張瑞，羅亮，王世會，郭坤，徐偉，趙志剛

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

以松嫩平原鹽堿地為代表的東北地區(qū)鹽堿地是世界三大著名的碳酸鹽型鹽堿地之一。該地區(qū)的鹽堿水域以高pH（≥8.5）、高堿度（20～30 mmol/L HCO3-）、低鹽度（1‰～3‰ Na+）為特點(diǎn)，難以進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖。高pH 的水質(zhì)不僅直接影響水產(chǎn)動物健康生長[1]，還會導(dǎo)致水體中氨氮的毒性升高，增加對水產(chǎn)動物的危害[2,3]。因此，通過水質(zhì)調(diào)控有效改善鹽堿水質(zhì)環(huán)境，成為開發(fā)與利用鹽堿水域，推動鹽堿水漁業(yè)綠色發(fā)展的主要途徑之一。一直以來，微生物水質(zhì)調(diào)控技術(shù)因其高效、綠色、安全的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[4-6]，而“原位”功能性微生物的篩選和應(yīng)用，是實(shí)現(xiàn)微生物水質(zhì)調(diào)控的重要途徑[7]。

長期以來，國內(nèi)外學(xué)者多以高鹽濃度耐受為關(guān)注點(diǎn)，針對海水、鹽湖、鹽堿地等不同鹽堿環(huán)境開展了大量耐（嗜）鹽堿菌的多樣性分析工作[8-14]，分離鑒定了大量中度嗜鹽菌、輕度嗜鹽菌等具有重要研究價(jià)值的高鹽（堿）耐受菌株[8-14]，并在2.5%（w/v）甚至更高的鹽（NaCl）濃度下分析菌株的耐堿能力[9,12]。值得注意的是，微生物要在強(qiáng)堿性條件下生長，就必需調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞內(nèi)pH 范圍以滿足其生命活動的需要。而通過細(xì)胞膜上的Na+/H+、K+/H+等逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在Na+等的跨膜運(yùn)輸?shù)耐瑫r(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH，是耐（嗜）堿菌最主要的抗逆途徑之一[15]。因此環(huán)境中鹽濃度在很大程度上影響著菌株的耐堿能力。

迄今，尚未有以低鹽度、高pH 為篩選條件，針對碳酸鹽型鹽堿水環(huán)境特點(diǎn)進(jìn)行的耐（嗜）堿微生物篩選及多樣性分析的報(bào)道，也缺少菌株在低鹽濃度下耐堿能力的分析。本研究對大慶連環(huán)湖——典型碳酸鹽型鹽堿地區(qū)池塘水體和底泥中的耐（嗜）堿微生物進(jìn)行篩選分離、鑒定分類，分析其低鹽度下耐堿能力及pH 調(diào)節(jié)功能，為以“原位”功能微生物為核心的原位水質(zhì)調(diào)控技術(shù)提供微生物資源保障，為碳酸鹽型鹽堿漁業(yè)的綠色發(fā)展提供支撐。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基及儀器試劑

富集培養(yǎng)基（3% Sehgal-Gibbons）：胰蛋白胨5 g，酵母粉10 g，酸水解酪蛋白5 g，檸檬酸三鈉3 g，KCl2 g，MgSO4·7H2O20 g，NaCl30 g，加水定容至1 000 mL，用NaOH 調(diào)pH 至8.0，滅菌備用。

篩選培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，加水定容至1 000 mL，用NaOH調(diào)pH 至8.5，滅菌備用。

耐堿上限測試培養(yǎng)基：液體LB 培養(yǎng)基，用NaOH 調(diào)至不同pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12），滅菌備用。

pH 調(diào)節(jié)能力測試培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉5 g，蛋白胨5 g，NaCl 50 g，配置固體培養(yǎng)基時(shí)額外加入瓊脂15 g，加水定容至1 000 mL，用NaOH 調(diào)pH 至7.0，滅菌備用。

PCR 儀購自Bio-Rad 公司；凝膠成像分析儀購自Bio-Rad 公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱購自滄州萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司（ZQPL-200）；生化培養(yǎng)箱購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司（SPX-100B-Z）；紫外分光光度計(jì)購自上海佑科儀器儀表有限公司（752N）；便攜式pH 計(jì)購自上海沛瑞儀器有限公司（PH400）；通用引物由北京華大基因研究院合成；PCR 預(yù)混合溶液購自上海圣生物科技有限公司。

1.2 樣品采集

2020 年6 月，從大慶連環(huán)湖地區(qū)的9 口養(yǎng)殖池塘中隨機(jī)采集水樣（嫩江水水源）與底泥樣（距離水底0～10 cm）共12 份，分別裝入無菌三角瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行菌株富集與分離。

1.3 菌株富集與分離

將各采集樣品混合均勻，稱取3 g（3 mL）置于200 mL 富集培養(yǎng)基中，30℃150 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 d 后，將富集的菌懸液在無菌水中逐級稀釋至10-4、10-5、10-6和10-7倍，然后取各稀釋度的菌懸液0.1 mL 分別涂布于pH 8.5 的篩選培養(yǎng)基平板上，在30℃靜置培養(yǎng)。3～5 d 后，挑取單菌落進(jìn)行多次劃線純化。最后根據(jù)菌落形態(tài)、顏色以及顯微形態(tài)等表型特征鑒定為純培養(yǎng)后，將純培養(yǎng)菌液保藏于-80℃。

1.4 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用菌液PCR 法擴(kuò)增純培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA基因序列。擴(kuò)增引物采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 的通用引物Eubac27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和Eubac1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’）。PCR 以過夜培養(yǎng)菌液為模板，反應(yīng)體系參照2×Hieff PCR Master Mix 使用說明書配置。反應(yīng)程序：95℃10 min；94℃l min，55℃30 s，72℃1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送北京華大基因研究院測序，測序引物與擴(kuò)增引物相同。

測序所得序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲取序列號（Accession number）。采用Nucleotide Blast 在線分析，找出各序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中同源性最高的已鑒定菌株序列，用MEGA 6.0 中的Clustal X 程序進(jìn)行多序列比對，然后用Neighbor-Joining 方法選擇Bootstrap 為1 000 個(gè)重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進(jìn)化樹。

1.5 菌株耐堿上限測試

所有待試菌株經(jīng)LB（pH 7.0）培養(yǎng)基過夜活化后，分別按1%接種量接種于不同pH 培養(yǎng)基中，在30℃150 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h 后觀察生長情況。

1.6 菌株pH 調(diào)節(jié)能力驗(yàn)證

所有待試菌株經(jīng)活化后，分別按1%接種量接種于200 mL 培養(yǎng)基中驗(yàn)證pH 調(diào)節(jié)能力，培養(yǎng)液于30℃150 r·min-1震蕩培養(yǎng)，每隔4 h 取20 mL 培養(yǎng)菌液測定pH 與OD600吸光度，直至24 h 結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與分離

從本次采集的12 份樣品中共篩選出純培養(yǎng)菌株49 株，經(jīng)16S rRNA 基因序列鑒定，最終共確定菌株24 株。它們分屬于氣單胞菌屬（Aeromonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、動性球菌屬（Planococcus）以及假單胞菌屬（Pseudomonas）共9 個(gè)菌屬。其中芽孢桿菌屬與微小桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，分別為7 株與6 株，占總菌株量的29.17%和25.00%（圖1）。其次是動性球菌屬（Planococcus）3 株，占總菌株量的12.50%；腸球菌屬與腸桿菌屬各2 株，分別占8.33%；氣單胞菌屬、鹽單胞菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬以及假單胞菌屬各1 株，分別占菌株總量的4.17%。

2.2 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

用DNAMAN6.0 軟件分別比對分析上述24 株菌的16S rRNA 基因序列及其已鑒定的最近緣種菌株的同源性。結(jié)果表明：CT-WN-B17 與已鑒定的最近緣種菌株同源性為96.35%，CT-MH6-7 與已鑒定的最近緣種菌株同源性為96.84%，而其余同源性均在99.58%～100%之間。碳酸鹽型池塘耐（嗜）堿菌菌群中所有菌株與已鑒定近緣菌株在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上也穩(wěn)定聚簇（圖2）。上述結(jié)果支持將除CTWN-B17、CT-MH6-7 以外的22 株菌株認(rèn)定為各自相應(yīng)的已鑒定最近緣種，而菌株CT-WN-B17 和CT-MH6-7 的16S rRNA 序列與已鑒定最近緣種同源性較低，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，具有新種潛質(zhì)，需進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，因而暫將它們分別命名為Lysinibacillus sp.與Enterococcus sp.（表1）。

圖2 東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘中耐（嗜）堿細(xì)菌群落的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor -Joining tree of alkalitolerant（alkaliphilic）bacteria in carbonate saline-alkali ponds in northeast China

2.3 耐堿上限測定

以上24 株菌株分屬于細(xì)菌域的2 個(gè)門——變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）；9個(gè)屬——?dú)鈫伟鷮?、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、微小桿菌屬、鹽單胞菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、動性球菌屬以及假單胞菌屬。其中厚壁菌門為優(yōu)勢類群，菌株占比達(dá)79.17%；芽孢桿菌屬與微小桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，菌株占比分別為29.17%和25.00%。

以上24 株菌株在1%NaCl 濃度下的耐堿上限在pH 9.0～10.0 之間，其中7 株能耐受pH9.0，芽孢桿菌屬為最優(yōu)勢菌屬（4/7）；10 株能耐受pH9.5，其中芽孢桿菌屬為最優(yōu)勢菌屬（3/10）；7 株能耐受pH10.0，其中微小桿菌屬為最優(yōu)勢菌屬（4/7）（表1）。上述所有菌株并未表現(xiàn)出對堿性pH 的生長依賴性，均屬于耐堿菌。

表1 東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘中的耐（嗜）堿細(xì)菌及其耐堿能力分析Tab.1 Alkalitolerant（alkaliphilic）bacteria and their alkaline-tolerance capacity in carbonate saline-alkali ponds in northeast China

2.4 pH 調(diào)節(jié)能力測定

碳酸鹽型鹽堿池塘耐堿細(xì)菌群落中有兩大優(yōu)勢菌屬，分別為芽孢桿菌屬和微小桿菌屬。后者的功能之一就是可以利用葡萄糖等碳源產(chǎn)酸[16]，導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境的pH 下調(diào)。為探究鹽堿池塘中優(yōu)勢菌群菌株，即芽孢桿菌屬與微小桿菌屬菌株的pH 調(diào)節(jié)能力，以葡萄糖為補(bǔ)充碳源培養(yǎng)菌株，測定隨菌株繁殖的培養(yǎng)基pH 的變化。

隨24 h 內(nèi)微小桿菌屬菌株的不斷生長繁殖，菌株CT-WL4-1 將培養(yǎng)基pH 下調(diào)了2.5 個(gè)單位（圖3-A）；盡管菌株CT-WH4-6 最終的繁殖水平與CT-WL4-1 相差無幾，但僅將培養(yǎng)基pH 下調(diào)了0.6個(gè)單位（圖3-B）；菌株CT-SL8-1、CT-WH2-6、CT-ML6-1 和CT-ML6-5 繁殖不十分旺盛（OD600≤1.0），24 h 內(nèi)培養(yǎng)基pH 下調(diào)了1.3～1.5 個(gè)單位（圖3-C～F）。

圖3 東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘微小桿菌屬細(xì)菌的pH 調(diào)節(jié)能力Fig.3 pH regulation of Exiguobacterium strains in carbonate saline-alkali ponds in northeast China

芽孢桿菌屬菌株也具有不同程度調(diào)節(jié)pH 的能力。如圖4 所示，菌株CT-WN-B4、CT-WL5-10 在24 h 內(nèi)繁殖旺盛，分別使培養(yǎng)基pH 下調(diào)了1.1 和1.3 個(gè)單位（圖4-A、B）；菌株CT-WH4-5、CT-WN-B12 在實(shí)驗(yàn)條件下生長較為微弱，均僅將培養(yǎng)基pH 下調(diào)了不足1 個(gè)單位（圖4-C、D）；菌株CT-SL8-3、CT-WN-B3 和CT-WN-B8 的繁殖并不十分旺盛（OD600≤1.1），在24 h 內(nèi)將培養(yǎng)基pH 分別下調(diào)了1.8、1.9 和1.2 個(gè)單位（圖4-E～G）。上述結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，已篩選鑒定的6 株微小桿菌屬菌株與7 株芽孢桿菌屬菌株中，微小桿菌屬菌株CT-WL4-1 具有最強(qiáng)的pH 調(diào)節(jié)能力，芽孢桿菌屬菌株CT-SL8-3 和CT-WN-B3 次之。

圖4 東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘中芽孢桿菌屬細(xì)菌的pH 調(diào)節(jié)能力Fig.4 pH regulation of Bacillus strains in carbonate saline-alkali ponds in northeast China

3 討論

本研究以高pH、低鹽度為條件從典型碳酸鹽型鹽堿池塘水體和底泥樣品中定向富集、篩選耐（嗜）堿菌，通過16S rRNA 基因同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析進(jìn)行菌株鑒定分類，獲取耐（嗜）堿菌多樣性信息。結(jié)果表明，東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘中耐堿菌種群豐富，共分離到的49 個(gè)菌株，分屬于細(xì)菌域中2 個(gè)門（Firmicutes、Proteobacteria）、9 個(gè)屬、24 個(gè)種。其中多數(shù)菌株屬于厚壁菌門（Firmicutes），兩個(gè)優(yōu)勢屬分別為芽孢桿菌屬（7 株，占總菌株的29.17%）和微小桿菌屬（6 株，占總菌株的25%）。絕大多數(shù)菌株的16S rRNA 基因序列與已鑒定的最近緣種序列同源性在99.58%～100%之間。僅腸球菌屬菌株CT-MH6-7 與賴氨酸芽孢桿菌屬菌株CT-WN-B17 的16S rRNA 序列與已鑒定的最近緣種菌株同源性較低，分別為96.35%、96.84%，且系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，認(rèn)為其具有新種潛質(zhì)。

多年來，科研工作者圍繞多個(gè)鹽堿環(huán)境開展了耐（嗜）鹽菌的多樣性研究，已在碳酸鹽型鹽堿土壤中篩選鑒定出34 株耐（嗜）鹽菌。這些菌株大多具有5%～10%的耐鹽能力和不同程度的耐堿能力[9]。與之相比，本研究獲得的碳酸鹽型鹽堿池塘耐堿菌多樣性并不十分豐富。比較二者菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其均包含芽孢桿菌屬、微小桿菌屬、鹽單胞菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬和動性球菌屬（Planococcus），這表明上述6 個(gè)菌屬的菌株在碳酸鹽型鹽堿土壤中和水體中均有分布。不同的是，土壤中的最優(yōu)勢菌屬葡萄球菌屬（Staphylococcus）并不包含在池塘樣品中，而鹽堿池塘中的優(yōu)勢菌屬微小桿菌屬（Exiguobacterium），在土壤僅分離到1 株。這似乎并不是由菌株篩選條件所致。根據(jù)現(xiàn)有研究背景，微小桿菌屬菌株可以耐受0%～10%濃度的NaCl[16]，即采用耐（嗜）鹽菌的篩選條件也可將其分離出，相似的耐（嗜）堿菌的篩選條件也可將葡萄球菌屬菌株分離出來。因此，可以認(rèn)為兩群落結(jié)構(gòu)的差異是由不同菌屬微生物對生存環(huán)境的偏好性選擇導(dǎo)致。微小桿菌屬曾因并未在其他鹽堿環(huán)境中被篩選得到而被認(rèn)為是屬于東北地區(qū)松嫩平原鹽堿土壤的獨(dú)特耐鹽菌群類[9]，因此建議，微小桿菌屬可作為東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿水體環(huán)境的代表性耐鹽堿菌屬。

一直以來對于耐堿菌與嗜堿菌的定義并不明確和統(tǒng)一。本研究根據(jù)眾多科研工作者的分類習(xí)慣，將能在高pH 條件下生長，但最適值并不在堿性pH 范圍內(nèi)的歸類為耐堿菌；而最適生長pH 在9.0以上，pH 耐受高達(dá)10～12 的則稱之為嗜堿微生物[17]。本研究獲得的所有菌株并未表現(xiàn)出堿性條件的生長依賴性，pH 耐受上限介于9.0～10.0 之間，屬于耐堿菌。本結(jié)果顯然低于一些現(xiàn)有的研究背景[9,18-20]，這是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)條件中更低的鹽濃度影響了菌株的耐堿能力上限。但本研究的結(jié)果更接近菌源環(huán)境的實(shí)際條件，更有菌株的原位應(yīng)用指導(dǎo)意義。

菌群中優(yōu)勢的、且更強(qiáng)耐堿能力的微小桿菌屬菌株，其另一重要功能就是可以利用葡萄糖等碳源產(chǎn)酸[16]。本研究以葡萄糖為補(bǔ)充碳源，以pH 調(diào)節(jié)能力為目標(biāo)，在兩大優(yōu)勢菌屬中篩選出3 株具有較強(qiáng)pH 調(diào)節(jié)能力的耐堿菌（包括1 株微小桿菌屬菌株，2 株芽孢桿菌屬菌株），能夠在24 h 內(nèi)將培養(yǎng)基pH下調(diào)1.8～2.5 個(gè)單位，具有微生物水質(zhì)調(diào)控應(yīng)用潛力。然而這些菌株是否通過利用葡萄糖合成有機(jī)酸來調(diào)節(jié)pH；有些菌株是否也可以利用其他碳源產(chǎn)酸來調(diào)節(jié)pH，這些問題均需進(jìn)一步驗(yàn)證與探究。

本研究填補(bǔ)了我國東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿水土環(huán)境——鹽堿池塘的耐堿菌多樣性的研究空白，在優(yōu)勢菌屬中篩選出了具有較強(qiáng)pH 調(diào)節(jié)能力的耐堿菌株，為碳酸鹽型鹽堿養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控技術(shù)的研發(fā)提供支撐。