謝韻 帕麗達(dá)·阿布利孜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830011)

曲霉病是由曲霉屬真菌，如煙曲霉(85%)、黃曲霉(5%～10%)、土曲霉(2%～10%)和黑曲霉(2%～3%)引起的一組疾病。它可引起過敏性疾病，如過敏性鼻竇炎或過敏性支氣管肺曲霉病，還可引起皮膚曲霉病、曲霉球、慢性肺曲霉病等臨床疾病[1]。就患者結(jié)局和疾病管理而言，侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)是曲霉病最為嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)形式[2]。據(jù)報(bào)道，IA在極少數(shù)情況下會(huì)發(fā)生于免疫功能正常的患者[3-4]，主要見于惡性腫瘤或接受化療、皮質(zhì)類固醇和器官移植等免疫功能低下患者[5-6]。醫(yī)學(xué)進(jìn)步提高了免疫抑制條件下患者的生存率，但增加了IA的感染風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。煙曲霉是曲霉病的主要病原真菌，但近二十年來，除煙曲霉外，其他曲霉屬的分離率也越來越高。這一轉(zhuǎn)變歸因于免疫缺陷患者數(shù)量的增加、病原真菌檢測(cè)和鑒定的進(jìn)步以及廣譜抗真菌藥物的廣泛使用。曲霉的鑒定通常是宏觀和微觀形態(tài)特征的判定[9]，這些方法難以將罕見曲霉菌種與其他相關(guān)菌種區(qū)分[10-11]。有一些罕見曲霉菌種如A.calidoustus和A.lentulus對(duì)多種抗真菌藥物敏感性降低[12-13]。因此實(shí)驗(yàn)室需正確鑒定菌種、完善藥敏試驗(yàn)結(jié)果以指導(dǎo)選擇合適的抗真菌藥。

1 流行情況

煙曲霉是臨床上分離率最高的曲霉，黑曲霉、黃曲霉和土曲霉分離頻率比煙曲霉低。以IA為對(duì)象的研究也表明，這4個(gè)菌種的分離頻率較高[14]。Balajee等[15](以下簡(jiǎn)稱TRANSNET研究)和Alastruey-Izquierdo等[16](以下簡(jiǎn)稱FILPOP研究)，分別報(bào)告了200多個(gè)曲霉臨床分離株的分析結(jié)果。在TRANSNET研究中，通過DNA序列鑒定，從美國(guó)移植受者中分離出208株曲霉，其中11%被鑒定為罕見曲霉菌屬[15]。FILPOP研究顯示，從深部組織、血液培養(yǎng)和呼吸器官中分離的323個(gè)菌株中，大約15%是Aspergilluslentulus、Aspergillustubingensis、Aspergilluscalidoustus、Aspergillusalliaceus等罕見菌種[16]。美國(guó)德克薩斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離了37株曲霉，對(duì)臨床上相對(duì)少見的屬部分進(jìn)行初步鑒定。其中13個(gè)種為罕見菌種[17]。從韓國(guó)9所大學(xué)醫(yī)院分離334株曲霉臨床株，通過ITS區(qū)和D1/D2區(qū)序列測(cè)定[18]，僅β-微管蛋白測(cè)序就可鑒定出77株(23.1%)罕見曲霉臨床分離株。這些菌種真實(shí)流行率尚不清楚，需要進(jìn)一步擴(kuò)大人群數(shù)量。過去幾十年，因?yàn)殍b別水平有限且分子檢測(cè)尙不能作為常規(guī)檢測(cè)方法，造成實(shí)驗(yàn)室中的分離株被錯(cuò)誤鑒定。罕見曲霉病的發(fā)生率往往比實(shí)際數(shù)據(jù)要高得多。

2 罕見曲霉的發(fā)現(xiàn)

罕見曲霉的故事始于A.lentulus[19]。Balajee及其同事調(diào)查了7株非典型煙曲霉臨床分離株，它們產(chǎn)孢速度緩慢，對(duì)幾種抗真菌藥物的體外敏感性較低。通過多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)，發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)菌株屬于一個(gè)新的真菌種，命名為A.lentulus[19]。2013年的一則文獻(xiàn)[19]報(bào)告了1例腎移植患者在移植4個(gè)月后感染肺炎，接受伏立康唑治療后痊愈(MIC為0.5 μg/mL)，并從他的痰液中收集到A.lentulus。文獻(xiàn)還提到了另外5例A.lentulus[20]的病例，但抗真菌治療的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和臨床信息有限。A.lentulus發(fā)現(xiàn)后不久，煙曲霉屬部分出現(xiàn)了一個(gè)新菌種Neosartoryapseudofischeri(N.pseudofischeri)[20]。根據(jù)“一種真菌，一個(gè)名字”的倡議，現(xiàn)在被稱為A.theromutatus[1]。實(shí)際上Balajee等[21]通過研究3株產(chǎn)孢量較差的煙曲霉分離株尋找A.lentulus。但在其中2例患有囊性纖維化患者的痰液中分離出A.theromutatus。自1929年以來，只有7例IA與A.theromutatus有關(guān)，其中3例沒有抗真菌治療的信息[21]。隨著A.lentulus和A.theromutatus的出現(xiàn)，罕見曲霉屬菌種呈指數(shù)增加。

3 曲霉的鑒定

重癥監(jiān)護(hù)室IA患者的死亡率可高達(dá)90%，但如果診斷及時(shí)，IA的總死亡率可下降至50%[22]。真菌培養(yǎng)是菌種診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。但其根據(jù)形態(tài)診斷的敏感度和特異度有限，僅憑組織病理學(xué)很難做出物種水平的鑒定[23]。此外，真菌培養(yǎng)的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，需要幾天到幾周的時(shí)間。這可能導(dǎo)致抗真菌治療的延遲和選擇不適合的藥物。曲霉臨床分離株在形態(tài)上有時(shí)容易混淆且專業(yè)性強(qiáng)，錯(cuò)誤鑒定菌種的情況時(shí)常發(fā)生[9]。因此，迫切需要開發(fā)快速、無創(chuàng)和準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)，從形態(tài)、生長(zhǎng)溫度、藥物敏感性和分子表型等幾個(gè)方面[24]進(jìn)行菌種鑒定。

3.1 DNA測(cè)序

rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1-5.8S-ITS2)的序列分析是真菌中最常見的測(cè)序標(biāo)記，一直被認(rèn)為真菌的官方DNA條形碼[25]，所涉及的引物幾乎可以與任何真菌DNA雜交。國(guó)際人與動(dòng)物真菌病協(xié)會(huì)為臨床真菌鑒定，提供了一個(gè)ITS序列數(shù)據(jù)庫[26]。但曲霉屬的ITS區(qū)域沒有足夠的多態(tài)性，需要一個(gè)二級(jí)識(shí)別標(biāo)記鑒定給定的菌種。鈣調(diào)蛋白、β-微管蛋白和肌動(dòng)蛋白都是曲霉分類中的關(guān)鍵基因，與ITS結(jié)合可準(zhǔn)確鑒定曲霉屬[27]。該方法關(guān)于真菌測(cè)序的有限數(shù)據(jù)不到1%、數(shù)據(jù)庫中的注釋錯(cuò)誤以及廣泛用于擴(kuò)增β-微管蛋白基因的引物對(duì)benA基因沒有特異性，存在一定的局限性，進(jìn)而導(dǎo)致不一致分類樹的產(chǎn)生[28]。測(cè)序既昂貴又耗時(shí)，因此很少有臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。

3.2 MLST

MLST依賴管家基因編碼區(qū)內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以確保給定菌種的每個(gè)分離株都得到正確的擴(kuò)增[29]。一些進(jìn)化限制有望限制這類必需基因的突變，但管家基因的核苷酸變化率預(yù)計(jì)足以區(qū)分不同的菌株。MLST的初步步驟是在側(cè)翼非可變區(qū)的測(cè)試位點(diǎn)外設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序后，點(diǎn)突變分別確定單倍體或二倍體微生物序列類型(ST)或二倍體序列類型(DST)。該方法具有實(shí)用性，前提是序列具有足夠的質(zhì)量。在處理從培養(yǎng)中獲得的純菌落時(shí)，MLST沒有技術(shù)上的限制。但Sanger測(cè)序直接從臨床樣本中進(jìn)行基因分型，MLST分型對(duì)混合物的檢出率很低，無法檢測(cè)到20%～30%以下的少數(shù)等位基因[30]。

3.3 MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定

物種水平鑒定需要對(duì)ITS序列以及β-微管蛋白或鈣調(diào)蛋白基因進(jìn)行核酸擴(kuò)增和測(cè)序分析，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不具備以上條件[31]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)在快速準(zhǔn)確地區(qū)分煙曲霉和其他曲霉方面結(jié)果可觀[32]。MALDI-TOF MS能獲得高精度的絲狀真菌鑒定結(jié)果，這在以前僅限于少數(shù)幾個(gè)參考實(shí)驗(yàn)室。Alanio等[33]描述了MALDI-TOF MS對(duì)罕見曲霉的鑒定，開發(fā)了一個(gè)參考光譜數(shù)據(jù)庫，包括來自7個(gè)曲霉切片的28個(gè)臨床相關(guān)菌種，其中有5個(gè)常見菌種和23個(gè)新菌種。同時(shí)，Normand等[34]描述了一種標(biāo)準(zhǔn)化的方法識(shí)別任一類型的絲狀真菌，通過增加參考譜庫中的參考文獻(xiàn)數(shù)量，成功地解決了從混合絲狀真菌培養(yǎng)物中獲得異質(zhì)MALDI-TOF光譜的關(guān)鍵問題。該步驟顯著提高了MALDI-TOF MS鑒定臨床絲狀真菌的有效性。經(jīng)過對(duì)大量絲狀真菌分類群的進(jìn)一步研究，驗(yàn)證了標(biāo)準(zhǔn)化的MALDI-TOF MS程序在物種水平上準(zhǔn)確識(shí)別臨床相關(guān)曲霉的能力，包括罕見曲霉菌種[35-37]。臨床實(shí)驗(yàn)室的MALDI-TOF MS網(wǎng)絡(luò)代表了該領(lǐng)域最近的重大發(fā)展。這一進(jìn)展對(duì)于沒有配備MALDI-TOF MS系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室特別有用。這類實(shí)驗(yàn)室可以準(zhǔn)備MALDI-TOF MS靶板，并將其發(fā)送到MALDI-TOF鑒定平臺(tái)，之后通過專用軟件接收結(jié)果[38]。鑒定質(zhì)量直接取決于所用數(shù)據(jù)庫的范圍。Bruker的第一個(gè)商業(yè)模型數(shù)據(jù)庫是絲狀真菌庫1.0[39]，一些作者[16，35]曾試圖使用這個(gè)商業(yè)數(shù)據(jù)庫來鑒定曲霉屬，但由于引進(jìn)的種和菌株數(shù)量較少，結(jié)果并不令人滿意。西班牙的學(xué)者，花了兩年的時(shí)間，為絲狀真菌庫1.0補(bǔ)充了一個(gè)內(nèi)部參考數(shù)據(jù)庫(HUVr)，并通過對(duì)固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的曲霉臨床分離株進(jìn)行鑒定來驗(yàn)證有效性[40]。研究結(jié)果顯示：HUVr數(shù)據(jù)庫增加了23個(gè)菌種的53個(gè)條目，可以收錄12個(gè)新型罕見菌種，并增加已經(jīng)收錄的11個(gè)菌種的條目數(shù)量。而絲狀真菌庫1.0只提供了7個(gè)罕見菌種，分別占每個(gè)文庫所含菌種總數(shù)的69.6%和38.9%。最后，補(bǔ)充的文庫有142個(gè)條目，可以從11個(gè)部分鑒定出30種不同的曲霉：11個(gè)非罕見種和19個(gè)罕見種。通過前瞻性研究表明，無論介質(zhì)類型(即固體或液體)，MALDI-TOF MS中HUVr數(shù)據(jù)庫的使用具有較高的可靠性。95.5%的菌株在種水平上進(jìn)行了鑒定，其余4.5%的菌株在屬水平上進(jìn)行了鑒定。如果Schulthess等[41]在沒有增加錯(cuò)誤識(shí)別的情況下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，物種水平上的鑒定就會(huì)達(dá)到100%。法國(guó)作者通過一個(gè)獨(dú)立的、可自由訪問的在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，前瞻性地評(píng)估不同實(shí)驗(yàn)室中罕見曲霉菌種的鑒定準(zhǔn)確性。鑒定結(jié)果與序列鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比：在物種水平上，罕見曲霉菌種的整體準(zhǔn)確率為66.1%，非罕見菌種的準(zhǔn)確率為92.2%[42]。在MALDI-TOF MS中創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫是一個(gè)緩慢而昂貴的過程，但如果想要獲得更好的鑒別能力，就有必要這樣做。以上學(xué)者的研究，提高了實(shí)驗(yàn)室曲霉菌種的鑒定水平。這些研究成果可作為真菌實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)絲狀真菌鑒定，以提高臨床相關(guān)曲霉菌種鑒定的準(zhǔn)確性，并顯著縮短反應(yīng)時(shí)間。然而，這種技術(shù)價(jià)格昂貴，不能廣泛使用，而且需要訓(xùn)練有素的人員才能操作。

4 藥敏情況

就目前曲霉病管理指南所述，伏立康唑(VCZ)被推薦為IA的一線用藥，兩性霉素B(AMB)或異伍康唑(ISA)用于替代治療。近年來唑類耐藥菌株數(shù)量逐漸增加，其臨床治療效果并不理想。Pinto等[43]對(duì)190個(gè)煙曲霉分離株進(jìn)行耐藥觀察，氮唑類對(duì)煙曲霉的MIC較高。AMB對(duì)黃曲霉和土曲霉有較高的MIC，81%的黃曲霉MIC≥2 mg/L[44]。而伊曲康唑(ITZ)對(duì)黑曲霉有較高的MIC(4 mg/L)，對(duì)AMB未顯示出抗藥性，這在以前的文獻(xiàn)中也有描述[45]。

隨著分子技術(shù)的革新，許多新的罕見曲霉被發(fā)現(xiàn)。如前文所述，其流行率為10%～15%，對(duì)唑類和AMB的敏感性很低[46]。但罕見曲霉的各研究數(shù)據(jù)存在異質(zhì)性或不完整性，應(yīng)該謹(jǐn)慎評(píng)估其抗真菌敏感性表型。有文獻(xiàn)指出[23,47]，A.lentulus對(duì)唑類、AMB和棘球菌素類藥物的敏感性降低；A.tubingensis對(duì)ITZ的抗藥性比黑曲霉高，但與其他唑類化合物的交叉抗藥性或?qū)ζ渌拐婢幬锏目顾幮运坪鹾苌僖?；A.Calidoustus對(duì)阿尼芬凈、米卡芬凈、AMB和特比萘芬的敏感度較低，但VCZ的MIC往往較高，而A.Ustus處于較低水平；AMB和卡泊芬凈對(duì)A.alliaceus有較高的MIC，而VCZ和ITZ對(duì)該菌種的MIC通常較低。因此，正確鑒定臨床分離株是使用最佳抗真菌藥物的關(guān)鍵。

5 總 結(jié)

臨床罕見曲霉菌屬報(bào)告的增加和特殊人群(如危重患者)IA感染的報(bào)道，讓醫(yī)生們認(rèn)識(shí)到種水平上準(zhǔn)確鑒定真菌的必要性。MLST和MALDI-TOF MS提供了準(zhǔn)確鑒定常見和罕見曲霉的方法。其中一些未知的曲霉對(duì)抗真菌藥物有特殊的耐藥性，識(shí)別錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致治療不佳和預(yù)后不良。它們表現(xiàn)出很高(高達(dá)40%)的抗真菌耐藥性，其標(biāo)準(zhǔn)化管理有特殊的臨床意義。常見曲霉感染與罕見曲霉感染，兩者治療結(jié)果是否有差別，有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。但罕見曲霉較高的抗真菌耐藥性和死亡率頻繁被報(bào)道[32,47,48]，有必要對(duì)臨床分離的真菌進(jìn)行正確的菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。形態(tài)學(xué)的鑒定大多僅限于物種復(fù)合水平，新的鑒定技術(shù)將會(huì)更好更規(guī)范的進(jìn)入到常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室?，F(xiàn)今關(guān)于罕見曲霉治療的臨床數(shù)據(jù)非常有限，在治療上是一個(gè)挑戰(zhàn)，但也不要過度恐慌，早預(yù)防、早診斷結(jié)合體外藥敏試驗(yàn)和分子技術(shù)，可更科學(xué)地治療，提高患者生存率。