崔璐，劉宇宏

延安大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，陜西延安 716000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常見的自身免疫性疾病之一，患病率和致殘率較高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。RA 發(fā)生發(fā)展的具體分子作用機(jī)制尚不明確。遺傳因素、環(huán)境因素以及多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、自身抗原、腸道菌群等可能參與了RA 的發(fā)?。?］，其中免疫因素是近年RA 發(fā)病的研究熱點(diǎn)。T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NK）等多種免疫細(xì)胞在RA 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。共信號(hào)分子分為共刺激分子和共抑制分子，參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的相互作用。CD160 由Bensussan 實(shí)驗(yàn)室最先發(fā)現(xiàn)于NK 細(xì)胞表面，是在NK細(xì)胞表面識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體（major histo‐compatibility complex，MHC）Ⅰ類分子的調(diào)節(jié)性受體［4］。CD160 通常被認(rèn)為是一種共抑制分子，在CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞表面表達(dá)多，少量表達(dá)于CD4+T 細(xì)胞表面。最近一項(xiàng)生物信息學(xué)研究［5］表明，CD160 是自身免疫性疾病中異常表達(dá)最顯著的共信號(hào)分子。研究［6］發(fā)現(xiàn)CD160 的rs744877 位點(diǎn)與RA 易感性關(guān)系密切，有可能在RA 發(fā)病中起到一定作用。目前國內(nèi)外關(guān)于CD160 和RA 發(fā)病的相關(guān)性研究較少。為此，我們觀察了RA 患者外周血CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞CD160 的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與RA 患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2019 年11 月—2021 年3 月間于延安大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院部的RA 患者80例（RA組）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythema‐tosus，SLE）患者60 例（SLE 組）。RA 患者符合歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟（European league against rheumatism，EULAR）或2010 年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（American col‐lege of rheumatology，ACR）提出的分類標(biāo)準(zhǔn)［7］，SLE組患者符合ACR1997 年修訂的SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)。RA和SLE 患者排除心、肝、腎功能不全；體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）≥28 kg/m2；合并其他急、慢性疾病者。健康組選擇年齡性別匹配的健康志愿者60 例。三組均簽署知情同意書并通過本院倫理委員會(huì)的認(rèn)可。RA 組男21 例、女59 例，年齡（58.30±12.83）歲，BMI（21.92 ± 3.64）kg/m2，病程（9.37 ±9.08）年，吸煙史14 例，紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）為（53.90±31.11）mm/h，C-反應(yīng)蛋白（c-reactive protein，CRP）為（36.64 ±29.32）mg/L，白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）為16.84mL，類風(fēng)濕因子（rheumatoid factors，RF）為（162.33 ± 57.31）U/mL ，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，CCP）為（246.00 ± 32.18）U/mL，28 個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)評(píng)分（disease activity score，DAS28）為1.01 分；SLE 組男14 例、女46 例，年齡（55.67 ± 11.68）歲，BMI（22.73 ± 3.05）kg/m2，病程（8.88 ± 5.02）年，吸煙史8 例，ESR（39.53 ± 23.76）mm/h，CRP（129.35 ±13.22）mg/L，IL-6（43.59 ± 12.38）pg/mL；健康組男20 例、女40 例，年齡（54.73 ± 14.35）歲，BMI（21.85 ± 3.45）kg/m2，吸煙史6 例。三組年齡、性別、吸煙史、BMI 等一般資料具有可比性（P均>0.05），RA 組與SLE 組患者病程、ESR、CRP、IL-6 間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。

1.2 三組外周血CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞CD160 檢測(cè) RA 組、SLE 組住院期間（健康志愿者于同期）禁飲食8 h 后取晨起空腹外周靜脈血3 mL，室溫下EDTA 抗凝，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算外周血CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞CD160陽性表達(dá)率。每位研究對(duì)象均取2 支流式管，分別標(biāo)注管1、管2，管1 加入CD3PerCP、CD4FITC、CD8PE、CD160APC，管2 加入CD3FITC、CD（16 + 56）PE、CD45PerCP、CD160APC，各5 μL；兩管分別加入100 μL EDTA 抗凝血，將所有流式管置于振蕩器上震蕩混勻后室溫下避光孵育15 min；將各流式管取出，均加入1×FACS 溶血素2 mL，低速渦流混勻，室溫下避光孵育10 min，然后置于離心機(jī)內(nèi)，1 500 r/min離心5 min；棄上清，加入PBS 液1 mL，1 500 r/min 離心5 min；棄上清，加入PBS 液500 μL，使用BD FACSCantoTMⅡ機(jī)器上機(jī)觀察外周血CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞CD160，測(cè)算外周血CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率。操作重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)全部進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示；多組間比較采用ANOVA單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Pearson 相關(guān)分析法分析CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞CD160表達(dá)水平與RA患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞上CD160 陽性表達(dá)率比較 RA 組CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率分別為4.50% ± 3.90%、3.28% ± 2.32%、6.79% ± 3.71%，SLE 組CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率分別為5.25% ± 3.62%、5.00% ± 3.32%、5.68% ± 3.64%，健康組CD4+T、CD8+T、NK 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率分別為5.10% ±2.32%、6.19% ± 2.51%、3.34% ± 1.43%。與健康組比較，RA 組CD8+T 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率降低、NK 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率升高（t分別為-2.354、2.966；P均<0.05）。

2.2 CD8+T、NK細(xì)胞CD160陽性表達(dá)與RA患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 CD8+T 細(xì)胞上CD160 陽性表達(dá)與RA 患者性別、年齡、病程、吸煙、BMI、血清IL-6水平、RF 無關(guān)（r分別為0.157、-0.211、-0.100、0.053、0.798、-0.860、-0.006；P均>0.05），與DAS28 評(píng)分、血清CCP 水平、ESR、血清CRP 水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.21、-0.28、-0.07、-0.07；P均<0.05）。NK 細(xì)胞上CD160 陽性表達(dá)與RA 患者性別、年齡、病程、吸煙、BMI、RF無關(guān)（r分別為-0.092、0.054、0.087、-0.060、0.918、-0.110；P均>0.05），與DAS28評(píng)分、血清CCP水平、ESR、血清CRP及IL-6水平呈正相關(guān)（r分別為0.130、0.346、0.331、0.140、0.180；P均<0.05）。

2.3 CD8+T、NK細(xì)胞上CD160陽性表達(dá)與RA患者疾病活動(dòng)度的相關(guān)性 RA 患者疾病低度活動(dòng)度20例，中、高度活動(dòng)度各30 例，CD8+T 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率分別為7.82% ± 6.70%、5.22% ± 2.81%、2.67%±2.26%，NK 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率分別為1.84% ± 2.17%、4.67% ± 1.77%、9.82% ± 6.70%，隨疾病活動(dòng)度升高，RA 患者CD8+T 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率降低，NK 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)率升高（P均<0.05）。

3 討論

T 細(xì)胞控制的免疫反應(yīng)在RA 發(fā)病中發(fā)揮重要作用［8］，而CD160 參與的CD160/HVEM/LIGHT/BT‐LA 通路是調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活化的重要信號(hào)通路［9］，今后可能成為RA 新的治療靶點(diǎn)［10］。因此進(jìn)一步探討CD160 的表達(dá)與RA 的關(guān)系有助于為RA 發(fā)病機(jī)制和治療提供新的科學(xué)依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康組比較，RA 患者外周血CD4+T 細(xì)胞百分比、CD4+T/CD8+T 升高，CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞百分比無顯著差異，說明RA 患者有T細(xì)胞亞群的改變，RA 組CD160 呈異常表達(dá)，其中CD8+T細(xì)胞CD160的表達(dá)降低，NK細(xì)胞CD160的表達(dá)升高，說明CD160 的異常表達(dá)促進(jìn)T 細(xì)胞的活化與增殖，與NK 細(xì)胞的百分比無明顯關(guān)系。而RA 患者CD4+T 細(xì)胞上CD160 的表達(dá)與健康組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與CD160 細(xì)胞分布和樣本個(gè)體差異有關(guān)。

RA是慢性炎性疾病，外周血ESR、IL-6等炎性生物標(biāo)志物是反映RA 病情的指標(biāo)之一，本研究中CD8+T細(xì)胞CD160陽性表達(dá)與RA患者ESR、CRP、抗CCP 抗體呈負(fù)相關(guān)、NK 細(xì)胞CD160 陽性表達(dá)與RA患者ESR、CRP、IL-6、抗CCP抗體呈正相關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，DAS28 評(píng)分高的RA 患者CD8+T 細(xì)胞CD160表達(dá)水平明顯低于DAS28評(píng)分低的RA患者，DAS28評(píng)分高的RA患者NK細(xì)胞CD160表達(dá)水平明顯高于DAS28評(píng)分低的RA患者，說明CD160表達(dá)異常程度越高的RA患者有更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

CD160 參與的CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路的相關(guān)分子在自身免疫性疾病中經(jīng)常存在異常表達(dá)［11］。共刺激分子在免疫性疾病中的表達(dá)不是必須上調(diào)，共抑制分子在免疫性疾病中的表達(dá)不是必須下調(diào)，沒有一個(gè)確切定論。本研究中，RA 患者外周血CD160 呈異常表達(dá)，CD160 在CD8+T 細(xì)胞上表達(dá)降低，從而促進(jìn)了T 細(xì)胞的異?；罨?。有研究［12］顯示，CD160-HVEM 在調(diào)節(jié)CD4+T 細(xì)胞時(shí)發(fā)揮抑制作用，同時(shí)向NK細(xì)胞傳遞共刺激信號(hào)。還有CDl60與MHC-Ⅰ類配體HLA-C結(jié)合能力弱，但結(jié)合后能增強(qiáng)誘導(dǎo)NK 細(xì)胞殺傷活性，并誘導(dǎo)一些細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8等的分泌［13］。CD160能夠與HVEM結(jié)合，以增強(qiáng)NK細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞溶解功能［14］。以上研究結(jié)果均說明CD160可能對(duì)CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞的功能有直接或者間接的調(diào)控作用。但以往類似研究均只單獨(dú)研究T細(xì)胞或NK細(xì)胞，我們同時(shí)納入T細(xì)胞和NK細(xì)胞，將更好說明RA發(fā)病與CD160表達(dá)的相關(guān)性及其意義。

CD160的異常表達(dá)可能通過多種潛在病理生理機(jī)制及相關(guān)通路參與RA 的發(fā)生與發(fā)展。一是CD160 參與的CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路。本研究發(fā)現(xiàn)CD160 異常表達(dá)與RA 發(fā)病關(guān)系密切，共信號(hào)分子的異常表達(dá)可以引起T細(xì)胞過度激活并引發(fā)自身免疫性疾病，為CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路在自身免疫性疾病中的重要作用提供了新的科學(xué)依據(jù)。SHUI 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，CD160 是一種新發(fā)現(xiàn)的HVEM 配體，先前鑒定的HVEM 配體包括BTLA 和LIGHT，HVEM 是一種雙向開關(guān)，該系統(tǒng)必須被適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)以平衡免疫反應(yīng)的結(jié)果，其結(jié)果取決于配體的參與，HVEM 與LIGHT 結(jié)合可促進(jìn)T 細(xì)胞的活化，但HVEM 的功能主要表現(xiàn)為BTLA 和CD160 介導(dǎo)的負(fù)調(diào)控作用，CD160 參與的CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路起刺激/抑制T 細(xì)胞活化的作用。T 細(xì)胞在RA 發(fā)病中遷移到病變關(guān)節(jié)，識(shí)別特定的抗原肽后，釋放HVEM-α等數(shù)種炎癥因子，促進(jìn)滑膜細(xì)胞異常增殖和血管翳的形成，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的破壞。據(jù)我們所知，HVEM 還可以轉(zhuǎn)化為顯性共刺激分子，產(chǎn)生增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用［16］。因此，CD160 參與CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路可能通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的活化導(dǎo)致T 細(xì)胞過度激活引起新的免疫反應(yīng)進(jìn)而參與了RA 的發(fā)病，但具體的分子機(jī)制目前尚未明確。二是CD160與免疫細(xì)胞功能紊亂。研究［17］證實(shí)，NK細(xì)胞通過固有免疫在RA 的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子以及細(xì)胞間接接觸等途徑，引起NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等增殖活化，參與RA滑膜增殖和骨破壞的發(fā)生與發(fā)展。CD160 主要在T 細(xì)胞亞群、NK 細(xì)胞中表達(dá)，而在B淋巴細(xì)胞中基本不表達(dá)，然而在RA 的發(fā)病過程中，T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞都參與其中，我們知道任何一種免疫細(xì)胞的功能紊亂會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致其他免疫細(xì)胞功能的異常，我們的結(jié)果顯示RA 患者NK 細(xì)胞上CD160 的表達(dá)增加，因此CD160 的升高可能通過促進(jìn)NK 細(xì)胞局部相互作用、分泌眾多細(xì)胞因子、激活或破壞其他細(xì)胞等方式直接導(dǎo)致T細(xì)胞或NK細(xì)胞功能紊亂，從而使B細(xì)胞功能異常而發(fā)生RA。

綜上所述，CD160 在RA 患者外周血CD8+T、NK細(xì)胞上存在異常表達(dá)，與RA 的疾病活動(dòng)度相關(guān)。此外，RA 患者中的CD160 表達(dá)水平與DAS28 評(píng)分、抗CCP 抗體、炎性生物標(biāo)志物相關(guān)，未來可繼續(xù)探索CD160 在RA 發(fā)病機(jī)制中是如何調(diào)控免疫細(xì)胞功能，為RA的臨床治療提供新思路。