英娜，王元，唐成婷，宋學(xué)峰，秦搏，吳艷慶，楊立國，朱建輝，房文紅

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.平邑縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 臨沂 273300；3.上海彰顯漁業(yè)專業(yè)合作社，上海 201700）

關(guān)鍵字：七彩神仙魚；卵母細胞；組織觀察；超微結(jié)構(gòu)觀察；卵膜

七彩神仙魚（Symphysodon aequifasciatus），隸屬于鱸形目（Perciformes）、慈鯛科（Cichlidae）、盤麗魚屬（Symphysodon），原產(chǎn)于南美洲的亞馬遜河流域。它色彩鮮艷、體態(tài)優(yōu)美而倍受觀賞魚愛好者的青睞，素有“觀賞魚之王”的美稱。目前七彩神仙魚在國內(nèi)雖已經(jīng)開展工廠化養(yǎng)殖，研究主要針對生長[1]、胚胎發(fā)育[2]、疾病防控[3,4]和養(yǎng)殖水質(zhì)變化[5]等，關(guān)于其性腺發(fā)育的研究鮮有報道。

卵巢、卵子的發(fā)育是動物繁殖的基礎(chǔ)，系統(tǒng)研究卵巢、卵子的發(fā)育結(jié)構(gòu)特征，對于判別卵子的發(fā)育狀態(tài)，提高七彩神仙魚的人工增養(yǎng)殖技術(shù)水平具有重要意義。本研究采用組織切片及透射電鏡技術(shù)，觀察養(yǎng)殖七彩神仙魚卵巢的發(fā)育，概括描述卵母細胞發(fā)育的大致過程及各時期的形態(tài)特點，旨在完善和豐富七彩神仙魚的研究內(nèi)容，并為其人工繁殖技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用30 尾1～2 齡雌七彩神仙魚，體長12.3～16.2 cm，體高15.1～17.3 cm，取自上海市青浦區(qū)一家養(yǎng)殖場內(nèi)（121.1°E，31.2°N），養(yǎng)殖水溫28～30℃。

1.2 方法

取出七彩神仙魚雌魚卵巢組織，參照常曉晴等[6]的方法固定，用石蠟包埋切片，Masson 染色，再用Olympus BX51 多功能顯微鏡觀察，Image-Pro Plus 5.1 軟件拍照，進行圖像采集，顯微測量卵母細胞及其核的大小。核質(zhì)比的計算公式如下：PN=Vn/（Vc-Vn），其中Vn 為核的體積，Vc 為細胞的體積，體積V=4/3πr3。

1.3 電鏡樣品制作與觀察

為觀察七彩神仙魚卵母細胞的超微結(jié)構(gòu)，參照林國輝等[7]的方法進行戊二醛固定，沖洗、脫水、包埋、定位、切片、染色等，最后將切片置于FEI-Tecnai12 型透射電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵母細胞的發(fā)育過程

根據(jù)卵母細胞生長特點、核仁數(shù)目、濾泡細胞、液泡形成、卵黃物質(zhì)的積累等將卵母細胞的發(fā)育分為六個時相：第Ⅰ時相的卵原細胞時期；第Ⅱ時相的濾泡細胞生成期；第Ⅲ時相的放射帶形成期；第Ⅳ時相的卵黃顆粒形成期；第Ⅴ時相的液泡大量生成期；第Ⅵ時相的成熟卵泡時期。卵母細胞卵徑、核徑、核質(zhì)比等信息參見表1。

表1 七彩神仙魚各時相卵母細胞的卵徑、核徑、核質(zhì)比及核仁數(shù)量Tab.1 Egg diameter,nuclear diameter,nucleocytoplasm ratio and nucleolus number of oocytes in brow discus Symphysodon aequifasciatus at various phases

第Ⅰ時相：卵原細胞由卵巢生殖上皮細胞分裂而來，形態(tài)不一，多呈梨形或橢圓形，直徑29.8～77.9 μm,細胞核為圓形，染色質(zhì)為絲網(wǎng)狀，細胞質(zhì)中顆粒分布均勻，染為深紅色，呈強嗜酸性（圖1-a）；第Ⅱ時相：卵母細胞生長速度加快，直徑可達125.4 μm，細胞質(zhì)隨細胞體積增大，染色變淺，但整體染色均勻。細胞核呈圓形，核仁由第Ⅰ時相的均勻分散于核內(nèi)，轉(zhuǎn)為沿核膜內(nèi)表面附著，同一卵巢切面內(nèi)的核仁數(shù)6～11 個。卵母細胞外表面出現(xiàn)單層濾泡細胞，緊貼卵母細胞表面（圖1-b～c）。第Ⅲ時相為大生長時期的卵母細胞，體積繼續(xù)增加，直徑145.6～282.5 μm。核膜出現(xiàn)波紋狀內(nèi)折，濾泡細胞與卵膜之間逐漸形成放射帶（圖1-d）。第Ⅳ時相：卵母細胞體積由于胞內(nèi)物質(zhì)的快速合成而繼續(xù)增長，細胞質(zhì)中沿質(zhì)膜出現(xiàn)染色較深的卵黃顆粒，并由質(zhì)膜向核膜方向增多，卵母細胞外側(cè)濾泡細胞數(shù)量繼續(xù)增多，核膜逐漸溶解，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)零散液泡。第Ⅴ時相的卵母細胞生長速度減緩。核膜溶解，核仁完全消失，卵黃顆粒幾乎充滿整個卵母細胞，液泡數(shù)量迅速增多，沿卵膜分布；卵母細胞外側(cè)濾泡細胞增至2～3 層，卵母細胞與濾泡細胞之間的放射帶明顯增厚（圖1-f）。第Ⅵ時相卵母細胞發(fā)育為成熟卵泡，細胞體積增加至最大值，直徑最高可達354.1 μm（圖1-g～h），卵泡細胞內(nèi)外物質(zhì)積累豐富，為隨時排卵做準備。液泡數(shù)量繼續(xù)增多，胞內(nèi)卵黃顆粒大量增加而被擠至胞膜內(nèi)緣，形成皮質(zhì)液泡層，此液泡層不斷擴展。排卵后的卵母細胞，由于卵黃顆粒被吸收而形成許多空泡（圖1-g～h），直至卵母細胞內(nèi)的卵黃顆粒被完全吸收（圖1-i）。

圖1 卵母細胞發(fā)育的組織學(xué)觀察Fig.1 Histological observation of oocyte development phases

2.2 放射帶的形成與卵膜的變化

由組織切片可觀察到，放射帶形成于濾泡細胞層之后。電鏡切片觀察發(fā)現(xiàn)（圖2），第Ⅲ時相之前的卵母細胞沒有放射帶（圖2-a），此時期的細胞質(zhì)電子密度較大，染色較深，卵膜結(jié)構(gòu)簡單。在第Ⅲ時相之后，隨著卵母細胞外濾泡細胞數(shù)量的增多，互相之間的物質(zhì)交換頻繁，逐漸出現(xiàn)了放射帶結(jié)構(gòu)（圖2-b），卵母細胞內(nèi)開始出現(xiàn)卵黃顆粒積累，胞膜處由于物質(zhì)交換形成液泡（圖2-c）。隨著卵母細胞的發(fā)育，放射帶的厚度逐漸增加（圖2-d），第Ⅲ時相的放射帶剛剛形成（←），厚度約1.2～1.9 μm，而第Ⅳ時相的放射帶（→）厚度為2.1～3.5 μm，此時放射帶由濾泡細胞突起的分泌物質(zhì)及卵母細胞膜上管道運輸?shù)奈镔|(zhì)形成，大量的物質(zhì)運輸為卵母細胞內(nèi)卵黃物質(zhì)的形成做準備。第Ⅳ時相以后的卵母細胞，濾泡細胞含有分泌顆粒而被稱為顆粒細胞（Gc）（圖2-f），自內(nèi)向外依次為放射帶、顆粒細胞和基層（Bi）。

圖2 卵膜放射帶結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)觀察Fig.2 Ultrastructural observation of oocyte envelop and zone radiate

3 討論

3.1 產(chǎn)卵類型

根據(jù)卵巢內(nèi)卵母細胞的發(fā)育，可將魚類分為同步產(chǎn)卵型或非同步分批產(chǎn)卵型[8]。非同步型產(chǎn)卵魚類的卵巢內(nèi)可同時存在Ⅰ-Ⅳ期不同發(fā)育階段的卵母細胞。人工養(yǎng)殖的雌七彩神仙魚一般9 個月以上才可達性成熟。養(yǎng)殖條件適宜時每尾魚每個月可產(chǎn)卵1～2 次，每次產(chǎn)卵數(shù)約150～300 粒，可連續(xù)產(chǎn)兩年。組織切片觀察可見，本研究中的七彩神仙魚的卵巢內(nèi)同時具有多個不同發(fā)育時期的卵母細胞：同一時期的卵巢內(nèi)，既有已經(jīng)產(chǎn)卵的空卵泡，卵黃物質(zhì)積累時期的Ⅳ、Ⅴ時相的卵母細胞，也有放射帶形成期的Ⅱ、Ⅲ時相卵母細胞。不均等發(fā)育的卵母細胞形成非同步型連續(xù)型產(chǎn)卵，這與甌江光唇魚（Acrossocheilus fasciatus）[9]相似。

3.2 卵母細胞的發(fā)育

根據(jù)七彩神仙魚卵母細胞的發(fā)育特點，可將其分為六個時相，經(jīng)歷了小生長期、大生長期與成熟期，這與大多數(shù)鱸形目的魚類相似。第Ⅰ和Ⅱ時相的卵母細胞，細胞開始生長，體積逐漸增大，但是，此時的細胞生長不是最快，從卵徑的數(shù)值可以看出，處于小生長時期。與銀鯧（Pampus argenteus）、花（Hemibarbus maculatus Bleeker）相似[10]。七彩神仙魚的濾泡細胞也是第Ⅱ時相開始形成。從第Ⅲ時相開始，細胞進入大生長時期，細胞體積快速增長，核質(zhì)比明顯降低，在第Ⅲ時相開始出現(xiàn)卵黃顆粒、液泡。

卵黃物質(zhì)是受精卵早期發(fā)育的主要營養(yǎng)物質(zhì)。它由肝臟產(chǎn)生的卵黃蛋白原經(jīng)血液運輸至卵母細胞轉(zhuǎn)化而來[8]。卵黃物質(zhì)最先出現(xiàn)于質(zhì)膜附近，然后慢慢積累至細胞質(zhì)整個區(qū)域。在大生長時期，卵黃物質(zhì)的迅速積累也是細胞體積生長的主要原因。

液泡并不是空泡（又稱卵黃泡），是電子致密度較低的絮狀物[7]。大多數(shù)關(guān)于卵母細胞發(fā)育的研究中，描述液泡的很少，僅練青平等[9]關(guān)于甌江光唇魚的研究中描述較為詳細：第Ⅱ時相早期的液泡僅一層，大小不一，逐漸增加至多層，并由胞質(zhì)邊緣向中央擴展，直至第Ⅱ時相晚期，液泡幾乎充滿細胞質(zhì)。這一點與七彩神仙魚非常相似。最開始大小不一的液泡，隨著胞內(nèi)卵黃物質(zhì)的積累，被擠至胞質(zhì)邊緣，逐漸積累至多層，最后將胞質(zhì)與胞膜隔開。所不同的是，本研究中的液泡最早見于第Ⅲ時相早期。第Ⅴ、Ⅵ時相是卵母細胞成熟期，此時的細胞體積生長有所緩慢，但是，胞內(nèi)外物質(zhì)變化依然明顯，卵黃物質(zhì)充滿整個胞質(zhì)為隨時排卵準備。而在排卵之后，胞內(nèi)的卵黃物質(zhì)逐漸被卵子吸收，慢慢變成“空泡”。

3.3 卵膜的結(jié)構(gòu)與發(fā)育

卵膜是指卵膜細胞發(fā)育過程中附著于細胞表面的非原生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)。不同硬骨魚類的卵膜成分命名不一：例如施氏鱘（Acipenser schrenckii）[11]的卵膜（由外向內(nèi)）稱為：膠膜層、卵黃外膜及卵黃內(nèi)膜，而膜與膜之間相互作用形成的縱向管道和微管被稱為放射帶。鱖的卵膜[7]由鞘膜層、放射帶及卵黃膜層組成。鲇（Silurusasotus linnaeus）卵膜成分則是透明帶及卵母細胞形成的內(nèi)、外放射帶。雖然命名不同，但是組成結(jié)構(gòu)十分相似，主要是卵母細胞自身分泌及與濾泡細胞相互作用形成的區(qū)域結(jié)構(gòu)，主要的功能就是為卵母細胞內(nèi)卵黃物質(zhì)的積累提供物質(zhì)交換。

七彩神仙魚的早期卵母細胞表面結(jié)構(gòu)相對簡單，在第Ⅱ時相細胞表面出現(xiàn)零散濾泡細胞，但是，此時胞膜與濾泡細胞層結(jié)合緊密。在第Ⅲ時相，卵母細胞表面單層鋪滿濾泡細胞，局部出現(xiàn)雙層。透射電鏡下可觀察到，質(zhì)膜與濾泡細胞之間出現(xiàn)由膜縱向管道與膜突起形成微管結(jié)構(gòu)組成的放射區(qū)域，這一點在花[12]、鱖（Siniperca chuatsi）[7]、鲇[13]的研究中也有相同的描述。隨著胞內(nèi)卵黃物質(zhì)合成（第Ⅳ時相以后）的需要，濾泡細胞增加至兩層，分別為內(nèi)層的含分泌顆粒的顆粒細胞及長而扁平的外層濾泡細胞，兩者之間由膠原纖維組成的基層（Bi），放射帶厚度也在此時迅速增長。直至第Ⅵ時相，卵細胞內(nèi)卵黃物質(zhì)合成結(jié)束后，細胞成熟，從濾泡膜脫離，放射帶結(jié)構(gòu)消失。放射帶的這一變化與斑馬魚（Danio rerio）[14]、施氏鱘（A.schrenckii）[11]、哲羅魚（Hucho taimen）[15]、黑鱾（Girella leonina）[16]和錦江翹嘴鲌（Culter alburnus）[17]等魚相似。