石亞瑋，李鑫，武國(guó)德，石正洪

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，蘭州 730000

近年，結(jié)核病的發(fā)病率和病死率仍較高。除了肺結(jié)核，結(jié)核分支桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuber‐culosis complex，MTBC）可感染肺外組織，導(dǎo)致肺外結(jié)核（extrapulmonary tuberculosis，EPTB）。結(jié)核性腦膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是最嚴(yán)重的一種EPTB，是目前結(jié)核病致殘或致死的主要原因［1］。TBM 占肺外結(jié)核的6.8%［2］。TBM 好發(fā)于兒童和免疫缺陷人群，但TBM 的傳染性低于活動(dòng)性肺結(jié)核。因?yàn)樵缙诿鞔_診斷困難，TBM 患者的預(yù)后較差，治療后常存在嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損癥狀，病死率較高（成人50%，兒童20%）［1，3］。早期明確TBM 診斷，及時(shí)有效對(duì)癥治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法在結(jié)核病的診斷中均存在一定局限性。宏基因組二代測(cè)序（metagenomicNextGenerationSe‐quencing，mNGS）技術(shù)不依賴(lài)于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，可直接對(duì)臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，在基因水平快速地檢測(cè)病原體，理論上可檢測(cè)出樣本中的所有病原體，適用于危急重癥和疑難感染的診斷。mNGS 的出現(xiàn)或許為T(mén)BM 的診斷提供了新思路?，F(xiàn)就mNGS在結(jié)核性腦膜炎診斷中應(yīng)用的相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 臨床常用TBM診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)

1.1 腦脊液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法 是在細(xì)菌層面進(jìn)行結(jié)合分枝桿菌病原體檢測(cè)，目前臨床常用TBM的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法有腦脊液涂片AF染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。目前國(guó)際上公認(rèn)的TBM的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要參照2010年由MARAIS 等［4］制定的復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)。

腦脊液抗酸（Acid-Fast，AF）染色，也稱(chēng)為Ziehl-Neelsen 染色，是目前臨床廣泛應(yīng)用的結(jié)核分枝桿菌診斷方法，可作為明確診斷結(jié)核的第一步。不同于革蘭氏陽(yáng)性桿菌和格革蘭氏陰性細(xì)菌，結(jié)核分枝桿菌具有獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)革蘭氏染色具有抵抗力，細(xì)胞壁能夠耐酸性酒精脫色，這是結(jié)核分枝桿菌抗酸性的來(lái)源。腦脊液涂片AF 染色檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性可明確診斷為T(mén)BM。但AF 染色方法要求每毫升腦脊液中結(jié)核分枝桿菌載量在5 000～10 000 以上，但結(jié)核分枝桿菌作為一種胞內(nèi)菌，在腦脊液中的病原體載量很低，導(dǎo)致腦脊液涂片AF 染色診斷TBM 的陽(yáng)性率只有10%～20%［3］。目前有多種改良染色方法在一定程度上提高了腦脊液涂片AF 染色診斷TBM 的靈敏度，但其檢出率仍然達(dá)不到臨床應(yīng)用要求。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是目前臨床診斷TBM 的金標(biāo)準(zhǔn)，診斷結(jié)核分枝桿菌的靈敏度較高（50%～60%）。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)主要有液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法兩種。但兩種培養(yǎng)方法所需時(shí)間均較長(zhǎng)，往往會(huì)延誤患者的病情診治時(shí)間，在TBM 早期診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值有限［5］。

1.2 結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法 即擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌的遺傳物質(zhì)，目前臨床常用TBM的分子生物學(xué)檢測(cè)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（Xpert MTB/RIF）技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification LAMP）等，mNGS檢測(cè)也屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中的一種。

PCR 是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，可提取和擴(kuò)增臨床標(biāo)本中的遺傳物質(zhì)。PCR診斷結(jié)核分枝桿菌的靈敏度（55.8%～87.6%）［6］及特異度（94%～100%）［7］均較高，且診斷所需時(shí)間短，目前已用于TBM 的診斷中。但腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的載量低限制了PCR的廣泛應(yīng)用。

Xpert MTB/RIF 技術(shù)和LAMP 技術(shù)都是新型核酸擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid amplification tests ，NAATs），檢測(cè)所需時(shí)間較短，目前已逐漸應(yīng)用于TBM 的早期診斷中。2013 年世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦將Xpert MTB/RIF 技術(shù)作為T(mén)BM 診斷的首選初始檢測(cè)方法，但Xpert MTB/RIF 技術(shù)對(duì)腦脊液樣本的要求高，包括腦脊液的樣本量以及細(xì)菌負(fù)載量等，都在一定程度上限制了其在臨床工作中的應(yīng)用。

1.3 結(jié)核分枝桿菌免疫學(xué)檢測(cè)方法 結(jié)核分枝桿菌可致患者體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗原，刺激T 淋巴細(xì)胞分泌γ 干擾素。γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon-gam‐ma release assays，IGRAs）可通過(guò)檢測(cè)γ 干擾素，判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染［8］。腺苷脫氨酶（Ad‐enosine deaminase，ADA）檢測(cè)和阿拉伯糖甘露糖脂（Lipoarabinomannan，LAM）檢測(cè)均是基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法，但目前臨床應(yīng)用較少，其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的診斷效能也較差。

TBM 明確診斷困難的原因主要有：①TBM 的臨床癥狀以及腦脊液檢查、影像學(xué)檢查等各種輔助檢查結(jié)果，都與病毒性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎（Cryp‐tococcus Neoformans Meningitis，CNM）等中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病相似［9］。甚至，患者可出現(xiàn)TBM、隱球菌性腦膜炎的雙重感染，增加確診難度［10］。②腦脊液標(biāo)本需通過(guò)腰椎穿刺有創(chuàng)操作獲取，導(dǎo)致部分患者明確診斷困難。同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)需要高濃度的氧氣，且生長(zhǎng)速度特別慢，而腦脊液是一種相對(duì)無(wú)菌的體液，導(dǎo)致腦脊液中結(jié)核菌的載量非常低［11］。③多數(shù)TBM 由結(jié)核分枝桿菌引起，但部分病例為牛分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌病原體致?。?2］。④TBM 的臨床癥狀不典型，部分患者在未明確診斷的時(shí)候已進(jìn)行試驗(yàn)性治療［13］。

2 mNGS在TBM診斷中的應(yīng)用

2.1 mNGS在TBM診斷中的優(yōu)勢(shì)及局限性

2.1.1 mNGS在TBM診斷中的優(yōu)勢(shì)

2.1.1.1 無(wú)偏倚檢測(cè) mNGS 可對(duì)目前所有已知的病原微生物（病毒、細(xì)菌、真菌及寄生蟲(chóng)）總DNA或RNA 進(jìn)行無(wú)偏倚和全覆蓋的檢測(cè)［14］，可用于臨床表現(xiàn)不典型的TBM、混合感染以及臨床中難以確診但高度懷疑神經(jīng)系統(tǒng)感染的病例中。TBM 有時(shí)會(huì)同時(shí)合并其他病原體感染，而mNGS 的無(wú)偏倚檢測(cè)的特性能夠在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的同時(shí)，檢出病毒、隱球菌、其他不常見(jiàn)細(xì)菌等病原體。一項(xiàng)關(guān)于mNGS 在AIDS 患者疑診中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的研究［15］中發(fā)現(xiàn)，在一例檢測(cè)前初步診斷為T(mén)BM 的患者中，最終發(fā)現(xiàn)合并曲霉菌感染。此外，除結(jié)核分枝桿菌外，牛結(jié)核分支桿菌等其他結(jié)核分枝桿菌屬病原體也可引起TBM［16］。國(guó)內(nèi)也有相關(guān)的報(bào)道，張芙蓉等［17］采用mNGS 診斷了1 例合并血管炎的TBM。錢(qián)喬喬等［18］用mNGS診斷一般檢測(cè)手段難以確診的兒童TBM 5例。

2.1.1.2 診斷靈敏度高 腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的負(fù)荷量通常較低，限制了其他檢測(cè)方法的應(yīng)用，而mNGS的高靈敏度是顯著區(qū)別于其他檢測(cè)手段的優(yōu)勢(shì)。一項(xiàng)關(guān)于mNGS在TBM診斷中的可行性分析研究［19］中，共納入23例（12例明確診斷，11例臨床診斷）患者，最終mNGS 檢測(cè)結(jié)果為18 例結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，mNGS 診斷TBM 的靈敏度78.26%、特異度100%，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法結(jié)合后檢出率提高到95.65%。一項(xiàng)前瞻性多中心研究［20］對(duì)213 例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中擬診為T(mén)BM 的44 例（6 例明確，38 例可能）患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)腦脊液Xpert MTB/RIF 陽(yáng)性率為16.13%（5/31），mNGS 陽(yáng)性率為27.27%（12/44）；mNGS和Xpert MTB/RIF聯(lián)合陽(yáng)性率為29.55%（13/44），且所有腦脊液樣本的抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，但是Xpert MTB/RIF技術(shù)和mNGS檢測(cè)的一致性有待進(jìn)一步研究。最新一項(xiàng)前瞻性研究［21］顯示，mNGS 診斷疑似TBM的敏感度58.8%（20/34）、特異度為100%（16/16），而確診患者中，mNGS 診斷的敏感度為63.6%（14/22），傳統(tǒng)檢測(cè)方法聯(lián)合mNGS診斷TBM的敏感度高達(dá)82.4%（28/34）。一項(xiàng)研究［22］共納入肺外標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌涂片染色陰性的疑似患者208 例，結(jié)果mNGS 檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性45 例；在各種肺外結(jié)核中mNGS 檢測(cè)TBM 的陽(yáng)性率最高；AUC 值是各種檢測(cè)方法中最高（0.79）；其中33 例患者mNGS 檢測(cè)陽(yáng)性而其他檢測(cè)（包括細(xì)菌培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF 技術(shù)）檢測(cè)陰性?？顾崛旧珯z測(cè)陽(yáng)性說(shuō)明結(jié)合分枝桿菌的病原體載量高，在抗酸染色涂片陰性的患者檢出結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，說(shuō)明mNGS 診斷結(jié)核分枝桿菌靈敏度較高。總之，mNGS 對(duì)TBM 的診斷價(jià)值較高，且mNGS 聯(lián)合其他檢測(cè)方法能夠提高其診斷效能。

2.1.1.3 檢測(cè)周期短 mNGS檢測(cè)周期為2～3天，與細(xì)菌培養(yǎng)相比，明顯縮短了臨床診斷時(shí)間。一項(xiàng)研究［26］中對(duì)結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF 以及mNGS 技術(shù)所需要的時(shí)間進(jìn)行了對(duì)比，Xpert MTB/RIF檢測(cè)所需時(shí)間平均為2 h，而結(jié)核桿菌培養(yǎng)需要時(shí)間為2～3周，培養(yǎng)結(jié)果為陰性的甚至需要更長(zhǎng)的時(shí)間，一般在2個(gè)月左右。

2.1.1.4 檢測(cè)結(jié)果不受抗結(jié)核藥物等的影響 傳統(tǒng)檢測(cè)手段多依賴(lài)于標(biāo)本中活菌的存在，所以檢出率在使用抗結(jié)核藥物的情況下有一定程度的降低。YAN 等［23］共納入51 例HIV 陰性患者，其中45 例被診斷為T(mén)BM（38 例明確、5 例很可能及2 例可能），6例為非TBM，以最終診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，腦脊液mNGS檢查對(duì)TBM 診斷敏感度、特異度分別為84.44%（38/45，69.94%～93.01%）、100%（6/6，51.68%～100%），mNGS的診斷敏感度（84.4%）明顯高于抗酸染色檢查、細(xì)菌培養(yǎng)（22.2%，P= 0.000）、PCR（24.4%，P= 0.000）和Xpert MTB/RIF 技術(shù)（40%，P= 0.000）。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)前是否使用抗結(jié)核藥物對(duì)mNGS的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響。其將患者分為檢測(cè)前進(jìn)行過(guò)抗結(jié)核藥物治療組和未進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療組，結(jié)果顯示兩組mNGS 陽(yáng)性結(jié)果分別為51 例（52.94%）與129 例（62.79%），兩組檢出率之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并與其他檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的抗結(jié)核藥物治療組的陽(yáng)性結(jié)果有0 例，未進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療的有25 例（19.51%）；進(jìn)行Xpert MTB/RIF 的抗結(jié)核藥物組的陽(yáng)性結(jié)果有12 例（23.53%），未進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療組的有54例（41.86%）。

臨床目前對(duì)mNGS對(duì)TBM的診斷效能尚存在一定爭(zhēng)議?？赡茉?yàn)椋孩偌{入標(biāo)準(zhǔn)不同，有些研究以疑診TBM 為標(biāo)準(zhǔn)，有些研究以其他檢測(cè)方法確定診斷的TBM 為標(biāo)準(zhǔn)；②研究對(duì)象不同，有些研究選取HIV 陰性的病例，有些是將AIDS 病人涵蓋其中的，而AIDS 患者作為T(mén)BM 的高發(fā)人群，納入范圍廣的在一定程度上降低了檢出率；有些研究是在綜合醫(yī)院選取研究對(duì)象，有些則是從結(jié)核病專(zhuān)科醫(yī)院進(jìn)行；③最終診斷標(biāo)準(zhǔn)不同，多數(shù)研究的診斷標(biāo)準(zhǔn)為CRS（composite reference standard），但也有例外，比如有些研究并未將抗結(jié)核治療效果的評(píng)價(jià)作為診斷的參考，此外，大多數(shù)研究對(duì)于mNGS的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證（PCR），直接將mNGS 檢出結(jié)核分支桿菌的病例認(rèn)為是TBM；④研究樣本量較小等。

2.1.2 mNGS 在TBM 診斷中的局限性 ①背景菌或污染問(wèn)題：污染微生物序列是腦脊液檢測(cè)的主要問(wèn)題。由于mNGS 技術(shù)高度的靈敏度，很容易檢出無(wú)關(guān)的來(lái)自外界環(huán)境或者試劑的微生物，有時(shí)甚至難以與責(zé)任病原體區(qū)分；同時(shí)，宿主來(lái)源的遺傳物質(zhì)或人體正常寄生菌也會(huì)在測(cè)序過(guò)程中被檢出，導(dǎo)致真正的病原體序列所占比例往往很小。在非常低生物量的樣本（如CSF）中，測(cè)序試劑的污染物就會(huì)發(fā)生過(guò)度擴(kuò)增。當(dāng)CSF 樣本中幾乎不存在生物量時(shí)，PCR擴(kuò)增步驟中使用的引物會(huì)一次又一次地放大環(huán)境污染物的最小數(shù)量，從而增加最終數(shù)據(jù)集中污染物的比例代表性。mNGS 檢出率最高的污染菌是Propionibacterium acnes，Acidovorax KKS102 和擬短桿菌（Brevundimonas subvibri-oides）［23］。②病原學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)不完善：mNGS 技術(shù)雖然可以無(wú)差別地將樣本中的所有遺傳物質(zhì)檢測(cè)出來(lái)，但是最終結(jié)果是將特異性DNA 或RNA 片段在病原學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比而得出的，只有所選數(shù)據(jù)庫(kù)中包含已知生物的同源性序列才能被識(shí)別。所以，在mNGS 檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，并不能完全排除是某一新病原體導(dǎo)致的感染的可能性。③測(cè)序成本高：測(cè)序所需實(shí)驗(yàn)室條件要求高，一般的實(shí)驗(yàn)室不具備操作條件，高通量測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生非常大的數(shù)據(jù)集，例如，基于Illumina的mNGS 旨在為每個(gè)樣本生成5～2 000 萬(wàn)個(gè)100～150 nt 核苷酸序列，處理這些海量數(shù)據(jù)需要的很強(qiáng)的技術(shù)支持。④操作要求嚴(yán)格：包括標(biāo)本的獲取、運(yùn)輸、保存等各個(gè)步驟，稍有不慎，都將對(duì)測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生影響，例如若在進(jìn)行檢測(cè)之前CSF 樣本就已經(jīng)在室溫下儲(chǔ)存或冷藏多天，病原體的核酸（尤其是RNA）可能已經(jīng)降解，mNGS 可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。⑤檢測(cè)結(jié)果解讀程度不一：mNGS 無(wú)法判斷所檢出的病原體是否正在生長(zhǎng)或復(fù)制，如有時(shí)可以在腦脊液中檢出EB 病毒，但EB 病毒可能只是潛伏在腦脊液中的病原體而非此次發(fā)病的責(zé)任病原體，此時(shí)對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的解讀需要慎重。

2.2 如何提高mNGS 在TBM 中的診斷效能 為提高結(jié)合分枝桿菌的檢出率，mNGS 的臨床操作中應(yīng)注意：①對(duì)結(jié)果的判讀上，由于結(jié)核分枝桿菌在腦脊液中載量很小，且腦脊液相對(duì)無(wú)菌，結(jié)核菌對(duì)生長(zhǎng)條件要求較高，很難作為一種污染菌存在，所以在結(jié)果為陽(yáng)性的時(shí)候，診斷為T(mén)BM 的可靠性還是很高的，可以在一定程度上降低特異序列數(shù)的界線范圍，或許是提高檢出率的一種方法。②增加腦脊液標(biāo)本量，可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定的影響［24］。③盡量以首次腰椎穿刺獲取的腦脊液作為檢測(cè)對(duì)象，雖然其中的機(jī)制尚未闡明，但已有研究表明第一次腰椎穿刺獲得的腦脊液陽(yáng)性率最高［23］。④患有TBM 時(shí)，腦脊液中白細(xì)胞的升高，導(dǎo)致宿主白細(xì)胞DNA 成為主要的背景遺傳物質(zhì)的來(lái)源，在檢測(cè)過(guò)程中，可以通過(guò)一系列方式減少背景DNA 的存在，以提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率［12］。⑤重復(fù)多次檢測(cè)，若條件允許，必要時(shí)可對(duì)腦脊液行多次mNGS 檢測(cè)，以提高病原體的檢出率。⑥提高測(cè)序深度（即單個(gè)樣本獲得的單個(gè)序列數(shù)量），由于腦脊液樣本具有較低的病原體負(fù)載量和（或）大量的人類(lèi)序列（如腦脊液中增高的白細(xì)胞）或環(huán)境背景污染，增加測(cè)序深度是提高靈敏度的潛在解決方案。

綜上所述，TBM 的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法有腦脊液涂片AF染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，分子生物學(xué)檢測(cè)方法有PCR、Xpert MTB/RIF 技術(shù)和LAMP 技術(shù)等，免疫學(xué)檢測(cè)方法有IGRAs、ADA、LAM 檢測(cè)等，其用于TBM的早期診斷均有一定不足。mNGS用于TBM 診斷的靈敏度、特異度均較高，且具有無(wú)偏倚檢測(cè)、可檢測(cè)混合感染、靈敏度高、檢測(cè)周期短、檢測(cè)結(jié)果不受抗結(jié)核藥物影響等優(yōu)點(diǎn)。