裴超，陳穎，尚勝男，李旭東，楊雪冰

（1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；（2.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 鄭州 450008）

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，水產(chǎn)動(dòng)物疾病的發(fā)生也在增加，尤其是細(xì)菌性疾病造成的水產(chǎn)動(dòng)物損失約占全部病害損失的50%以上[1]。氣單胞菌是一類革蘭氏陰性直桿菌，廣泛存在于水體、土壤等自然環(huán)境中[2]，是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病的常見病原，包括嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilae）、維氏氣單胞菌（A.veronii）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）和殺鮭氣單胞菌（A.salmonicida）等，能引起魚類敗血癥、腸炎、打印病、鱉類穿孔病和腐皮病等嚴(yán)重疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前主要還是靠抗生素和人工合成的抗菌藥物治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病。但是長(zhǎng)期應(yīng)用某種特定的抗菌藥物，極易引起病原菌對(duì)該種藥物的耐藥性，因此實(shí)時(shí)檢測(cè)養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)病原菌耐藥性的變化十分必要，有利于養(yǎng)殖者有針對(duì)性地選擇病原菌敏感藥物，達(dá)到理想的治療效果[4-9]。河南省沿黃河地區(qū)包括洛陽、鄭州、新鄉(xiāng)、開封等地，是河南省池塘養(yǎng)殖的主要區(qū)域，主要養(yǎng)殖鯉（Cyrinus carpio）和斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）。本研究通過檢測(cè)河南省沿黃河地區(qū)養(yǎng)殖魚類體內(nèi)氣單胞菌耐藥性的最新情況，并結(jié)合近幾年的連續(xù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析細(xì)菌耐藥性的變化，可為該養(yǎng)殖區(qū)的合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥物

采用南京菲恩醫(yī)療科技公司生產(chǎn)的藥敏分析試劑板測(cè)試分離到的菌株的藥物敏感性。供試藥物為我國(guó)目前允許使用的主要水產(chǎn)抗菌類藥物，包括恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲惡唑+甲氧芐啶（復(fù)方新諾明），藥物濃度梯度如表1 所示。

1.2 菌株分離鑒定

2020 年4—10 月分別從河南省鄭州市中牟縣、滎陽市王村、洛陽市孟津縣白鶴鎮(zhèn)、洛陽市孟津縣會(huì)盟鎮(zhèn)、新鄉(xiāng)市延津縣和開封市龍亭區(qū)、開封市祥符區(qū)等養(yǎng)殖池塘采集黃河鯉，均重（1.15±0.53）kg，共48 尾），和斑點(diǎn)叉尾均重（0.83±0.46）kg，共71尾。體表用75%酒精消毒后，用灼燒過的接種環(huán)從肝臟和腎臟處穿刺，在LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落至LB 培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)后，繼續(xù)用劃線培養(yǎng)法純化3 次。純化后的菌體用細(xì)菌基因組提取試劑盒（TakaRa）提取DNA，采用16S rDNA 序列鑒定菌株種類。DNA 擴(kuò)增正向引物為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物5’-GGTTACC TTGTTACGACTT-3’。PCR 反應(yīng)條件為：95℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1.5 min，33 個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳確定片段大小符合預(yù)期后，送上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索，通過序列比對(duì)結(jié)果確定菌株種類。

1.3 抗菌藥物最小抑菌濃度的測(cè)定

采用藥敏分析試劑板（南京菲恩醫(yī)療科技公司）測(cè)試藥敏，試劑板中藥物濃度設(shè)置如表1。挑取純化后的單個(gè)菌落于5 mL 生理鹽水中，制成OD625=0.5 的菌懸液，吸取200 μL 菌懸液加入無菌生理鹽水中，至終體積為20 mL?；靹蚝竺總€(gè)微孔加200 μL，陰性對(duì)照孔加入200 μL 無菌生理鹽水。放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～28 h 后讀取結(jié)果。通過肉眼判定，試劑板孔底澄明孔對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度即為藥物的最小抑菌濃度MIC。能夠抑制50%的菌株生長(zhǎng)所需要的最小藥物濃度即為該藥物的MIC50；能夠抑制90%的菌株生長(zhǎng)所需要的最小藥物濃度即為該藥物的MIC90。每個(gè)菌株對(duì)各藥物敏感性重復(fù)測(cè)試3 次，取一致性最高的結(jié)果為最終結(jié)果，若3 次測(cè)得的結(jié)果均不一致，則重復(fù)測(cè)3 次，直至取得一致結(jié)果。藥物敏感性的測(cè)定以及耐藥率的計(jì)算依據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[10]。數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 軟件進(jìn)行分析，每種藥物從2016—2020 年的5 次測(cè)定作為一組數(shù)據(jù)，不同藥物組之間進(jìn)行比較。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和方差分析（Analysis of Variance,ANOVA）后，采用最小顯著性差異法（Least-Significant Difference,LSD）比較不同藥物組間MIC50、MIC90和耐藥率的差異顯著性。

表1 所使用的藥物及藥物濃度梯度設(shè)置Tab.1 The drugs and concentration gradient in the test

2 結(jié)果與分析

2.1 氣單胞菌的分離鑒定

表2 氣單胞菌分離株信息Tab.2 The information on the isolated Aeromonas strains

2.2 氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的感受性

針對(duì)分離到的34 株氣單胞菌，測(cè)定7 種水產(chǎn)常用藥物對(duì)每株菌的MIC，然后根據(jù)各菌株的MIC分布，得到每種藥物能夠抑制半數(shù)菌株生長(zhǎng)的最小抑菌濃度MIC50，和抑制90%菌株數(shù)的最小抑菌濃度MIC90。恩諾沙星和鹽酸多西環(huán)素MIC50數(shù)值最小，均為0.78 mg/L，依次為氟苯尼考（1.56 mg/L）、硫酸新霉素（3.13 mg/L）、甲砜霉素（6.25 mg/L）；MIC50數(shù)值最大的藥物為磺胺間甲氧嘧啶鈉（512 mg/L）和復(fù)方新諾明（256 mg/L）。MIC90數(shù)值最小的藥物為恩諾沙星、硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素，均為12.5 mg/L，其次是甲砜霉素和氟苯尼考，為200 mg/L，最大的是磺胺間甲氧嘧啶鈉和復(fù)方新諾明，為512 mg/L。氣單胞菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥率最高，為58.8%；對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考的耐藥率也較高，分別為32.4%和29.4%；對(duì)復(fù)方新諾明和恩諾沙星的耐藥率為23.5%和20.6%；對(duì)鹽酸多西環(huán)素和硫酸新霉素最為敏感，耐藥率分別為8.8%和11.8%。氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物感受性如表3 所示。

表3 氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的感受性分布（n=34）Tab.3 The sensitivity of Aeromonas strains to antibacterial drugs

2.3 氣單胞菌對(duì)抗菌藥物感受性的年度變化

在2016—2020 年間，每年都對(duì)沿黃河養(yǎng)殖區(qū)的氣單胞菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)各抗菌藥物對(duì)氣單胞菌的MIC50和MIC90進(jìn)行測(cè)定，按年份的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4，年度變化示意圖見圖1 和圖2。恩諾沙星和甲砜霉素對(duì)氣單胞菌的MIC50較低（分別為9.0和11.9）且呈現(xiàn)略微下降趨勢(shì),恩諾沙星MIC90相對(duì)穩(wěn)定，維持在25 mg/L 左右；而甲砜霉素MIC90在2017 和2018 年從200 mg/L 下降到100 mg/L 后，在2019 和2020 年又回升到了200 mg/L；硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素的MIC50和MIC90在2018 年出現(xiàn)一個(gè)高峰值，均為100 mg/L；氟苯尼考的MIC50五年來相對(duì)穩(wěn)定，保持在1.56 mg/L 到3.13 mg/L 之間，但是MIC90處于上升狀態(tài)，增幅較大，從6.25 mg/L增加到200 mg/L；磺胺間甲氧嘧啶和復(fù)方新諾明的MIC50和MIC90一直處于較高狀態(tài)，高于128 mg/L。各藥物組的MIC50無顯著差異性（P＞0.05），而甲砜霉素和氟苯尼考MIC90明顯高于恩諾沙星、硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素（P＜0.05）。甲砜霉素和氟苯尼考之間，恩諾沙星、硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素之間無顯著差異性（P＞0.05）。

圖1 2016—2020 年抗菌藥物對(duì)氣單胞菌的MIC50Fig.1 The MIC50 of antibacterial drugs to Aeromonas from 2016 to 2020

圖2 2016—2020 年氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的MIC90Fig.2 The MIC90 of antibacterial drugs to Aeromonas from 2016 to 2020

表4 抗菌藥物對(duì)氣單胞菌的MIC 和耐藥率年度變化Tab.4 The annual changing of antibacterial drugs MIC and resistance rate to Aeromonas

耐藥率年度變化顯示，在2016—2018 年，氣單胞菌對(duì)硫酸新霉素、磺胺間甲氧嘧啶和復(fù)方新諾明的耐藥率極高，在80%～100%之間，顯著高于其他四種藥物（P＜0.05），2019 年和2020 年氣單胞菌對(duì)這三種藥物的耐藥率有所下降，但對(duì)磺胺間甲氧嘧啶仍有約60%的耐藥性；氣單胞菌對(duì)恩諾沙星和鹽酸多西環(huán)素的耐藥率在2018 年有明顯升高，達(dá)到53.8%，之后呈下降趨勢(shì)；氣單胞菌對(duì)甲砜霉素和氟苯尼考的耐藥率較為穩(wěn)定，維持在20%～40%之間（圖3）。硫酸新霉素、磺胺間甲氧嘧啶和復(fù)方新諾明三種藥物之間，以及恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素四種藥物之間，耐藥率無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 氣單胞菌的分離

本文采用16S rDNA 序列測(cè)定的方法，分離和鑒定了沿黃河養(yǎng)殖區(qū)鯉和斑點(diǎn)叉尾體內(nèi)的氣單胞菌。從分離數(shù)量來看，維氏氣單胞菌數(shù)量占80%，是目前魚類體內(nèi)的主要?dú)鈫伟愋?，這與已報(bào)道的其他地區(qū)的分離結(jié)果相類似，表明該菌是目前最流行的氣單胞菌[11]。維氏氣單胞菌是養(yǎng)殖水體中常見的條件致病菌，感染魚體致病后可以導(dǎo)致魚體出現(xiàn)體表出血、潰爛、鰭條腐爛、突眼、腹水等癥狀。魚體中維氏氣單胞菌的流行可能與養(yǎng)殖密度過高、過度投喂、水質(zhì)惡化等因素相關(guān)。以往對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原的分離調(diào)查，常常以發(fā)病水產(chǎn)動(dòng)物為主要研究對(duì)象，而發(fā)病以后再進(jìn)行病原鑒定和藥敏試驗(yàn)往往會(huì)花費(fèi)較多的時(shí)間，耽誤最佳的治療時(shí)機(jī)。本研究分析了正常養(yǎng)殖魚體中的氣單胞菌種類，證明最常見的是維氏氣單胞菌，這為平時(shí)做好有針對(duì)性的疾病預(yù)防和早期診斷治療提供了參考依據(jù)。

3.2 藥物敏感性變化分析

2020 年各菌株的MIC50結(jié)果顯示，氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素較為敏感，這與已報(bào)道的其他地區(qū)氣單胞菌的耐藥性結(jié)果相一致[12-14]。氟苯尼考的MIC50數(shù)值較低且年度變化不明顯，但MIC90明顯升高，說明氟苯尼考對(duì)一部分菌株仍然十分有效，但是，正在有越來越多的菌株對(duì)氟苯尼考有了耐藥性，耐藥率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示近兩年氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的耐藥率較前幾年有所上升，國(guó)內(nèi)其他地區(qū)也存在類似情況。例如北京地區(qū)魚源嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考也存在耐藥菌株，耐藥率約為15%[15]。MIC90數(shù)據(jù)和耐藥率結(jié)果顯示，很大一部分菌株也已經(jīng)對(duì)甲砜霉素產(chǎn)生了耐藥性。氣單胞菌對(duì)氟苯尼考和甲砜霉素耐藥性的增加，可能是這兩種藥物平時(shí)養(yǎng)殖中常用，選擇壓力導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥基因并進(jìn)行傳播擴(kuò)散。氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的年度變化表明，恩諾沙星的MIC50和MIC90一直比較穩(wěn)定，但數(shù)值偏高，因此氣單胞菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率也較高，在2018年出現(xiàn)了一個(gè)約50%的耐藥峰值；硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、甲砜霉素的殺菌效果會(huì)有浮動(dòng)變化，硫酸新霉素在2016—2018 年、鹽酸多西環(huán)素在2018 年，抑菌效果很差，這可能與當(dāng)年及之前年份較多的使用這兩種藥物有關(guān)，使細(xì)菌對(duì)這兩種藥物的耐藥性出現(xiàn)了一個(gè)明顯的升高。

本實(shí)驗(yàn)中大部分菌株對(duì)磺胺類藥物不敏感，氣單胞菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶和復(fù)方新諾明的敏感性較差，盡管近兩年對(duì)這兩類磺胺類藥物的耐藥率有所下降，但仍處于較高水平。北京、廣州等地的魚源氣單胞菌也對(duì)磺胺類藥物有很高的耐藥性[10,16]，這表明氣單胞菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥性存在普遍性，這可能與平時(shí)養(yǎng)殖中長(zhǎng)期大量使用磺胺類有關(guān)。

普查水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的耐藥性有利于掌握水產(chǎn)動(dòng)物致病菌對(duì)各種抗生素藥物敏感性的變化，根據(jù)致病菌的藥敏特性有針對(duì)性地用藥，避免濫用藥物，減少致病菌耐藥性的產(chǎn)生，有利于減少魚類體內(nèi)的藥物殘留，維持水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)健康發(fā)展。本研究能為河南省內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖者，特別是缺乏細(xì)菌藥敏檢測(cè)條件的養(yǎng)殖地區(qū)合理使用抗菌藥物提供參考，在選擇用藥時(shí)，恩諾沙星、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素等為首選抗菌藥物，盡量不要選擇磺胺類藥物。有檢測(cè)條件的地區(qū)還是應(yīng)該進(jìn)行細(xì)菌藥敏檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果再選擇合適的藥物，確保藥物的使用合理有效。

3.3 結(jié)論

河南省沿黃河水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)氣單胞菌耐藥率整體水平已經(jīng)較高，尤其是對(duì)磺胺類、甲砜霉素、氟苯尼考等常用藥物的耐藥性，已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治過程中需要重點(diǎn)注意的問題。應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌耐藥性檢測(cè)，指導(dǎo)養(yǎng)殖者用藥，倡導(dǎo)生態(tài)養(yǎng)殖，減少抗菌藥物的濫用和過度使用，保證科學(xué)合理的臨床用藥及水產(chǎn)品質(zhì)量安全。