阮麗君 朱玲 徐曉武 李婉玲 羅頌平

(1.南方醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院婦科，廣州 510900; 2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科，廣州 510405)

1 復發(fā)性外陰陰道念珠菌病的概況

復發(fā)性外陰陰道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC)是指一年內(nèi)有癥狀并經(jīng)真菌學證實的外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)發(fā)作4次或以上者[1]。Blostein[2]等對7個國家RVVC新患病例數(shù)展開調(diào)查，發(fā)現(xiàn)RVVC的發(fā)病率居于14%～28%(平均23%)。RVVC的高發(fā)病率說明RVVC是一種常見病。有些患者無明顯易感因素卻反復發(fā)作，RVVC嚴重影響了患者的生活質(zhì)量、心理健康和性生活[3]，RVVC患者軀體功能、角色生理、軀體疼痛、一般健康、活力、社會功能、角色情緒、心理健康SF-36維度的平均分值顯著低于對照組，RVVC患者的生理、心理綜合評分均明顯低于對照組(P<0.05)[4]。RVVC不僅給患者帶來精神、心理壓力，也給社會增加了經(jīng)濟負擔。故我們需要重視RVVC的防治，積極尋找RVVC的危險因素。

2 RVVC免疫學研究進展

目前，關(guān)于RVVC的發(fā)病機制尚存在一定的爭議。近年來，多項研究指出，其主要與陰道局部免疫及中性粒細胞“失能”等有關(guān)。本文就RVVC發(fā)病的免疫學機制研究進展作一綜述。

2.1 陰道上皮細胞在RVVC發(fā)病中的作用

人體的黏膜屏障是免疫、化學和機械應力的保護，固有層是黏膜免疫系統(tǒng)的一個重要部分。陰道上皮天然免疫分子的分泌水平會隨著月經(jīng)周期呈現(xiàn)出周期性的動態(tài)變化，在卵泡期主要呈現(xiàn)上調(diào)，而在黃體期則主要呈現(xiàn)下調(diào)[5]。陰道上皮細胞通過直接與念珠菌接觸進而產(chǎn)生生長抑制活性，提供了適度而重要的一線保護作用[6]。這種上皮細胞所介導的殺菌反應既能殺滅真菌，產(chǎn)生炎癥反應，也能促進無癥狀共棲[7]。既往無RVVC病史的婦女其陰道上皮細胞表現(xiàn)出對念珠菌的生長具有抑制作用，這也表明了陰道上皮細胞在宿主陰道免疫防御中的積極作用[8-9]。陰道黏膜在局部免疫反應中具有潛在的功能，育齡期婦女陰道黏膜的淋巴細胞密度受性激素水平的影響呈周期性改變[10]。RVVC緩解期女性陰道局部產(chǎn)生較高水平的IL-12和IFN-γ，可能RVVC患者陰道局部存在異常的免疫應答，從而使陰道黏膜上皮組織防御功能受影響[11]。RVVC發(fā)作期婦女陰道局部處于“亢奮”狀態(tài)，Th1細胞抵御念珠菌作用過度，同時Th2細胞效應增強，共同作用使陰道局部過敏、損傷[12]。推測RVVC反復發(fā)作，可能由于陰道黏膜對真菌成分致敏，反復激活局部免疫，導致陰道黏膜微環(huán)境破壞而難以修復，病程纏綿。

2.2 全身性適應性免疫在RVVC中的作用

近來諸多動物和臨床試驗表明，全身適應性免疫及相關(guān)的細胞因子在預防陰道炎中作用不大[13-14]。既往的研究認為VVC與其他部位的念珠菌病相似，均存在適應性免疫反應缺陷，但是VVC或RVVC在CD4+T細胞減少的HIV婦女中的發(fā)病率并沒有升高[15]。這種現(xiàn)象在小鼠實驗中也得到證實，全身性適應性免疫對此并無明顯保護作用[13-14]。說明全身性適應性免疫在RVVC中的作用并不大，可能陰道局部免疫發(fā)揮著更大的作用。

2.3 固有免疫在RVVC發(fā)病中的作用

固有免疫在抵御念珠菌感染及其易感性中起到重要的作用，陰道上皮細胞通過抑制白念珠菌的生長，將念珠菌定植水平限制在引發(fā)癥狀性感染所需的閾值以下，從而給機體提供一定程度的保護作用[9,16]。中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)是宿主抵抗白念珠菌感染的天然免疫防御的主要成分之一[16-17]，VVC與急性炎癥反應密切相關(guān)，其特征是陰道內(nèi)出現(xiàn)PMNs聚集，這有助于癥狀的發(fā)生，卻不能清除念珠菌的感染[18]。念珠菌雖然可以激活先天免疫信號進而導致中性粒細胞募集進入陰道黏膜，但實驗證據(jù)表明中性粒細胞聚集會放大炎癥級聯(lián)反應，卻似乎不能減輕真菌的負荷，而免疫系統(tǒng)的過度反應，可能會對其造成一定的損傷。盡管陰道局部存在強烈的炎癥反應，但越來越多的證據(jù)表明PMNs不能減輕真菌的負荷[18-19]，卻使陰道黏膜處于慢性炎癥狀態(tài)[20]。單純的真菌負荷不足以引起癥狀性感染，也不能完全解釋VVC的易感性，因為陰道黏膜常被念珠菌定植卻沒有臨床表現(xiàn)，有些女性陰道內(nèi)念珠菌高度定植卻不總是出現(xiàn)癥狀，反之亦然。

在VVC動物模型中70%以上的小鼠表現(xiàn)出高水平的PMNs浸潤，但似乎沒有減輕陰道真菌負荷[20]。國外一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，PMNs遷移只存在于那些陰道接種念珠菌后出現(xiàn)臨床癥狀的患者身上[21]，與無癥狀定植(共棲)相比，陰道炎的癥狀與PMNs的存在有很強的相關(guān)性[20]，給無VVC病史的婦女即使接種很高濃度(>108)的念珠菌，真菌仍然不能較好地在其陰道內(nèi)定植[21]。這也證實真菌負荷并非驅(qū)動疾病癥狀的唯一原因。說明陰道內(nèi)的PMNs功能障礙可能是由于PMNs固有的缺陷，或者陰道環(huán)境中存在抑制其正常功能。

在慢性VVC易感女性中，念珠菌刺激陰道上皮細胞產(chǎn)生報警素和促炎細胞因子，誘導PMNs遷移，導致炎癥環(huán)境和相關(guān)伴隨癥狀[20,22]。不易感VVC婦女陰道上皮細胞不易對促炎細胞因子作出反應，而是以非炎癥方式促進念珠菌的靜態(tài)生長抑制，以維持共棲[20]。說明RVVC的發(fā)病可能由于陰道微環(huán)境中存在某些趨化因子誘導PMNs遷移，或者可能由于陰道上皮細胞受抗原刺激閾值降低，免疫反應亢進。

PMNs的抗真菌活性包括巨噬細胞1抗原(macrophage-1 antigen,Mac-1)與白念珠菌酸堿度調(diào)節(jié)抗原1蛋白(pH regulated antigen 1 protein,Pra1p)的相互作用。Mac-1高表達于中性粒細胞。Pra1p是一種念珠菌表面相關(guān)和分泌的蛋白質(zhì)，存在于酵母態(tài)和菌絲態(tài)中，但在菌絲態(tài)中高度表達[23]。Pra1p可與Mac-1結(jié)合，介導人吞噬細胞的黏附和遷移。念珠菌Pra1p高表達菌株增強中性粒細胞遷移和黏附。缺乏Pra1p的白念珠菌突變株比野生型菌株支持中性粒細胞遷移的程度低。CD-1小鼠為VVC抵抗小鼠的代表，在接種念珠菌后不能維持定植，即使用菌絲缺失、菌絲缺陷甚至野生型念珠菌菌株在不同的接種濃度，陰道真菌負荷仍不受誘發(fā)的PMNs所影響[24]。C3h/Hen小鼠為VVC易感小鼠[25]。用生物膜缺陷的白念珠菌突變體與野生型白念珠菌感染陰道期間發(fā)現(xiàn)兩者的定植率無明顯差別[18]，說明PMNs功能障礙無法用念珠菌菌株生物膜形成來解釋。CD-1小鼠接種念珠菌后的陰道涂片鏡檢顯示：PMNs與念珠菌菌絲有密切接觸，而C3h/hen小鼠的涂片則顯示中性粒細胞與菌絲接觸較少。在接種念珠菌菌種3 d后，易感小鼠及耐受小鼠均產(chǎn)生了急性炎癥反應，然而，11 d后耐受小鼠的真菌負荷及PMNs均下降，而易感小鼠的各項參數(shù)仍然維持。故VVC抵抗小鼠陰道真菌負荷減少是可能由于PMNs反應和足夠的抗真菌活性清除所致。易感小鼠的腹膜及陰道PMNs在體外與真菌之間表現(xiàn)出同等的殺菌能力。如將PMNs放置在易感小鼠陰道條件培養(yǎng)基(小鼠陰道灌洗液的無菌制備，陰道條件培養(yǎng)基可以很好地模仿易感小鼠的陰道環(huán)境)時，觀察PMNs體外殺菌功能，發(fā)現(xiàn)陰道條件培養(yǎng)基下無論是腹膜還是陰道PMNs都不能發(fā)揮足夠的殺菌能力。說明易感小鼠陰道環(huán)境中可能存在抑制因子影響PMNs抗真菌活性。其他能結(jié)合真菌多糖的C類凝集素受體Dectin-1、Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)2等白細胞受體也可能參與真菌識別，但它們不直接介導白細胞遷移、黏附、殺傷和吞噬。Dectin-1和TLR2僅識別白念珠菌的酵母形式[26]，它們在PMNs消除真菌方面可能僅起到很小的作用，而PMNs僅能殺死和/或吞噬白念珠菌的有害形式。VVC易感小鼠和VVC抵抗小鼠的實驗對比，說明易感小鼠陰道微環(huán)境中存在一些抑制因子導致了PMNs功能障礙，抑制了其正常殺菌能力。

2.4 RVVC發(fā)病與整合素、硫酸乙酰肝素的關(guān)系

整合素是細胞黏附分子家族成員，主要通過介導細胞與細胞外基質(zhì)間的“雙向信號轉(zhuǎn)導”來調(diào)控細胞的遷移、增殖和凋亡，參與機體的病理、生理過程。淋巴細胞功能相關(guān)抗原1(lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-1)和巨噬細胞1抗原(Mac-1)及其受體，例如細胞間細胞黏附分子(intercellular cell adhesion molecules-1,ICAM-1)，連接黏附分子(junctional adhesion molecules,JAM-A)和晚期糖基化產(chǎn)物(receptors for advanced glycation end products,RAGE)的受體對于促進PMNs募集至關(guān)重要，但是Mac-1能更有效地誘導由內(nèi)而外的信號傳導[27]。PMNs的Mac-1受體是通過Pra1p在白念珠菌菌絲上的表達來識別真菌的關(guān)鍵性配體[23]，Mac-1具有結(jié)合多種配體和調(diào)節(jié)各種白細胞功能的能力[28]。Mac-1作為β2整合素家族中的重要一員，不僅能促進吞噬細胞的細胞毒作用和增強幾種效應分子功能而發(fā)揮促炎作用。Fagerholm等[29]研究發(fā)現(xiàn) Mac-1可介導中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞的吞噬作用。Mac-1與配體結(jié)合后介導細胞活化?；罨驧ac-1由預先形成的胞質(zhì)庫迅速轉(zhuǎn)移至細胞表面，從而使細胞表面 Mac-1上調(diào)[30]。Mac-1的信號轉(zhuǎn)導特性對PMNs功能的具有調(diào)控作用。

硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)是多糖糖胺聚糖家族的一員，多糖廣泛表達于哺乳動物組織的細胞表面和整個細胞外基質(zhì)，包括陰道上皮[31]。HS蛋白聚糖的一條或多條HS鏈附著在細胞表面或細胞外基質(zhì)蛋白上，由于鏈長的變化而具有顯著的結(jié)構(gòu)多樣性[32]。研究表明，HS是PMNs活化所必需Mac-1的競爭性配體[33]，HS在小鼠陰道上皮細胞和人陰道上皮細胞均有表達[34]?；谛∈笈c人免疫病理反應的相似性,有學者推測易感VVC或RVVC患者陰道分泌物中HS可能水平升高，同樣也會通過對Mac-1的競爭性抑制來促進中性粒細胞無反應[35,20]。相反，那些既往沒有VVC病史或者VVC抵抗的女性，要么陰道局部HS水平偏低，或者表達不同的HS亞型，要么在具有相似HS水平的情況下不能觸發(fā)免疫致病性PMNs遷移。通過比較VVC易感和VVC抵抗小鼠的陰道局部反應，確定在易感小鼠陰道環(huán)境中存在的硫酸乙酰肝素作為PMNs上Mac-1的競爭性配體，有效地使PMNs不能與念珠菌結(jié)合以啟動。因此，有癥狀的VVC/RVVC的結(jié)果被假定為依賴于一種由PMNs介導的免疫致病性反應，該反應涉及HS，可有效地將PMNs置于功能性無反應狀態(tài)[36]。RVVC與免疫缺陷無關(guān)，與陰道局部強烈的免疫病理反應有關(guān)[36]。

2.5 RVVC發(fā)病與中性粒細胞胞外陷阱關(guān)系

Mac-1介導的PMNs激活被證實能通過形成中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)促進真菌的殺滅[23]。PMNs活化后發(fā)生氧化性爆發(fā)，導致其顆粒物質(zhì)(組織蛋白酶G和彈性蛋白酶)釋放到細胞外空間，隨后產(chǎn)生NETs。NETs作為繼中性粒細胞吞噬、分泌相關(guān)細胞因子以及脫顆粒等作用之后的新型有效的抗菌屏障，能夠調(diào)節(jié)生理性的免疫防御，限制感染的擴散[37]。當機體受到病原微生物入侵時，NETs可借助于其特殊的以DNA為主體的纖維絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來快速、有效地捕獲病原體，限制炎癥擴散，發(fā)揮強大的免疫防御等功能[38]。NETs不僅能抵御微生物，還可通過激活釋放至細胞外的細胞因子來直接調(diào)節(jié)炎癥，是IL-1家族細胞因子激活的局部平臺。NETs結(jié)合的蛋白酶具有酶促活性，可以加工和激活I(lǐng)L-36α、IL-36β和IL-36γ以及IL-1α，以增強其促炎潛能[39]。IL-1包括IL-1α、IL-1β和IL-1γ三個成員，主要由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，IL-1具有廣泛的生物學作用：促進T細胞活化，直接或間接誘導Th2細胞表達IL-4，并激活中性粒細胞黏附。IL-1α通過嗜中性粒細胞蛋白酶的加工可以使活性提高8～10倍[40]。IL-36家族細胞因子是多種炎癥性疾病中的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)。NETs結(jié)合的顆粒蛋白酶對細胞因子活性的控制能在PMNs募集過多的炎性環(huán)境中起作用。NETs還能促進巨噬細胞中IL-1β和IL-18的合成，進一步促進中性粒細胞中NETs的形成[41],從而導致了炎性環(huán)境的持續(xù)存在。IL-1β和IL-18均屬于IL-1家族成員，能激活PMNs黏附。NETs可以阻止微生物傳播和感染，也可以通過促炎細胞因子來加劇炎癥。NETs上的蛋白酶可以通過破壞或激活細胞因子來調(diào)節(jié)細胞因子水平，從而削弱或促進炎癥[42-44]。中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)是一種存儲在中性粒細胞初級顆粒中的絲氨酸蛋白酶，可以促進中性粒細胞的組織浸潤。NE通過蛋白水解過程調(diào)節(jié)細胞外細胞因子和趨化因子(包括IL-1家族細胞因子)的活性來作為促炎介質(zhì)[45]。證據(jù)表明：中性粒細胞絲氨酸蛋白酶通過蛋白水解過程調(diào)節(jié)細胞外細胞因子和趨化因子(包括IL-1家族細胞因子)的活性來作為促炎介質(zhì)[46]。

NETs在先天免疫系統(tǒng)中像一把雙刃劍。NET的過量產(chǎn)生可能會導致慢性炎癥，NETs也可以觸發(fā)其他免疫細胞(例如單核細胞和巨噬細胞)通過NLRP3炎性小體釋放IL-1β，這又導致了促炎環(huán)境的持續(xù)存在。推測RVVC的發(fā)病與中性粒細胞調(diào)節(jié)失衡有關(guān)，NETs雖具有抵御微生物的功效，但是一旦過量產(chǎn)生，勢必導致局部免疫紊亂，陰道黏膜持續(xù)慢性炎癥，不利于陰道微環(huán)境的修復。

2.6 RVVC發(fā)病與NLRP3炎性小體關(guān)系

NLRP3炎性小體是一種細胞內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)，是炎性體復合物的關(guān)鍵組分,可識別危險信號并激活炎癥反應，可通過釋放IL-1β和IL-18來激活。NLRP3炎性小體的激活在VVC發(fā)病中有很重要作用[47,42]。NET通過LL-37激活P2X7R觸發(fā)鉀離子外流在激活巨噬細胞中的NLRP3炎性小體中起核心作用。NLRP3炎性小體通過激活caspase-1而啟動炎癥反應，活化的caspase-1可以將pro-IL-1β裂解為分泌型活性IL-1β，IL-1β是驅(qū)動宿主對感染作出反應的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)。由NLRP3基因轉(zhuǎn)導的IL-1β介導的過度炎癥在RVVC的發(fā)病機制中起著重要作用，推測可能該通路是該病的潛在治療靶點[48]。Roselletti等[42]通過檢測20例VVC患者、15例被真菌定植但無癥狀患者、10例無真菌定植受試者中宿主陰道炎癥因子和真菌毒力因子的表達。發(fā)現(xiàn)：負責編碼NLRP3和caspase-1炎癥體組分的基因的過度表達使VVC患者與無癥狀的定植或非真菌定植婦女顯著分化。VVC婦女陰道NLRP3炎癥小體的表達與中性粒細胞募集及IL-1β和IL-8的產(chǎn)生有關(guān)。這兩種細胞因子都存在，盡管濃度較低，但在真菌定植和非真菌定植婦女的陰道液中也存在。表明NLRP3炎癥體復合物胞漿內(nèi)的激活在人類VVC發(fā)病中起著關(guān)鍵的作用[42]。

2.7 RVVC發(fā)病與MAPK/ SRF關(guān)系

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)存在于所有的真核細胞中，是胞內(nèi)介導外界刺激信號通路之一。該信號通路是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶系統(tǒng)，參與了細胞增殖、分化、運動、應激反應等活動，在細胞外信號轉(zhuǎn)導與細胞反應中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[40]。MAPK抑制劑U0126可阻斷嗜中性彈性蛋白酶誘發(fā)的炎癥，提示MAPK信號通路參與炎癥反應[49]。MAPK通路特異性阻斷劑(SP600125、PD98059和JNK、ERKβ激活抑制劑)可阻斷中性粒細胞活化，抑制中性粒細胞活化導致的溶酶體釋放和脫顆粒過程，表明MAPK通路參與中性粒細胞活化過程[50]。外源和內(nèi)源刺激激活MAPK信號傳導途徑，誘導內(nèi)皮細胞中的肌動蛋白重塑及內(nèi)皮細胞通透性改變，使內(nèi)皮細胞完整性被破壞以響應氧化應激反應。

血清反應因子(serum response factor,SRF)屬于轉(zhuǎn)錄因子家族MADS(MCM1,agamous,deficiens和SRF)的成員之一，是普遍表達的轉(zhuǎn)錄因子和肌動蛋白細胞骨架的主要調(diào)節(jié)因子，其與靶基因的啟動子區(qū)域中的血清反應元件(SRE)結(jié)合，通過三元復合因子(TCF)在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)途徑中發(fā)揮作用[51]。ERK、MAPK，通過向相鄰蛋白質(zhì)添加磷酸基團使信號級聯(lián)傳遞，將轉(zhuǎn)錄因子[包括SRF，核因子κB(NF-kB)和環(huán)AMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)結(jié)合位點]激活并轉(zhuǎn)移至細胞核，誘導靶基因表達[52]。SRF使中性粒細胞遷移至炎癥部位；SRF對中性粒細胞的功能具有特異性, SRF可通過控制整合素聚集和運輸促進活化的中性粒細胞黏附；SRF可通過影響中性粒細胞的結(jié)構(gòu)和功能，導致中性粒細胞聚集和活化，說明SRF可能參與RVVC的發(fā)病。SRF是MAPK信號通路的下游靶標，甲基汞通過增強MAPK信號通路(p38和ERK)的磷酸化水平，使SRF依賴性基因CC基序趨化因子配體4(CCL4)的表達水平升高。MAPK(p38，ERK)抑制劑使CCL4的表達水平下降，提示MAPK信號通路的磷酸化可激活下游的SRF[53]。MAPK信號傳導途徑的激活，使內(nèi)皮細胞完整性破壞以響應氧化應激，SRF通過控制整合素聚集和運輸?shù)倪^程，導致活化的中性粒細胞黏附和遷移至炎癥部位釋放NE，NE進一步促進中性粒細胞的組織過度浸潤，導致炎癥狀態(tài)持續(xù)。VVC/RVVC可能是由中性粒細胞過度攻擊性的先天性反應引起的，而不是適應性免疫反應受損[54]。因此，推測MAPK可能通過調(diào)控SRF從而導致中性粒細胞過度活化釋放NE從而參與RVVC的發(fā)病。

綜上所述，RVVC的免疫學發(fā)病機制復雜，到目前為止還未能有一種學說能夠比較合理、全面地解釋RVVC的發(fā)病過程。RVVC患者陰道內(nèi)出現(xiàn)PMNs聚集，這有助于癥狀的發(fā)生，卻不能清除念珠菌的感染，使陰道黏膜處于慢性炎癥狀態(tài)。說明RVVC患者可能存在局部黏膜免疫系統(tǒng)過度反應。RVVC患者陰道局部PMNs存在過度活化。MAPK信號通路激活，SRF通過控制整合素聚集和運輸對PMNs的功能有特異性調(diào)控作用，導致活化的PMNs黏附、遷移至炎癥部位、釋放NE。NE進一步促進PMNs的組織過度浸潤，建立正反饋機制循環(huán)，導致炎癥狀態(tài)持續(xù)。因此，MAPK可能通過調(diào)控SRF從而導致PMNs過度活化釋放NE 從而參與RVVC的發(fā)病。在免疫學、分子生物學等多學科的知識幫助下，對于RVVC的免疫學研究會取得更大的突破和進展，從而為RVVC的防治提供一定幫助。