鼻黏膜組織可以用于蛋白提取，組織勻漿，以及RNA提取等后續(xù)操作。另外一種是分部位獲取鼻黏膜，通過(guò)該方法可以獲取披覆在左右兩側(cè)上頜骨上的鼻黏膜；以及披覆在骨鼻中隔兩側(cè)的鼻黏膜。研究者可以在保持黏膜相對(duì)完整的情況下，對(duì)取出的黏膜予以固定及后續(xù)的組織染色等。也可以撕下不同部位的鼻黏膜進(jìn)行后續(xù)的目標(biāo)蛋白及mRNA的分析等。研究表明鼻中隔黏膜和鼻腔外側(cè)壁黏膜的組織結(jié)構(gòu)有所不同[14]，不同區(qū)域的鼻黏膜血管通透性及血管分布也會(huì)有一定差異[15]，因此不同部位的鼻黏膜應(yīng)對(duì)環(huán)境物質(zhì)及變應(yīng)原的刺激可能會(huì)有所差別。因此選擇不同部位的鼻黏膜，或者變化最為明顯的鼻黏膜進(jìn)行分析研究，或者在小鼠變應(yīng)性鼻炎模型中通過(guò)比較同一只模型小鼠單側(cè)鼻孔變應(yīng)原刺激與未刺激側(cè)鼻黏膜的變化差異，將會(huì)有助于解析變應(yīng)性鼻炎發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

總之，小鼠變應(yīng)性鼻炎模型在變應(yīng)性鼻炎發(fā)生發(fā)展及治療手段干預(yù)的評(píng)價(jià)研究中具有重要的作用，本研究提出的經(jīng)后鼻道的鼻腔灌洗方法以及兩種小鼠鼻黏膜獲取方法，將會(huì)為小鼠變應(yīng)性鼻炎模型研究提供重要參考。